Protocol
この研究は、動物保護（24D-9168.11から1/2008から24）のためのドイツ法第8に従って、ザクセンとザクセン=アンハルト、Regierungspraesidiumドレスデン/ハレの国の許可を得て実施した。
1細胞の単離
1.1大腿骨と脛骨の調製を
- 閉じたビンにイソフルランを気化させることにより、5％イソフルラン濃度を用いて、マウスを麻酔。マウスは3秒間移動を停止した後、頚椎脱臼を行う。
- エタノール（96％）で後肢を消毒する。皮膚や筋肉を取り出し、無菌のメスで骨を分離する。
- 鼠径皮膚切開を開始し、内果に向かって切開を延長し、下の子牛の周りの皮膚の円形切開を行う。近位にそれを剥離することにより、完全に足の皮膚を削除します。
- 鋭いメスで大腿骨から大腿四頭筋を切り離し、前方腓骨の両方を削除と腓腹筋グループと靭帯を探し、解剖によって股関節で足をdisarticulate。
- 前方に起動して、慎重に足を回転させ、靭帯を横に切開することにより、関節を中心に進んで、それによってジョイントをdisarticulating。
- 洗浄大腿無菌細胞調製を保証する90秒以上96％エタノールで脛骨。残りのエタノールを洗い流すために滅菌PBSで洗浄プロセスを続行します。
注：すべてのその後の工程は、汚染を避けるために無菌でなければならない。
骨髄の1.2収穫
- 大腿骨と脛骨のシャフトへのアクセスを得るために細かいハサミで各骨の近位端および遠位端をカットします。これらの骨は非常に簡単に壊れているため、このステップには注意してください。
- 温かい培地で骨をフラッシュする（M199 + 10％ウシ胎児血清（FCS）+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。無菌の28-G針、1ミリリットルの注射器、10〜15 mlの培地あたりの間に使用しますすすぎのための骨。
- 細かい鉗子で骨を持ち、それが半透明に変わるまで一つ一つをすすぐ。注意深く細胞ストレスを最小にするために、シリンジプランジャの端部に圧力を加える。
- 70μmのナイロンウェブを通じて骨髄を濾過し、ろ液を集める。骨髄の最大量を抽出するために、遠位端と近位端から繰り返しすすぐ。
- PBSでふるいをすすぎ、ろ液を集める。慎重に穏やかに撹拌し、ピペッティングにより破片や携帯コングロマリットを取り除く。
1.3栽培
- RTで10分間250×gで細胞懸濁液を遠心します。上清を捨て、約25ミリリットルの培地で細胞を懸濁します。一回繰り返します。
- 第2洗浄工程の後に培地6mlの中に細胞を再懸濁する。パンブルーの50μlの細胞溶液50μlを混ぜる。光学顕微鏡下で計数チャンバー内の細胞を数える。数cを計算するこの式を使用して、溶液中のエル：
- プレートの底に永久的な付着を防止するために、6ウェルの超低取付面板上に細胞を播種する。ウェルあたり最大6 mlの1mlあたり10 6細胞の濃度を使用してください。
- 細胞分化を促進するために20ng / mlのM-CSFとの懸濁液を補う。
- 培養物を37℃で5日間、細胞を、5％の二酸化炭素とを毎日観察する。
細胞の1.4収穫
注：これらの手順は、氷上で行われるべきである。それに応じて1.4.1または1.4.2のどちらかに進みます。
- この時点で、彼らは、超低取付面板であっても、培養プレートに付着する分化したマクロファージを含む、全体の培養を収穫する。
- 穏やかなピペッティングにより全体の文化を収穫し、4℃、PBの溶液で脱着S、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）および2mM EDTA。わからない場合には、顕微鏡下で確認する - プレートが接着細胞を残りの明確になるまで繰り返します。
- 別の方法として、主に単球が含まれている懸濁液中の細胞と上清を収穫することにより、接着性マクロファージを捨てる。
- EDTA非含有PBS溶液と0.5％BSAと非接着細胞を回収。穏やかに付着したマクロファージを追い出し避けるためにあまりにも多くの力を加えないでください。
1.5 FACS-解析（オプション）
注：これは、MACSを用いてCD117 +ステムおよび前駆細胞の細胞懸濁液を枯渇させることが可能である。この手順については、製造元のプロトコルを使用してください。
- どちらかが1.4.1または1.4.2の手順に従って、細胞を採取する。
- 4℃で10分間250×gで細胞を遠心して、もう一度この手順を繰り返します。
- FACS bの300μlの中に再懸濁し、少なくとも250,000細胞プローブあたりuffer。
- 96ウェルプレート（ウェルあたり30μL）の上に細胞溶液を転送します。
- 4℃で5分間250×gで細胞懸濁液を遠心します。
- 上清を除去し、各ウェル（使用メーカー希釈）に対する抗体の25μlを添加する。
- 抗体と細胞（1.5.1-1.5.6ステップ後の細胞表現型のために製造業者のプロトコルを以下のように染色。単球/マクロファージの同定のために一般に使用されるマーカーは、CD11bの、F4 / 80（ 図3）、CD115（図2）、およびGR-を含む1。
注：セル·ソリューションのさらなる説明については、CD4、CD8a、のCD11c、CD25、CD45、CD45R、CD62L、CD80、CD86、CD145、CD117、MHCⅡ、Ly6C、Ly6G、およびCD192のようなマーカーの使用が推奨されます。細胞の特徴は、以前に12を説明した。 - 4℃で20分間、プローブをインキュベートする。
- 遠心機で4℃で5分間250×gでプローブし、FACS緩衝液200μlに再懸濁とは目を繰り返しますステップの2倍である。
- FACSチューブにプローブを転送し、FACS分析12を行う。
- 細胞分化を分析するために、0日目、3及び5にFACS分析12を実行する。
2.尾静脈注射
