A propagação de agregados proteicos semelhante ao príon surgiu recentemente como implicada em muitas doenças neurodegenerativas. O objetivo deste protocolo é descrever como usar o nematóide C. elegans como um sistema modelo para monitorar a disseminação de proteínas e investigar fenômenos semelhantes a príons.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Prions são partículas proteicas não convencionais de autopropagação, desprovidas de qualquer ácido nucleico codificador. Essas sementes proteicas servem como modelos para a conversão e replicação de sua isoforma celular benigna. Evidências acumuladas sugerem que muitos agregados de proteínas podem atuar como modelos de autopropagação e corromper o dobramento de proteínas cognatas. Embora os agregados possam ser funcionais sob certas circunstâncias, esse processo geralmente leva à interrupção da homeostase da proteína celular (proteostase), levando a doenças devastadoras, como doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson (DP), esclerose lateral amiotrófica (ELA) ou encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs). Os mecanismos exatos de propagação de príons e disseminação célula a célula de agregados proteicos ainda são objetos de intensa investigação. Para aprofundar esse conhecimento, recentemente foi estabelecido um novo modelo de metazoário em Caenorhabditis elegans, para expressão do domínio príon da proteína príon de levedura citosólica Sup35. Este modelo de príon oferece várias vantagens, pois permite o monitoramento direto do domínio do príon marcado com fluorescência em animais vivos e facilidade de abordagens genéticas. Aqui são descritos métodos para estudar o comportamento semelhante ao príon de agregados de proteínas e para identificar modificadores de toxicidade induzida por príons usando C. elegans.
Introdução
Muitas doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson (DP), a esclerose lateral amiotrófica (ELA), e encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET), estão associados a proteínas de agregação propensas e são, portanto, conhecidos coletivamente como proteína misfolding transtornos (EPM ). EET ou doenças provocadas por priões constituem uma classe única de EPM em que eles podem ser infecciosas em seres humanos e animais 1. A nível molecular, prions replicar recrutando e convertendo monomérica α-hélice-rico codificado-host PrP celular (PrP C) para o patológico β-folha-rico conformação PrP Sc 2,3. Agreg....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Monitoramento transcelular Espalhando de proteínas príon-like por In Vivo tempo-lapso
NOTA: Crescer C. elegans do tipo selvagem (WT) (N2) e linhas transgénicas de acordo com métodos padrão e controlar cuidadosamente a temperatura de cultivo 47.
- Gerar linhagens transgênicas de C. elegans que expressa a proteína prion-like, marcado com proteína fluorescente vermelha monomérica (MRFP). Assista a este vídeo que demonstra como usar a microinjeção 48. Para mais detalhes e métodos que descrevem como integrar estas linhas extracromossómicos, consulte 49.
- Prepare p....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Monitoramento intercelular difusão de proteínas príon-like in vivo por time-lapse imaging
Transgênicos C. linhas elegans que expressam o domínio prião são particularmente bem adaptados para a análise de certos aspectos de proteínas priões do tipo, por exemplo, transmissão de célula para célula e a toxicidade celular não autónomo. A transparência dos animais permite o acompanhamento de fluorescente etiquetado proteínas de dentro do organism.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Os métodos descritos aqui ajudam a ilustrar espalhando e celular toxicidade autônoma da célula complexo autônomo e não de proteínas príon-like. Descobrimos recentemente que um domínio de prion cytosolic agregação propensas é retomado em vesículas ligadas à membrana em um processo de autofagia relacionados. Um subconjunto específico dessas vesículas transporta o domínio de prião dentro e entre as células e tecidos 40. A chave para controlar o seu movimento no animal vivo é que a proteína tem de ser marcado com.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos a Cindy Voisine e Yoko Shibata pela discussão útil e comentários críticos sobre o manuscrito. Agradecemos ao Laboratório de Análise de Alto Rendimento (HTAL) e ao Biological Imaging Facility (BIF) da Northwestern University por sua assistência. Este trabalho foi financiado por doações dos Institutos Nacionais de Saúde (NIGMS, NIA, NINDS), da Fundação Médica Ellison e da Fundação Daniel F. e Ada L. Rice (para R.I.M.). C.I.N.-K. foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| reagentes | |||
| 100 nm | ThermoScientific | 3100A | |
| Levamisol | Sigma | L-9756 | |
| IPTG | Sigma | 15502-10G | |
| Ahringer RNAi library | Fonte: BioScience LifeSciences | http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/ | |
| Equipamento | |||
| Centrífuga Refrigerada Sorvall Legend XTR, 120VAC | ThermoScientific | 75004521 | http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60 |
| Replicador de 96 pinos | Scionomix | http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/ | |
| Agitador de incubação de alta capacidade HiGro | Multidrop Digilab | ||
| Titertrek | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm | ||
| Biomek FX AP96 | Beckman Coulter | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm | |
| Shaker Innova44 | New Brunswick | http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04& ação=produtos& contentid=1& catalognode=83389 | |
| M205 FA | Leica | http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/ | |
| ORCA-R2 C10600-10BDicidade CCD | Câmera Hamamatsu | http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html | |
| Spinning Disc AF Microscópio Confocal | Câmera Leica | http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/ | |
| Falcon 4M60 | Teledyne Dalsa | http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/ | |
| Software | |||
| MetaMorph Microscopia Automação & Software de Análise de Imagem | Molecular Devices | http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html | |
| Hamamatsu Software de Análise de Imagem SimplePCI | Meyer Instruments | http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm | |
| ImageJ | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| wrPlugin MTrck para ImageJ | http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html | ||
| C. elegans cepas | |||
| N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570 | |
| AM815 rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] | Morimoto | disponível em nosso laboratório | |
| Consulte a tabela 1 para obter uma fonte para deformações |
Referências
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie.....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
