여기에서는 번역 응용을 위해 이질적인 골수에서 다량의 쥐 단핵구를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 다른 방법과 비교했을 때, 이 새로운 방법은 높은 구배 자기 세포 분리(MACS)와 같은 값비싼 방법을 피함으로써 희생되는 동물의 수를 줄이고 비용을 절감하는 데 도움이 됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
백혈구의 아형이자 대식세포의 전구자인 단핵구는 유기체의 많은 중요한 과정에 관여하며 종종 생물 의학의 다양한 분야의 주제입니다. 아래에 설명된 방법은 이질적인 골수에서 쥐 단핵구를 분리하는 간단하고 효과적인 방법입니다.
Balb/c 마우스의 대퇴골과 경골에서 채취한 골수는 인산염 완충 식염수(PBS)로 플러싱하여 채취합니다. 세포 현탁액은 대식세포-콜로니 자극 인자(M-CSF)로 보충되고 단핵구의 접착에 의한 분화를 방지하기 위해 초저 부착 표면에서 배양됩니다. 단핵구의 특성과 분화는 다양한 간격으로 특성화됩니다. CD11b, CD115 및 F4/80과 같은 마커를 사용하는 FACS(Fluorescence activated cell sorting)는 표현형 분석에 사용됩니다. 재배가 끝나면 현탁액은 45%± 12% 단핵구로 구성됩니다. 접착성 대식세포를 제거하면 순도를 최대 86%± 6%까지 높일 수 있습니다. 분리 후 단핵구는 다양한 방법으로 활용될 수 있으며, 생체 내 전달을 위한 가장 효과적이고 일반적인 방법 중 하나는 꼬리 정맥 주사입니다.
이 분리 및 적용 기술은 특히 염증 또는 면역학 분야에서 마우스 모델 연구에 중요합니다. 단핵구는 또한 마우스 질병 모델에서 치료적으로 사용할 수 있습니다.
서론
단핵구의 분리는 많은 in vitro 및 in vivo 연구에서 중요하고 중요합니다. 이 세포는 말초 동맥 질환, 관상 동맥 심장 질환 또는 기타 허혈성 질환과 같은 질병의 표적이 되는데, 이는 측부 혈관 성장이 국소 염증에 의해 강하게 주도되기 때문입니다. 염증 반응에는 내피 활성화 및 백혈구(주로 단핵구)의 국소 동원이 포함되며, 이 백혈구는 대식세포로 성숙하고 여러 성장 인자를 분비하여 동맥이 기능적 측부 동맥으로 재형성되도록 유도함으로써 고도의 동맥 생성 환경을 조성합니다1-3. 단핵구는 또한 수지상 세포로 성숙하여 면역학 연구4,5 및 암 연구6,7에 자주 사용됩니다.
말초 혈액에서 단핵구를 분리하는 접근법에서 문제가 되는 것은 8 대부분의 분석에서 충분한 양의 단핵구를 생산하는 데 필요한 많은 수의 기증 동물입니다. 이전 프로토콜은 단핵구를 분리할 때 MACS9를 통한 밀도 구배 원심분리 및 세포 고갈과 같은 방법을 설명합니다. 그러나, 이러한 기술은 단핵구의 특성과 기능을 변화시킬 수 있으며, 이는 해석의 어려움을 초래할 수 있습니다10,11. 또한 이러한 방법은 어렵고 실험 재현성을 감소시킬 수 있습니다.
이 프로토콜의 목표는 많은 양의 골수 유래 단핵구를 생성하는 간단하고 비용 효율적인 방법을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜에 의해 얻어진 11 x 106 ± 3 x 106 세포의 높은 세포 수율로 인해 골수 유래 단핵구를 분리하는 동안 필요한 마우스 수를 크게 줄일 수 있습니다. 이 절차는 위에서 언급한 것처럼 비싸고 복잡한 기술을 사용하지 않고도 최소한의 시간 내에 완료할 수 있습니다. 여기에서는 기증자 마우스의 천연 골수 현탁액에서 단핵구를 추출하고, 초저 부착 플레이트에서 현탁액을 배양하고, 용액에 20ng/ml M-CFS를 보충합니다. 배양 5일차에 세포를 수확하고 특성화하여 기능적 특성과 표현형 특성을 확인합니다.