2.1準備
- 約10分間37℃で加熱板上で動物を暖める。過熱の兆候を認識するために温めながら、動物を観察します。
- NaClを150μlの中で、ステップ1.1〜1.4で孤立し、単球を再懸濁し、30Gの針を1ミリリットルのインスリン注射器に細胞をロードします。軽くすべての球が注入されるように、注射器をロードする前に解決策をボルテックス。常に熱媒介アタッチメントと単球の活性化を避けるために、氷上で細胞を処理します。
2.2保全処分
- 静脈内注射のためのマウスを選択する際にケージ内の他のマウスを乱すことは避けてください。
- 制止にマウスを置きます。あまりにも多くのPRを避けるessureと後肢に注意してください。 （ 図4）
注：または、動物のストレスのないハンドリングを保証するために全身麻酔を使用しています。 - マウスが制止を閉じる前に、呼吸のためのスペースがあることを確認してください。
2.3インジェクション
- 消毒剤と、注射部位を消毒する。マウスの尾にスプレーし、少なくとも1分間放置。
- 静脈の視認性のために、注射部位の上に外側尾側に緩やかな圧力を加えることにより、尾の静脈血の流れを止める。
- 注射の前に、尾を90度回します。 （ 図5）
- 45度の角度で注入する。動物に害を避けるために、ゆっくりと何グラムあたり5μL以上の注入ません。
- 失敗した注射のサインですブリスターがある場合は、すぐに中止し、より近位に注射を繰り返します。
- 穏やかなページを適用することにより、射出側の出血を止める約1分間の案内圧力スイッチ。
- 手順の最後に、リトラクターを開き、そのケージにマウスを置く。
- 動物が注射によって害されませんでしたし、胸骨の横臥が維持されることを保証するために20分間、マウスを観察します。マウスが十分な意識を取り戻すまで、観測の時間を延長します。それは完全に回復した後にのみ、他の動物の会社にマウスを返します。
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Representative Results
マウス骨髄から抽出された細胞溶液は、様々な細胞型から成る。主要な細胞型は、リンパ球、顆粒球及び単球である。細胞型は、分化の5日後に採取し、ネイティブ懸濁液および細胞については、図1に示されているサイズおよび粒度によって推定することができる。培養中のシフト細胞組成に注意してください。しかし、集団の正確な分類は、細胞マーカーの特徴的な表現に依存しなければならない。
MPS-系の細胞を同定するために使用される最も重要なマーカーは、M-CSF受容体として機能し、特に単球前駆細胞、単球およびマクロファージ上に発現されるCD115である。したがって、独特のMPS-サブセットを識別するために使用されないかもしれないが、確実に、単球/マクロファージ分化に打ち込ま細胞の絶対量を推定することができる。異なる中のCD115発現をタイムラインについては、図2を参照してくださいentiation。
成熟マーカーF4 / 80は、若年性単球、成熟した単球、およびマクロファージを区別するのに便利です。マクロファージは、マーカーに対して陰性である単球前駆細胞を、少年と比較して、F4 / 80の強力な発現を示す。成熟した単球をF4 / 80の中間の発現を示す。したがって、CD115及びF4 / 80マーカーの組み合わせは、（ 図3を参照）、細胞分化を定量化し、監視するための実行可能な方法を表している。
CD115及びF4 / 80の組み合わせは、従来のセルの適用ルーチン培養観察および品質管理のために十分である。培養の5日目に骨髄由来単球のより詳細な検査は、末梢血単核球12のものに一致それらの構造的および機能的特性を確認する。
これは、尾の張力を避け、拘束具に慎重にマウスを修正することが重要です。 freedoを制限注射を容易にするために、呼吸阻害することなく、可能な限りの移動メートル。
図1の左パネル：培養中の1日目に細胞型の構成細胞型は、リンパ球、単球および顆粒が挙げられる。右パネル：培養中にシフトする細胞組成に注意してください。細胞集団は、単球およびマクロファージが含まれています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
分化中のCD115の発現図2.タイムライン。全ての細胞の> 95％がその広大なことを示す、分化の5日後にCD115陽性であるノート細胞の大部分は、単球またはマクロファージでのいずれかである。分類は、細胞の大きさと細かさに基づいてすることができますが、特定の細胞マーカーは、より信頼性がある。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
/ 80球/マクロファージ成熟マーカーF4の発現を増加図3. 5日目：。単球の表現型と一致している中間のF4 / 80発現が、 人口の外観に注意してください。 7日目：マクロファージの成熟と一致して、F4 / 80式の右シフトに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図4.マウス尾静脈注射のための拘束装置で固定した。後は慎重にマウスを拘束する静脈は背側に表示されるまで、尾を90度回転させる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.マウスの尾の概略断面。画像はマウスの尾の血管内の場所を示している。動脈（赤）は、腹と背側の側に位置し、静脈は尾の側面にあるされている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
我々は、骨髄由来のマウスの単球を大量に単離するための単純で費用効果的な方法を記載する。 1.4×10 6の単球収率5を得た末梢血を使用して、他のプロトコルと比較して、我々は、単一のドナーマウスから11×10 6±3×10 6単球のより高い収率を得ることができる。
