Protocol
Questo studio è stato condotto con il permesso dello Stato della Sassonia e della Sassonia-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, secondo la sezione 8 della legge tedesca per la protezione degli animali (24D-9168,11-1 / 2008-24).
Isolation 1 Cella
1.1 Preparazione di femore e tibia
- Anestetizzare il mouse utilizzando una concentrazione di isoflurano 5% vaporizzando isoflurano in un contenitore chiuso. Dopo che il mouse ha smesso di muoversi per 3 secondi, eseguire la dislocazione cervicale.
- Disinfettare arti posteriori con etanolo (96%). Togliere la pelle e muscoli e separare le ossa con un bisturi sterile.
- Inizia con una incisione cutanea inguinale, ed estendere l'incisione verso il malleolo mediale ed eseguire una dissezione circolare della pelle intorno al polpaccio inferiore. Togliere la pelle delle gambe completamente peeling prossimale.
- Staccare il muscolo quadricipite dal femore con un bisturi affilato, rimuovere entrambi i peroneo anterioreei gruppi muscolo gastrocnemio e disarticolare la gamba alla articolazione dell'anca individuando e dissezione dei legamenti.
- Inizia anteriormente e procedere intorno all'articolazione ruotando con cura la gamba e sezionare i legamenti, disarticolare quindi l'articolazione.
- Lavare femore e tibia con etanolo al 96% per un minimo di 90 sec per garantire preparazione cellulare asettica. Continua il processo di lavaggio con PBS sterile per risciacquare l'etanolo residuo.
Nota: Tutti i passi successivi devono essere sterile per evitare contaminazioni.
1.2 La raccolta di midollo osseo
- Tagliare l'estremità prossimale e distale di ciascun osso con un paio di forbici sottili per accedere agli alberi femorale e tibiale. Fate attenzione con questo passo, dal momento che queste ossa si rompono molto facilmente.
- Lavare le ossa con supporto caldo (M199 + 10% di siero fetale bovino (FCS), + 1% penicillina / streptomicina). Utilizzare un ago sterile 28-G, una siringa da 1 ml, e tra 10-15 ml di mezzo perosso per il risciacquo.
- Tenere l'osso con una pinza sottile e risciacquare uno per uno fino a quando non diventa semi-trasparente. Applicare con attenzione la pressione all'estremità dello stantuffo della siringa in modo da minimizzare lo stress cellulare.
- Filtrare il midollo osseo attraverso un 70 micron nylon web e raccogliere il filtrato. Per estrarre la quantità massima di midollo osseo, lavare ripetutamente dalle estremità distali e prossimali.
- Sciacquare il setaccio con PBS e raccogliere il filtrato. Rimuovere con cautela i detriti e conglomerati cellulari di blanda agitazione e pipettaggio.
1.3 Coltivazione
- Centrifugare la sospensione cellulare a 250 xg per 10 min a RT. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule con circa 25 ml di terreno. Ripetere una volta.
- Risospendere le cellule in 6 ml di terreno dopo la seconda fase di lavaggio. Mescolare 50 ml di soluzione di cellule con 50 ml di trypan blu. Contare le cellule in una camera di conteggio al microscopio ottico. Calcolare il numero di cells nella soluzione con questa formula:
- Seme le cellule su piastre di superficie ultra-bassa fissaggio 6 pozzetti per prevenire l'adesione permanente al fondo della piastra. Utilizzare una concentrazione di 10 6 cellule per ml con fino a 6 ml per pozzetto.
- Supplemento la sospensione con 20 ng / ml M-CSF per promuovere la differenziazione delle cellule.
- Coltivare le cellule per 5 giorni a 37 ° C e 5% di anidride carbonica e di osservare tutti i giorni.
1.4 La raccolta di cellule
Nota: Queste procedure devono essere eseguite su ghiaccio. Procedere con o 1.4.1 o 1.4.2 di conseguenza.
- A questo punto, raccogliere tutta la cultura, tra cui i macrofagi differenziati che aderiranno alla cultura-piastre, anche se sono lastre di superficie ultra-low-attaccamento.
- Raccolto l'intera cultura delicatamente pipettando e staccare con una soluzione di 4 ° C PBS, 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) e 2 mM EDTA. Ripetere fino a quando le piastre sono chiare di rimanere cellule aderenti - confermano al microscopio in caso di incertezza.