동맥 형성 분야의 실험의 경우, 이러한 골수 유래 단핵구를 마우스에 정맥 이식하는 것이 전신 약물 전달의 효과적인 방법이며, 이는 일반적인 말초 동맥 질환 모델에서 대퇴 동맥 결찰술과 결합할 수 있습니다.
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프로토콜
이 연구는 동물 보호 (24D-9168.11-1 / 2008-24)에 대한 독일 법률 제 8 항에있어서, 작센 및 작센 - 안할 트, Regierungspraesidium 드레스덴 / 할레의 국가의 허가 하였다.
1 세포 분리
대퇴골과 경골의 1.1 준비
- 폐쇄함에 이소 플루 란을 기화 5 % 이소 플루 란을 이용하여 농도 마우스를 마취. 마우스가 3 초 동안 이동을 중지 한 후, 자궁 경부 전위를 수행합니다.
- 에탄올 (96 %)로 두 다리를 소독. 피부와 근육을 제거하고 멸균 메스와 뼈를 분리합니다.
- 사타구니 피부 절개로 시작하고 내과쪽으로 절개를 확장하고 낮은 송아지 주위 피부의 원형 절개를 수행합니다. 근위을 벗겨 완전히 다리의 피부를 제거합니다.
- 날카로운 메스와 대퇴골에서 대퇴사 두근 근육을 분리, 전방 peroneus 모두 제거과 비복근의 근육 그룹 및 위치 및 인대를 해부하여 고관절에서 다리 관절이 어긋나 다.
- 전방 시작하고 신중하게하여 관절을 disarticulating, 다리를 회전하고 인대에 병행하여 관절 주위를 진행합니다.
- 무균 세포의 준비를 보장하기 위해 90 초 최소 96 % 에탄올로 대퇴골과 경골을 씻으십시오. 에탄올 나머지 씻어 멸균 PBS로 세척 과정을 계속합니다.
참고 : 모든 후속 단계는 오염을 방지하기 위해 멸균해야합니다.
골수의 1.2 수확
- 대퇴골과 경골의 축에 접근하도록 미세 가위 뼈 각각의 근위 및 원위 단부를 잘라. 이 뼈는 쉽게 깰 때문에,이 단계에주의하십시오.
- 따뜻한 배지로 뼈에 플러시 (M199 + 10 % 소 태아 혈청 (FCS)을, + 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신). 멸균 28 G 바늘, 1 ML의 주사기, 10 ~ 15 ml의 매체 당 사이에 사용린스 뼈.
- 미세 집게로 뼈를 잡고는 반투명를 꺼질 때까지 하나 하나 씻어. 조심스럽게 세포 스트레스를 최소화하기 위해 주사기 플런저의 단부에 압력을 적용한다.
- 70 ㎛의 나일론 웹을 통해 골수를 여과하고 여액을 수집. 골수의 최대 양을 추출하려면, 근위 끝에서 반복 씻어.
- PBS와 체를 씻어 여과 액을 수집합니다. 조심스럽게 파편과 부드러운 교반과 피펫 팅에 의해 세포 대기업을 제거.
1.3 재배
- RT에서 10 분 동안 250 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 매체의 약 25 ml의 세포를 재현 탁. 한 번 반복합니다.
- 2 차 세척 공정 후, 6 ㎖의 배지에서 세포를 재현 탁. 트리 판 블루 50 μL와 세포 용액 50 μl를 섞는다. 광학 현미경 하에서 계수 챔버에서 세포를 카운트. (C)의 수를 계산이 식을 이용하여 용액의 ELL :
- 플레이트의 저부에 영구 부착을 방지하기 위해 6 웰 초저 부착면 플레이트상에서 세포를 시드. 물론 당 최대 6 ml로 1 ㎖ 당 10 6 세포의 농도를 사용합니다.