この方法の課題を考慮した場合、非無菌条件下で作業する場合には、汚染の可能性を言及することが重要である。すすぎ後の洗浄工程が適切に従わない場合は、細菌および真菌による汚染可能性が高いです。さらに、骨髄は顆粒球、リンパ球および赤血球系細胞を含む不均一な細胞懸濁液、で構成されています。通常、これらの細胞は、増殖因子の欠如のために2日培養の3との間に消える。成長因子駆動型分化した後、マクロファージは、汚染の主な原因である。トンを維持するためにマクロファージへの単球の分化を最小限に抑えるために、低およびマクロファージの彼数は、超低付着性プレートと、上述した洗浄工程の使用が重要である。
これは、排他的に単球に特異的であるマーカーを同定することは困難である。マーカー間の干渉は、複数のマーカーの使用を必要とし、可変性は、細胞懸濁液を分析する粒度及び細胞の大きさである。 図1-3に示すマーカーと説明は、培養中の代表的な細胞型のための良い選択肢である。これは、5日目のためにはCD115及びF4 / 80のような他のマーカーを使用することが重要であり、特に後、種々の細胞型を区別することは困難である。
接着性のない条件下での骨髄細胞の拡大を考慮すると、マクロファージの分化を長くすることができる未分化単球を蓄積することができる。マクロファージの分化は、汚染を示している。しかし、デュ唯一の培養物からの非接着細胞を回収しながらでも、超低付着培養表面にその接着性質eは、それらが容易に廃棄することができる。以前の実験1,3では、マクロファージによる汚染は深刻な臨床的副作用をもたらしていない。細胞移植後のマウスの臓器や筋肉の組織学的精密検査は、注入されたマクロファージは、脾臓、肝臓や肺などの臓器に同化することを示した。これらの器官におけるマクロファージの同化は、マウスにおいて観察可能な臨床効果を示さなかった。これらのマクロファージによってトリガー分子機構はさらなる調査のための興味深い質問することができます。
全身に適用された場合、単球などマクロファージは、特に、末梢動脈疾患で動脈形成に影響を与える。そのような塞栓症または大量の全身性炎症の臨床副作用があっても250万人以上の単球の注入後に観察されなかったが、これらの細胞は、炎症および経口をトリガすることができtentially重篤な全身作用を引き起こす。ヒト試験では、これらの効果は、臨床的意義を有する可能性が高い。動脈のトリガは、腫瘍増殖または糖尿病性網膜症、および今後の研究で検討されるべきで注入された細胞溶液のような可能な全身作用に影響を与えることができる。
以前の刊行物は、骨髄からの単球の特性は、末梢血細胞から単離されたものとは異なることができる理由を説明する末梢、血液及び骨髄由来単球の特性の違いを説明する9。
単離方法は、同様に臨床興味深い。採血の代わりにヒト骨髄を抽出し、臨床医学の文脈でより実用的である。それは、動物の福祉の世話をするために、必要に応じて鎮痛を適用することが重要である。静脈内注射のためには、動物と同時に、注射器の両方を扱う実践することが重要である。シングルANIの場合MALは、静脈の品質と尾の皮膚が苦しむ、複数回の注入を受けている。
これらの欠点にもかかわらず、この方法は、単球の挙動および特性を研究するのに非常に有用である。アテローム性動脈硬化症、免疫や炎症の分野での実験は、この方法から利益を得ることができる。わずか30分で、6ウェルの超低取付面プレート上の細胞の播種に骨髄の抽出から必要とされる。このプロトコルの高い収率が細胞ドナーとして必要な動物の数を最小化するため、倫理的な問題は、最小化される。この新しい方法は、単球を含む多くの研究のために参考になります。
我々は、単球の移植を介して、側副血管成長の治療の増強に焦点を当ててきた。動脈形成の増強のための単一の要因のアプローチが入り混じった結果13,14を生成した理由を、このプロセスの多因子性質が説明できるかもしれない。これは、中につながっている細胞ベースの治療のvestigation。自家骨髄由来の幹細胞および前駆細胞は、移植のための潜在的な細胞として同定されているが、中程度の臨床的利益は15報告されている。投与量、単離方法、および投与経路の研究に加えて、さらなる研究が依然として最適な細胞タイプを決定するために必要とされる。自家細胞移植の欠点は、先天的および/または適応免疫応答を活性化することができないこととすることができ、両方が動脈形成のために重要である。局所炎症を増加させると、動脈16のための最高の刺激を表すことができる。
全身性の薬物送達が所望される場合、単球の静脈内注射は、マウスモデル内の細胞移植のための一般的な方法である。なぜなら、全身効果のため、副作用は同様に起こり得る。静脈注射をターゲットにしていることを確認してください。それは、特に重く色素性マイクを注入し、動脈と静脈を、混同することが一般的であるE。動脈注射は、循環における全身の問題につながる塞栓を引き起こす可能性があります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well-ultra-low-attachment plate | Corning Incorporated, NY, USA | 6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile | |
| 8- 12 week old, male, balb/c mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| 96-well-plate | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Blue dead cell stain | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ||