- In alternativa, scartare macrofagi aderenti raccogliendo il surnatante con le cellule in sospensione, che contengono prevalentemente monociti.
- Raccogliere le cellule non aderenti con una soluzione di PBS senza EDTA e 0,5% BSA. Non applicare troppa forza per evitare di spostare leggermente macrofagi aderenti.
1.5 FACS-Analysis (Opzionale)
Nota: È possibile esaurire la sospensione cellulare di cellule progenitrici essendo soggetti a regimi e CD117 + dall'uso di MACS. Utilizzare protocolli produttore per questa procedura.
- Raccogliere le cellule in base a uno i punti 1.4.1 e 1.4.2.
- Centrifugare le cellule a 250 xg per 10 min a 4 ° C e ripetere questo passo.
- Risospendere almeno 250.000 cellule in 300 ml di FACS bUffer per sonda.
- Trasferire la soluzione di cellule su un 96-pozzetti-(30 microlitri per pozzetto).
- Centrifugare la sospensione cellulare a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 25 ml di anticorpi ad ogni pozzetto (diluizione usare produttore).
- Colorare le cellule con anticorpi (seguenti protocolli produttore per fenotipizzazione cellulare dopo passaggi 1.5.1-1.5.6. Marker comunemente usati per l'identificazione dei monociti / macrofagi includono CD11b, F4 / 80 (figura 3), CD115 (figura 2), e Gr- 1.
Nota: Per una descrizione più dettagliata delle soluzioni cellulari, si consiglia l'uso di marcatori come CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G, e CD192. Caratteristiche cellulari sono stati precedentemente descritti 12. - Incubare le sonde per 20 min a 4 ° C.
- Centrifugare le sonde a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere con 200 microlitri di tampone FACS. Ripetere thè un passo due volte.
- Trasferire le sonde in tubi FACS ed eseguire l'analisi FACS 12.
- Eseguire analisi FACS 12 al giorno 0, 3 e 5 per analizzare la differenziazione cellulare.
2. Tail Vein Injection
2.1 Preparazione
- Riscaldare gli animali su una piastra riscaldante a 37 ° C per circa 10 min. Osservare gli animali, mentre il riscaldamento a riconoscere i segni di surriscaldamento.
- Risospendere i monociti, isolati in passaggi 1.1- 1.4, in 150 ml di NaCl, e caricare le cellule in una siringa da 1 ml di insulina con un ago 30G. Leggermente agitare la soluzione prima di caricare la siringa per assicurare tutti i monociti vengono iniettati. Maneggiare sempre le cellule in ghiaccio per evitare l'attaccamento calore mediata e l'attivazione dei monociti.
2.2 Trattenere
- Evitare di disturbare gli altri topi in gabbia quando si sceglie un mouse per iniezione endovenosa.
- Posizionare il mouse il limitatore. Evitare troppo prEssure e stare attenti con gli arti posteriori. (Figura 4)
Nota: In alternativa, utilizzare l'anestesia generale per garantire stress accudimento degli animali. - Assicurarsi che il mouse ha spazio per respirare prima di chiudere il limitatore.
2.3 Iniezione
- Disinfettare il sito di iniezione con disinfettante. Spruzzare sulla coda del mouse e lasciate riposare per almeno 1 min.
- Interrompere il flusso di sangue venoso della coda, applicando una leggera pressione sul lato coda laterale sopra il sito di iniezione, per una migliore visibilità delle vene.
- Girare la coda di 90 gradi, prima dell'iniezione. (Figura 5)
- Iniettare un angolo di 45 gradi. Iniettare lentamente e non più di 5 ml per g di evitare gli animali danneggiare.
- Se c'è una bolla, che è un segno di una iniezione fallito, interrompere immediatamente e ripetere l'iniezione più prossimale.
- Fermare l'emorragia sul lato iniezione applicando dolce pressione per circa 1 min.
- Al termine della procedura, aprire riavvolgitore e posizionare il mouse nella gabbia.
- Osservare il mouse per 20 minuti al fine di garantire che l'animale non è stato danneggiato da iniezione e decubito sternale è mantenuta. Estendere il tempo di osservazione fino a quando il mouse riprende conoscenza sufficiente. Ritorna il mouse per la compagnia di altri animali solo dopo che ha pienamente recuperato.