- 세포 분화를 촉진하기 위해 20 NG / ㎖의 M-CSF와 서스펜션을 보완.
- 배양은 37 ℃에서 5 일간 세포를 5 % 이산화탄소 및 매일 관찰한다.
세포의 1.4 수확
주의 :이 단계는 얼음을 수행하여야한다. 따라서 1.4.1 또는 1.4.2 중 하나를 진행합니다.
- 이 시점에서, 그들은 초저 부착면 판하더라도 배양 플레이트에 부착 차별화 된 대 식세포를 포함한 전체 배양 수확.
- 부드러운 피펫 팅하여 전체 문화를 수확, 4 ° C PB 용액으로 분리S, 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 2 mM의 EDTA. 잘 모르는 경우 현미경으로 확인 - 플레이트가 부착 세포를 나머지의 명확한 때까지 반복합니다.
- 다른 방법으로, 주로 단핵 세포를 포함하는 현탁액 세포와 상층 액을 수확하여 대 식세포를 폐기합니다.
- EDTA가없는 PBS 용액 및 0.5 % BSA와 함께 비 - 부착 세포 수확. 온화하게 대 식세포를 빠지 방지하기 위해 너무 많은 힘을 가하지 마십시오.
1.5 FACS 분석 (선택 사항)
참고 : MACS의 사용에 의해 CD117 + stem- 및 전구 세포의 세포 현탁액을 고갈시킬 수있다. 이 절차에 대한 제조 업체 프로토콜을 사용합니다.
- 하나가 1.4.1 또는 1.4.2 단계에 따라 세포를 수확.
- 4 ° C에서 10 분 동안 250 XG에서 세포를 원심 분리기 다시이 단계를 반복합니다.
- FACS (b)의 300 μL에 재현 탁 적어도 25 만 셀프로브 당 uffer.
- 96 웰 플레이트 (물론 당 30 μL)에 세포 솔루션을 전송합니다.
- 4 ℃에서 5 분 동안 250 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기.
- 상층 액을 제거하고 각 웰 (사용 제조 업체 희석)에 항체의 25 μl를 추가합니다.
- 단계 후 세포 표현형에 대한 제조 업체 프로토콜 다음 항체 (와 세포 1.5.1-1.5.6. 단핵구 / 대 식세포의 식별을 위해 일반적으로 사용되는 마커는 CD11b, F4 / 80 (그림 3), CD115을 포함 얼룩 (그림 2), GR- 1.
참고 : 셀 솔루션의 또 다른 설명은 CD4, CD8a, 중 CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G 및 CD192 같은 마커를 사용하는 것이 좋습니다. 휴대 특성은 이전 12 설명했다. - 4 ° C에서 20 분 동안 프로브를 품어.
- 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 250 XG에 프로브 및 FACS 완충액 200 μL에 재현 탁은. 반복 일두 번 단계입니다.
- FACS 튜브에 프로브를 전송하고 FACS 분석 (12)을 수행합니다.
- 세포 분화를 분석 일 0, 3 및 5에서 FACS 분석을 수행한다 (12).
2. 꼬리 정맥 주입
2.1 준비
- 약 10 분 동안 37 ℃에서 가열 플레이트에 동물을 따뜻하게. 과열 징후를 인식 할 수 승온하면서 동물을 관찰한다.
- NaCl을 150 μL에, 단계 1.1 및 1.4에 고립 된 단핵 세포를 재현 탁하고, 30G 바늘을 1 ml의 인슐린 주사기로 세포를로드합니다. 가볍게 모든 단핵 세포가 주입 보장하기 위해 주사기를로드하기 전에 솔루션을 소용돌이. 항상 열 매개 부착 및 단핵구의 활성화를 방지하기 위해 얼음에 세포를 처리합니다.