| Bovine serum albumine | GE Healthcare, Freiburg, Germany | Fraction V, pH 7.0 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 28G, 30G | |
| CD115 | eBioscience, San Diego, USA | 12-1152 | |
| CD11b | eBioscience, San Diego, USA | 53-0112 | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | With cap, steril | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra® X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | Kodan Tinktur forte | |
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Ethanol 96% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Extraction unit Pipetus | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany | ||
| F4/80 | AbD Serotec, Düsseldorf, Germany | MCA497APC | |
| FACS buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3 | |
| FACS device | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | BD FACS Canto II | |
| FACS tubes | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Falcon® pipette | Becton Dickenson Labware, NY, USA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Gr1 | eBioscience, San Diego, USA | 53-5931 | |
| Heating plate | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Incu safe | |
| Isofluran | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 °C | |
| Macrophage-Colony Stimulating Factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Mechanical shaker | IKA, Staufen, Germany | ms2 minishaker | |
| Medium 199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | Warm in 37 °C water bath before use | |
| Micro test tubes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| NaCl | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| NaN3 (sodium acide) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Nylon cellsieve | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | Cell strainer, 70 µm mesh size | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Phosphate buffered saline | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | pH 7.4, sterile | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µl/100µl/200µl/1,000µl | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Serological pipette | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 5 ml, 10 ml | |
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 1 ml Omnifix® -F insuline syringe | |
| Tubes with cap | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | 15 ml/50 ml Cellstar tubes | |
| Warm water bath | Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany | Julabo SW22 |
References
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