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Representative Results
La soluzione di cellule estratte dal midollo osseo murino costituito da vari tipi di cellule. I principali tipi di cellule sono linfociti, granulociti e monociti. Le cellule possono essere stimati in base alle dimensioni e granularità, che è mostrato in Figura 1 per entrambe le sospensioni nativi e cellule raccolte dopo 5 giorni di differenziazione. Si noti la composizione cellulare spostamento durante la coltivazione. Tuttavia, la classificazione accurata delle popolazioni deve poter contare su espressione distintiva di marcatori cellulari.
Il marcatore più importante utilizzato per identificare cellule del MPS-System è CD115, che funziona come il recettore M-CSF ed è specificamente espresso su monociti progenitori, monociti e macrofagi. Pertanto, non può essere usato per identificare distintive MPS-sottoinsiemi, ma può stimare in modo attendibile la quantità assoluta di cellule conficcati nella differenziazione dei monociti / macrofagi. Vedere la Figura 2 per una timeline di espressione CD115 durante differireziazione.
Il marcatore maturità F4 / 80 è utile per differenziare monociti giovanili, monociti e macrofagi maturi. I macrofagi mostrano una forte espressione della F4 / 80 rispetto a minorile progenitori monociti, che sono negativi per il marcatore. Monociti maturi mostrano espressione intermedia F4 / 80. Una combinazione di CD115 e F4 / 80 marcatori rappresenta pertanto un metodo fattibile per quantificare e monitoraggio differenziazione cellulare (vedi figura 3).
La combinazione di CD115 e F4 / 80 è sufficiente per l'osservazione coltura di routine e controllo di qualità prima dell'applicazione delle cellule. Un esame più approfondito dei monociti midollo osseo derivate al giorno 5 di coltivazione conferma le loro proprietà strutturali e funzionali in accordo a quelle del periferico monociti di sangue 12.
È importante fissare il mouse accuratamente nel dispositivo di immobilizzazione, evitando la tensione sulla coda. Limitare Freedom di movimento per quanto possibile senza inibire la respirazione per facilitare l'iniezione.
Figura 1. Pannello sinistro:. Le cellule Composizione di tipi di cellule al giorno 1 nella cultura includono linfociti, monociti e granulociti. Pannello destro: Si noti la composizione cellulare spostamento durante la coltivazione. Popolazione cellulare include monociti e macrofagi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Timeline di espressione CD115 durante la differenziazione. Si noti che> il 95% di tutte le cellule CD115 positive vengono dopo 5 giorni di differenziazione, che indica che la stragrande maggioranza delle cellule sono o monociti o macrofagi. La classificazione può essere basata sulla dimensione delle cellule e granularità, ma marcatori cellulari specifici sono più affidabili. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Aumentare espressione di monociti / macrofagi marcatore maturità F4 / 80 Giorno 5:. Nota l'aspetto di una popolazione con intermedio F4 / 80 espressione, che è coerente con monociti fenotipo. Giorno 7:. Nota il diritto-shift della F4 / 80 espressione, in linea con la maturazione dei macrofagi Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 4. mouse fissato restrainer per iniezione coda vena. Frenare dopo aver attentamente il mouse, ruotare la coda di 90 gradi fino a quando le vene sono visibili sul lato dorsale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. sezione schematica della coda di topo. L'immagine mostra la posizione delle navi ai coda di topo. Le arterie (rosso) si trovano sul lato ventrale e dorsale, e le vene sono sulla parte laterale della coda. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Descriviamo un metodo semplice e conveniente per isolare grandi quantità di monociti murini da midollo osseo. In confronto ad altri protocolli che utilizzano sangue periferico, che ottengono rendimenti monociti 5 su 1.4 x10 6, siamo in grado di ottenere rendimenti più elevati di 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monociti da un singolo mouse donatore.
Quando si considera sfide con questo metodo, è importante ricordare la possibilità di contaminazione quando si lavora in condizioni non sterili. Se risciacquo e le seguenti fasi di lavaggio non sono seguite correttamente, la contaminazione da batteri e funghi è probabile. Inoltre, midollo osseo costituito da sospensioni cellulari eterogenee, inclusi granulociti, linfociti e cellule eritroidi. Normalmente queste cellule svaniscono tra il giorno 2 e 3 di coltura a causa della mancanza di fattori di crescita. Dopo il fattore di crescita guidata differenziazione, i macrofagi sono la principale fonte di contaminazione. Per mantenere tegli numero di macrofagi basse e minimizzare la differenziazione dei monociti a macrofagi, l'uso di piastre di fissaggio ultra-bassa e le fasi di lavaggio di cui sopra sono critici.