2.2 금지
- 정맥 주사에 대한 마우스를 선택할 때 우리에 다른 쥐를 방해하지 마십시오.
- 제한 수단에 마우스를 놓습니다. 너무 많은 홍보를하지 마십시오essure는 뒷다리에주의합니다. (그림 4)
참고 : 다른 방법으로, 동물의 스트레스없는 취급을 보장하기 위해 전신 마취를 사용합니다. - 마우스가 제한 수단을 닫기 전에 호흡 공간이 있는지 확인하십시오.
2.3 주입
- 소독제로 주사 부위를 소독. 마우스의 꼬리에 스프레이를 최소한 1 분간 방치 할 수 있습니다.
- 혈관의 가시성을 위해, 주입 부위의 위 측면 꼬리쪽으로 약간 힘을인가하여 꼬리 정맥 혈류를 중지.
- 주입하기 전에 꼬리를 90도 돌립니다. (그림 5)
- 45도 각도로 주입한다. 천천히 주입 및 g 당 최대 5 μl의 해치는 동물을 피하기 위해.
- 실패한 주입의 표시이다 물집이 있으면 즉시 중단하고 더 근접하게 주사를 반복합니다.
- 부드러운 P를 적용하여 사출 측 지혈약 1 분 동안 ressure.
- 프로 시저의 끝에서, 리 트랙터를 열고 그 장에 마우스를 배치했다.
- 20 분은 동물이 주입에 의해 피해를 입지되지 않아 흉골 드러 누움이 유지되도록하는 마우스를 관찰합니다. 마우스가 충분한 의식을 차릴 때까지 관찰의 시간을 연장합니다. 완전히 회복 된 후에 만 다른 동물의 회사에 마우스를 돌려줍니다.
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결과
뮤린 골수로부터 추출 된 세포 용액은 다양한 종류의 세포로 구성된다. 주요 종류의 세포는 림프구, 과립구와 단핵구 수 있습니다. 세포 유형은 분화 5 일 후에 수확 네이티브 현탁 세포도 1에 도시되어 크기 및 입도 (granularity)에 의해 추정 될 수있다. 재배 동안 이동 셀룰러 조성합니다. 그러나 인구의 정확한 분류는 세포 마커의 독특한 표현에 의존해야합니다.
MPS-시스템의 셀들을 식별하는 데 가장 중요한 마커는 M-CSF 수용체로서 작용하고 특별히 전구 세포, 단구, 대 식세포 및 단핵구상에서 발현되는 CD115이다. 따라서, MPS-독특한 서브 세트를 식별하는 데 사용되지 않을 수도 있지만 확실 단핵구 / 대 식세포로 분화 구동 세포의 절대 양을 추정 할 수있다. 다른시 CD115 발현의 타임 라인은 그림 2를 참조하십시오entiation.
성숙 마커...
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토론
우리는 골수로부터 단핵구 뮤린 다량 격리시키는 간단하고 비용 효율적인 방법을 설명한다. 단구 수율 X10 6 5 1.4을 수득 말초 혈액을 사용하는 다른 프로토콜에 비해, 우리는 단일 공여자 마우스에서 11 × 106 ± 3 × 106 단핵구 높은 수율을 얻을 수있다.
이 방법의 문제점을 고려할 때, 비 멸균 조건 하에서 작업 할 때 오염 가능성을 언급하는 것이 중요하다. 헹굼 다음 세척 단계가 제대로 따라 박테리아 및 진균에 의한 오염 가능성이없는 경우이다. 또한, 골수 과립구, 림프구 및 적혈구 세포를 포함 이종 세포 현탁액로 구성되어 있습니다. 일반적으로 인해 이들 세포 성장 인자의 부족 일 2와 3 사이의 재배 사라진다. 성장 인자 분화 구동 후 마크로파지는 오염의 주요 원인이다. T를 유지대 식세포 및 단핵 세포의 분화를 최소화하기 위해, 초저 부착 플레이트의 사용과 전술 한 세척 단계가 중요 낮은 식세포 그...
