Deze video toont een protocol voor het uitvoeren van elektrofysiologische opnames van enkele vezels op een in vitro muis colorectum-zenuwpreparaat.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vitro functionele karakterisering van de Muis Colorectale Afferent Endings
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze video toont in detail een in vitro single-fiber elektrofysiologische opname protocol met behulp van een muis colorectum-zenuw voorbereiding. De aanpak maakt het mogelijk onpartijdige identificatie en functionele karakterisatie van individuele colorectale afferenten. Extracellulaire opnames van gekweekte actiepotentialen (AP's) die afkomstig zijn van één of enkele afferente (dwz één vezel) receptieve velden (RFs) in de dikke darm zijn gemaakt van geplaagd zenuwvezel bundels. De dikke darm is verwijderd met ofwel het bekken (PN) of lumbale splanchnisch (LSN) zenuw bevestigd en lengterichting geopend. Het weefsel wordt in een opname kamer, vastgemaakt vlak en geperfuseerd met geoxygeneerde Krebs oplossing. Focal elektrische stimulatie wordt gebruikt om de colorectale afferente uitgangen, die verder worden getest door drie verschillende mechanische stimuli lokaliseren (blunt sonderen, mucosale strelen en omtrek rek) functioneel categoriseren afferente in vijf mechanosensitieve klassen. Endings reageren op geen van deze mechanische stimuli zijn gecategoriseerd als mechanisch-ongevoelige afferentia (MIA). Zowel mechanosensitieve en MIA kan worden beoordeeld sensibilisatie (bijv verbeterde respons, verminderde drempel en / of verwerving van mechanische gevoeligheid) van plaatselijke blootstelling van RFs voor chemicaliën (bijvoorbeeld inflammatoire soep (IS), capsaïcine, adenosine trifosfaat (ATP)). We beschrijven de apparatuur en de dikke darm-zenuw opname voorbereiding, de oogst van colorectum met aangehechte PN of LSN, identificatie van RFs in de dikke darm, single-fiber opname van zenuw bundels, en gelokaliseerde toepassing van chemicaliën om de RF. Bovendien worden problemen van het preparaat en gestandaardiseerde mechanische stimulatie besproken.
Inleiding
Pijn en overgevoeligheid zijn de belangrijkste klachten van patiënten met functionele gastro-intestinale aandoeningen, waaronder prikkelbare darmsyndroom (IBS), die bestaan geen zichtbare pathobiological oorzaak of weefselschade. Bijvoorbeeld, IBS-patiënten vertonen overgevoeligheid, waaronder verhoogde respons op rectale ballondilatatie en verhoogde gevoeligheid tijdens normale darmfunctie, evenals overgevoeligheid somatische verwijzing (dwz tederheid palpatie van de buik) 1. Omdat targeting colorectale afferentia heeft bewezen effectief bij het verlichten van pijn en overgevoeligheid bij IBS-patiënten (bijvoorbeeld intra-rectale ins....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Dit protocol werd beoordeeld en door de Universiteit van Pittsburgh Institutional Animal Care en gebruik goedgekeurd.
1. Voorbereiding van de Modified Krebs Solution en Test van de Drug Hoeveelheden
- Voeg 6 l gemodificeerde Krebs oplossing die bevat (in mM): NaCl 117,9, KCl 4,7, 25 NaHCO3 1.3 NaH 2PO 4, 1,2 MgSO4, 2,5 CaCl2, 11,1 D-glucose, 2 natrium butyraat, 20 natriumacetaat , 0,004 nifedipine (spontane spiersamentrekkingen te blokkeren), en 0,003 indomethacine (tot synthese van endogene prostaglandines te blokkeren). Gebruik ijskoud en warm Krebs oplossingen voor weefsel....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De opstelling wordt in figuur 1. Het omvat een op maat gemaakte weefsel kamer die de dikke darm in een siliconen beklede bad compartiment en de bijgevoegde zenuw in een aangrenzende minerale olie gevulde compartiment herbergt. De twee compartimenten kamer werd gefreesd uit een massief blok van acrylaat met een CNC machine; de onderkant van beide compartimenten werd vervolgens bekleed met stevige siliconen om eenvoudig pin naar beneden van het colorectaal weefsel mogelijk te maken. Extracellulaire AP'.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De in vitro colorectum zenuw bereiding beschreven blijkt een krachtige aanpak om neurale codering functies van individuele colorectale afferenten, die mooi aanvulling andere niet-functionele benaderingen (bijvoorbeeld cellulaire, moleculaire en histologische studies) op viscerale sensorische neuronen (bestuderen zie beoordeling 27 voor details). Neuronale mechanismen die bijdragen aan nociceptie en langdurige colorectale overgevoeligheid zijn geopenbaard en farmacologische manipulaties zijn .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Ondersteund door NIH-subsidie R01 DK093525 (GFG). We waarderen de wetenschappelijke beoordeling en grammaticale bewerking van het manuscript door Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) zeer en danken Michael Burcham voor de hulp bij het voorbereiden van de figuren.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Leica MZ16 stereomicroscoop | Leica Microsystems Inc. | ||
| Leica IC D camera | Leica Microsystems Inc. | ||
| Versterker | World Precision instruments, Inc. | SYS-DAM80 | Low-noise differentiële versterker |
| Weefselkamer met twee compartimenten | Op maat gemaakt | ||
| Power1401 | Cambridge Electronic Design Limited | Power1401 | Data-acquisitie, analoog signaal invoer/uitvoer |
| Spike2 v5.02 | Cambridge Electronic Design Limited | Softwarepakket dat werkt met de Power1401 | |
| Audio monitor | Natus | Am 8 | |
| Vierkante pulsstimulator | Natus | S48 | Voor het afgeven van elektrische stimuli |
| Foto-elektrische isolatie-eenheid | Natus | PSIU6 | Stimulusisolatie om ruis te verminderen |
| Concentrische bipolaire micro-elektrode | FHC Inc. | CBFFG75 | Voor het afgeven van elektrische stimuli |
| Dual-mode hefboomsysteem | Aurora Scientific Inc. | Serie 300C | Voor het afgeven van mechanische stimuli |
| Pincet | Fine Science Tools | 11252-00 | Pincet met fijne uiteinden |
Referenties
- Naliboff, B. D., et al. Evidence for two distinct perceptual alterations in irritable bowel syndrome. Gut. 41, 505-512 (1997).
- Verne, G. N., Robinson, M. E., Vase, L., Price, D. D. Reversal of visceral and cutaneous hyperalgesia....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Meer artikelen verkennen