È difficile identificare un marcatore che è esclusivamente specifico monociti. Interferenza fra marcatori richiede l'uso di più di un marcatore, e vi è variabilità nella granularità e dimensioni delle cellule nell'analisi sospensioni cellulari. I marcatori e le descrizioni riportate nelle figure 1-3 sono buone alternative per i tipi rappresentativi di cellule in coltura. Può essere difficile distinguere i vari tipi di cellule, soprattutto dopo giorno 5. Pertanto è fondamentale utilizzare altri indicatori come il CD115 e F4 / 80.
Considerando l'espansione delle cellule di midollo osseo in condizioni senza adesione, differenziazione macrofagi può essere prolungata e monociti indifferenziate possono accumularsi. Differenziazione macrofagi indica contaminazione; tuttavia, due alla loro natura adesiva anche su superfici di coltivazione ultra-bassa fissaggio, possono essere facilmente scartata mentre solo la raccolta cellule non adesivi dalla cultura. In esperimenti precedenti 1,3, la contaminazione da parte dei macrofagi non ha portato a gravi effetti collaterali clinici. Iter istologica degli organi e dei muscoli di topi dopo il trapianto di cellule ha dimostrato che i macrofagi iniettati assimilate in organi come milza, fegato o polmoni. L'assimilazione dei macrofagi in questi organi non ha evidenziato effetti clinici osservabili nei topi. Il meccanismo molecolare innescato da questi macrofagi possono essere interessanti domande per ulteriori indagini.
Monociti e macrofagi influenzano arteriogenesi in malattia arteriosa periferica, soprattutto se applicato a livello sistemico. Effetti collaterali clinici quali l'embolia o massiva infiammazione sistemica non potevano essere osservati anche dopo l'iniezione di oltre 2,5 milioni di monociti, ma queste cellule possono innescare l'infiammazione e pozialmente causare gravi effetti sistemici. In sperimentazione umana, questi effetti possono avere significato clinico. Il distacco provocato di arteriogenesi può influenzare la crescita del tumore o la retinopatia diabetica, e tali effetti sistemici possibili soluzioni di cellule iniettate dovrebbero essere esplorate in studi futuri.
Pubblicazioni precedenti 9 descrivono le differenze tra le caratteristiche dei monociti periferici sangue e nel midollo osseo, che spiegano perché le proprietà di monociti dal midollo osseo possono differire da quelli isolati da cellule del sangue periferico.
Il metodo di isolamento è di interesse clinico pure. Disegno sangue invece di estrarre midollo osseo umano è più pratico nel contesto della medicina clinica. E 'importante prendersi cura del benessere degli animali e di applicare l'analgesia, se necessario. Per le iniezioni endovenose, è fondamentale per praticare gestire sia l'animale e la siringa allo stesso tempo. Se un singolo animal sta subendo iniezioni multiple, la qualità delle vene e la pelle della coda soffrono.
Nonostante questi svantaggi, questo metodo è molto utile per studiare il comportamento e le caratteristiche dei monociti. Esperimenti nel campo della aterosclerosi, immunologia o infiammazione possono beneficiare di questo metodo. Solo 30 minuti sono necessari dall'estrazione di midollo osseo per la semina di cellule su piastre di superficie ultra-low-attaccamento 6 pozzetti. Preoccupazioni etiche sono ridotti al minimo, poiché l'elevata resa di questo protocollo minimizza il numero di animali necessari come donatori di cellule. Questo nuovo metodo sarà utile per molti studi che coinvolgono monociti.
Ci siamo concentrati sul potenziamento terapeutico di crescita dei vasi collaterali tramite trapianto di monociti. La natura multifattoriale di questo processo può spiegare perché singolo fattore approcci per risultati misti aumento del arteriogenesi hanno generato 13,14. Ciò ha portato alla investigation di terapie cellulari. Cellule staminali e progenitrici del midollo osseo autologo sono state identificate come cellule potenziali per il trapianto, ma solo benefici clinici moderati sono stati riportati 15. Oltre alla ricerca sul dosaggio, metodi di isolamento, e vie di somministrazione, ulteriori ricerche sono ancora necessarie per determinare il tipo di cellula ottimale. Uno svantaggio di trapianto di cellule autologhe potrebbe essere la loro incapacità di attivare la risposta immunitaria innata e / o di adattamento, ed entrambi sono fondamentali per arteriogenesi. Aumentare infiammazione locale può rappresentare la migliore stimolo per arteriogenesi 16.