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 DFG(Deutsche Forschungsgemeinschaft, 독일 연구 재단) SFB 854(Sonderforschungsbereich, 공동 연구 센터)의 지원을 받았습니다.
기술 지원을 해 주신 Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke University Magdeburg, Magdeburg, 에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 6-웰-초-저-첨부 플레이트 | Corning Incorporated, NY, USA | 6-웰-초-첨부 플레이트, 캡 포함, 멸균 | |
| 8-12주, 수컷, balb/c 마우스 | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| 96웰 플레이트 | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Blue dead cell stain | Life technologies GmbH, 다름슈타트, 독일 | ||
| 소 혈청 알부민 | GE Healthcare, Freiburg, Germany | Fraction V, pH 7.0 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 28G, 30G | |
| CD115 | eBioscience, San Diego, USA | 12-1152 | |
| CD11b | eBioscience, San Diego, USA | 53-0112 | |
| 세포 배양 접시 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 포함, 멸균 | |
| 원심분리기 | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra® X-15R 원심분리기 | |
| 탈모 크림 | Veet, Mannheim, Germany | ||
| 소독제 | Schü LKE& Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | Kodan Tinktur forte | |
| 일회용 메스 No.10 | 깃털 안전 면도기 Co.Ltd, 오사카, 일본 | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, 함부르크, 독일 | ||
| 에탄올 96% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü cken, 독일 | ||
| 추출 장치 Pipetus | Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co.KG, 에버슈타트, 독일 | ||
| F4/80 | AbD Serotec, Dü 독일 셀도르프 | MCA497APC | |
| FACS 버퍼 | 우리 그룹에서 단일 구성 요소 | PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3 | |
| sub>FACS 장치로 | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA BD | FACS Canto II | |
| FACS 튜브 | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Falcon® 피펫 | Becton Dickenson Labware, NY, USA | ||
| 태아 송아지 혈청 | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine binps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Gloves | Rö sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Gr1 | eBioscience, San Diego, USA | 53-5931 | |
| 가열판 | 라보텍트 GmbH, Gö 팅겐, 독일 | 핫 플레이트 062 | |
| 인큐베이터 | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Incu safe | |
| Isofluran | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleiß heim, 독일 | ||
| 가벼운 현미경 | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, 독일 | Axiovert 40 ° C | |
| 대식세포-군집 자극 인자 | Sigma Aldrich, 함부르크, 독일 | SRP3110 | |
| 기계식 쉐이커 | IKA, 슈타우펜, 독일 | ms2 미니쉐이커 | |
| Medium 199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | Warm in 37 ° C 사용 전 수조 | |
| 마이크로 시험관 | Eppendorf AG, 함부르크, 독일 | ||
| 미생물 작업대 | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Monocyte wash buffer | 단일 구성 요소 | PBS, 0.5% BSA, 2mM EDTA | |
| 마우스 억제 | 다양한 | ||
| NaCl | Berlin Chemie AG, 베를린, 독일 | ||
| NaN3 (sodium acide) | Sigma Aldrich, 함부르크, 독일 | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö nigshofen, 독일 | ||
| 나일론 cellsieve | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | Cell strainer, 70 µ m 메쉬 크기 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 시그마 Aldrich, 함부르크, 독일 | ||
| 인산염 완충 식염수 | Life technologies GmbH, 다름슈타트, 독일 | pH 7.4, 멸균 | |
| 피펫 | Eppendorf AG, 함부르크, 독일 | 10µ L/100&마이크로; L/200&마이크로; l/1,000&마이크로; l | |
| 피펫팅 헤드 | Eppendorf AG, 함부르크, 독일 | ||
| 혈청학 피펫 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 5 ml, 10 ml | |
| 흡입 장치 | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| 주사기 | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 1 ml Omnifix® -F insuline syringe | |
| Tubes with cap | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | 15 ml/50 ml Cellstar tubes | |
| Warm water bath | Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany | Julabo SW22 |
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