単離とマウス骨髄由来の単球の静脈注射

Summary

ここでは、翻訳適用のために不均一な骨髄から大量のマウス単球を生成するプロトコルを紹介します。他の方法と比較して、この新しい方法は、高勾配磁気細胞分離(MACS)などの高価な方法を回避することにより、犠牲になる動物の数を減らし、コストを削減するのに役立ちます。

Abstract

白血球の亜型およびマクロファージの祖先として、単球は生物の多くの重要なプロセスに関与しており、生物医学のさまざまな分野の主題としてよくあります。以下に述べる方法は、不均一な骨髄からマウス単球を単離するための簡単で効果的な方法です。

Balb/cマウスの大腿骨と脛骨からの骨髄は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でフラッシングすることによって採取されます。細胞懸濁液にはマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を添加し、接着による単球の分化を避けるために超低接着面で培養します。単球の特性および分化は、様々な間隔で特徴付けられる。表現型解析には、CD11b、CD115、F4/80などのマーカーを用いた蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)が使用されます。培養終了時には、懸濁液は45%±12%の単球からなる。接着性マクロファージを除去することで、純度を最大86±6%まで高めることができます。単離後、単球はさまざまな方法で利用することができ、in vivo送達の最も効果的で一般的な方法の1つは、静脈内尾静脈注射です。

この単離と応用の技術は、特に炎症や免疫学の分野でマウスモデル研究にとって重要です。単球は、マウス疾患モデルでも治療に使用できます。

Introduction

単球の単離は、多くのin vitroおよびin vivo研究にとって重要かつ重要です。これらの細胞は、末梢動脈疾患、冠状動脈性心疾患、またはその他の虚血性疾患などの疾患の標的となります。これは、側副血管の成長が局所的な炎症によって強く引き起こされるためです。炎症反応には、内皮の活性化と白血球(主に単球)の局所的な動員が含まれ、その後、マクロファージに成熟し、複数の成長因子を分泌して細動脈の機能的な側副動脈へのリモデリングを誘導することにより、動脈形成性の高い環境を作り出します^1-3。また、単球は樹状細胞に成熟し、免疫学的研究^4,5やがん研究^6,7に頻繁に使用されます。

^末梢血からの単球単離のアプローチで問題となるのは、ほとんどの分析で十分な量の単球を生産するために必要なドナー動物の数が多いことです。以前のプロトコルでは、単球を単離する際のMACS⁹による密度勾配遠心分離や細胞枯渇などの方法が説明されています。しかし、これらの技術は単球の特性と機能性を変化させる可能性があり、解釈が困難になる可能性があります^10,11。さらに、これらの方法は難しく、実験の再現性を低下させる可能性があります。

このプロトコルの目的は、骨髄由来の....

Protocol

この研究は、動物保護（24D-9168.11から1/2008から24）のためのドイツ法第8に従って、ザクセンとザクセン=アンハルト、Regierungspraesidiumドレスデン/ハレの国の許可を得て実施した。

1細胞の単離

1.1大腿骨と脛骨の調製を

1. 閉じたビンにイソフルランを気化させることにより、5％イソフルラン濃度を用いて、マウスを麻酔。マウスは3秒間移動を停止した後、頚椎脱臼を行う。
2. エタノール（96％）で後肢を消毒する。皮膚や筋肉を取り出し、無菌のメスで骨を分離する。
   1. 鼠径皮膚切開を開始し、内果に向かって切開を延長し、下の子牛の周りの皮膚の円形切開を行う。近位にそれを剥離することにより、完全に足の皮膚を削除します。
   2. 鋭いメスで大腿骨から大腿四頭筋を切り離し、前方腓骨の両方を削除と腓腹筋グループと靭帯を探し、解剖によって股関節で足をdisarticulate。
   3. 前方に起動して、慎重に足を回転させ、靭帯を横に切開することにより、関節を中心に進んで、それによってジョイントをdisarticulating。
3. 洗浄大腿無菌細胞調製を保証する90秒以上96％エタノールで脛骨。残りのエタノールを洗い流すために滅菌PBSで洗浄プロセスを続行します。
   注：すべてのその後の工程は、汚染を避けるために....

Results

マウス骨髄から抽出された細胞溶液は、様々な細胞型から成る。主要な細胞型は、リンパ球、顆粒球及び単球である。細胞型は、分化の5日後に採取し、ネイティブ懸濁液および細胞については、図1に示されているサイズおよび粒度によって推定することができる。培養中のシフト細胞組成に注意してください。しかし、集団の正確な分類は、細胞マーカーの特徴的な表現に依存しなければならない。

MPS-系の細胞を同定するために使用される最も重要なマーカーは、M-CSF受容体として機能し、特に単球前駆細胞、単球およびマクロファージ上に発現されるCD115である。したがって、独特のMPS-サブセットを識別するために使用されないかもしれないが、確実に、単球/マクロファージ分化に打ち込ま細胞の絶対量を推定することができる。異なる中のCD115発現をタイムラインについては、図2を参照してくださいentiation。

成熟マーカーF4 / 80は、若年性単球、成熟した単球、およびマクロファージを区別する.......