L'iniezione endovenosa di monociti è un metodo comune per il trapianto di cellule all'interno di modelli di topo se la somministrazione di farmaci sistemici si desidera. A causa di effetti sistemici, gli effetti collaterali possono verificarsi pure. Assicurarsi che la vena è mirato per l'iniezione. E 'comune a confondere le arterie e le vene, soprattutto quando iniettano mic fortemente pigmentatae. Iniezione arteriosa può causare embolie, che portano a questioni sistemiche in circolazione.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well-ultra-low-attachment plate | Corning Incorporated, NY, USA | 6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile | |
| 8- 12 week old, male, balb/c mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| 96-well-plate | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Blue dead cell stain | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ||
| Bovine serum albumine | GE Healthcare, Freiburg, Germany | Fraction V, pH 7.0 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 28G, 30G | |
| CD115 | eBioscience, San Diego, USA | 12-1152 | |
| CD11b | eBioscience, San Diego, USA | 53-0112 | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | With cap, steril | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra® X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | Kodan Tinktur forte | |
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Ethanol 96% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Extraction unit Pipetus | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany | ||
| F4/80 | AbD Serotec, Düsseldorf, Germany | MCA497APC | |
| FACS buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3 | |
| FACS device | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | BD FACS Canto II | |
| FACS tubes | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Falcon® pipette | Becton Dickenson Labware, NY, USA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Gr1 | eBioscience, San Diego, USA | 53-5931 | |
| Heating plate | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Incu safe | |
| Isofluran | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 °C | |
| Macrophage-Colony Stimulating Factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Mechanical shaker | IKA, Staufen, Germany | ms2 minishaker | |
| Medium 199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | Warm in 37 °C water bath before use | |
| Micro test tubes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| NaCl | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| NaN3 (sodium acide) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Nylon cellsieve | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | Cell strainer, 70 µm mesh size | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Phosphate buffered saline | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | pH 7.4, sterile | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µl/100µl/200µl/1,000µl | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Serological pipette | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 5 ml, 10 ml | |
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 1 ml Omnifix® -F insuline syringe | |
| Tubes with cap | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | 15 ml/50 ml Cellstar tubes | |
| Warm water bath | Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany | Julabo SW22 |
References
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15 (1), 1-12 (2004).
- Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Isolation and transduction of monocytes: promising vehicles for therapeutic arteriogenesis. Langenbecks Arch Surg. 391 (2), 72-82 (2006).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American Journal Of Translational Research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Leon, B., et al. Dendritic cell differentiation potential of mouse monocytes: monocytes represent immediate precursors of CD8- and CD8+ splenic dendritic cells. Blood. 103 (7), 2668-2676 (2004).
- Timmerman, J. M., Levy, R. Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy. Annu Rev Med. 50, 507-529 (1999).
- Salem, M. L. The use of dendritic cells for Peptide-based vaccination in cancer immunotherapy. Methods Mol Biol. 1139, 479-503 (2014).
- Timmerman, J. M., et al. Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B-cell lymphoma: clinical and immune responses in 35 patients. Blood. 99 (5), 1517-1526 (2002).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
- Houthuys, E., Movahedi, K., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. Journal Of Immunological Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Seeger, F. H., Tonn, T., Krzossok, N., Zeiher, A. M., Dimmeler, S. Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction. European Heart Journal. 28 (6), 766-772 (2007).
- Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. The Journal Of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
- Francke, A., Herold, J., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Generation of mature murine monocytes from heterogeneous bone marrow and description of their properties. J. Histochem. Cytochem. 59 (9), 813-825 (2011).
- Sneider, E. B., Nowicki, P. T., Messina, L. M. Regenerative medicine in the treatment of peripheral arterial disease. Journal Of Cellular Biochemistry. 108 (4), 753-761 (2009).
- Van Royen, N., Piek, J. J., Schaper, W., Fulton, W. F. A critical review of clinical arteriogenesis research. J Am Coll Cardiol. 55 (1), 17-25 (2009).
- Lawall, H., Bramlage, P., Amann, B. Treatment of peripheral arterial disease using stem and progenitor cell therapy. J Vasc Surg. 53 (2), 445-453 (2011).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