Discussion

我々は、骨髄由来のマウスの単球を大量に単離するための単純で費用効果的な方法を記載する。 1.4×10 ⁶の単球収率^5を得た末梢血を使用して、他のプロトコルと比較して、我々は、単一のドナーマウスから11×10 ^{6±3×10 6}単球のより高い収率を得ることができる。

この方法の課題を考慮した場合、非無菌条件下で作業する場合には、汚染の可能性を言及することが重要である。すすぎ後の洗浄工程が適切に従わない場合は、細菌および真菌による汚染可能性が高いです。さらに、骨髄は顆粒球、リンパ球および赤血球系細胞を含む不均一な細胞懸濁液、で構成されています。通常、これらの細胞は、増殖因子の欠如のために2日培養の3との間に消える。成長因子駆動型分化した後、マクロファージは、汚染の主な原因である。トンを維持するためにマクロファージへの単球の分化を最小限に抑えるために、低およびマクロファージの彼数は、超低付着性プレートと、上述した洗浄工程の使用が重要である。

これは、排他的に単球に特異的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6ウェル超低アタッチメントプレート	Corning Incorporated, NY, USA		6ウェル超低アタッチメントプレート, キャップ付き, 無菌
8-12週齢, オス, balb/c マウス	Charles River, Sulzfeld, Germany
96-well-plate	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Blue dead cell stain	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany
牛血清アルブミン	GE Healthcare, Freiburg, Germany		Fraction V, pH 7.0
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		28G,30G
CD115	eBioscience, San Diego, USA	12-1152
CD11b	eBioscience, San Diego, USA	53-0112
細胞培養皿	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		キャップ付き, 滅菌
Centrifuge	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany		Allegra®X-15R遠心分離機
脱毛クリーム	Veet、マンハイム、ドイツ
消毒剤	Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany		Kodan Tinktur forte
使い捨てメス No.10	羽毛安全カミソリ Co.Ltd、大阪、日本
EDTA	Sigma Aldrich、ハンブルク、ドイツ
エタノール 96%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken、ドイツ
抽出ユニット Pipetus	Hirschmann Laborgeräte GmbH &Co.KG、エバーシュタット、ドイツ
F4 / 80	AbD Serotec、Düドイツ sseldorf	MCA497APC
FACSバッファ	単一コンポーネント		PBS、0.5%BSA、0.1%NaN3
FACSデバイス	Becton、Dickinson and Company、Franklyn Lakes、ニュージャージー州、米国		BD FACS Canto II
FACSチューブ	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® ピペット	Becton Dickenson Labware, NY, USA
Fetal calf serum	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine ps,	Rubis, Stabio, Switzerland
Gloves	Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Gr1	eBioscience, San Diego, USA	53-5931
ヒーティングプレート	Labotect GmbH、Göttingen, ドイツ		ホットプレート062
インキュベータ	ーEwald Innovationstechnik GmbH、バート・ネンドルフ、ドイツ		、Incu安全
イソフルラン	Baxter Deutschland GmbH、Unterschleißハイム、ドイツ
光学顕微鏡	Carl Zeiss SMT GmbH、オーバーコッヘン、ドイツ		軸方向40 >C
マクロファージコロニー刺激因子	Sigma Aldrich, ハンブルク, ドイツ	SRP3110
機械式加振機	IKA、シュタウフェン、ドイツ		ms2 ミニ加振機
Medium 199	PAA Laboratories GmbH、Pasching、オーストリア		37°Cで暖かい;Cウォーターバス使用前
マイクロ試験管	Eppendorf AG, ハンブルク, ドイツ
微生物学的作業台	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany		Hera safe
単球洗浄緩衝液	単一成分		PBS、0.5%BSA、2 mM EDTA
マウス拘束装置	さまざまな
NaCl	Berlin Chemie AG、ベルリン、ドイツ
NaN3 (ナトリウム酸)	シグマアルドリッチ、ハンブルク、ドイツ
ノイバウアー計数室	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen、ドイツ
cellsieve	Becton、Dickinson and Company、Franklyn Lakes、ニュージャージー州、米国		細胞ストレーナー、70 & マイクロ;mメッシュサイズ
ニシリン/ストレプトマイシン	シグマアルドリッチ、ハンブルク、ドイツ
リン酸塩緩衝生理食塩水	ライフサイエンステクノロジーズGmbH、ダルムシュタット、ドイツ		pH 7.4、滅菌
ピペットエ	ッペンドルフAG、ハンブルク、ドイツ		10µL / 100&マイクロ;L / 200&マイクロ;l / 1,000µl
ピペッティングヘッド	Eppendorf AG, ハンブルク, ドイツ
血清ピペット	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 5 ml, 10 ml
吸引ユニット	Integra bioscience, Fernwald, Germany		Vacusafe comfort
Surgical Scissors	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Syringe	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		1 ml Omnifix® -F インスリン注射器
キャップ付きチューブ	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany		15 ml/50 ml Cellstar tubes
Warm water bath	Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany		Julabo SW22