Method Article

مقايسة متعدد الكشف عن الملاريا بث البعوض

DOI:

10.3791/52385

⸱

February 28th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, School of Veterinary Medicine, University of California - Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البعوض الناقل للملاريا له عدد من الخصائص الوبائية المهمة التي لا يمكن اكتشافها إلا باستخدام التقنيات الجزيئية. باستخدام منصة التنميط الجيني SNP القائمة على MALDI-TOF ، قمنا بتطوير اختبار للكشف في وقت واحد عن سمات رئيسية متعددة (الأنواع ، ومقاومة المبيدات الحشرية ، وعدوى الطفيليات ، واختيار المضيف) لناقلات الملاريا.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويضم المجمع الأنواع الأنوفيلة الغامبية الملاريا رئيسيا نقل البعوض في أفريقيا. لأن هذه الأنواع هي بهذه الأهمية الطبية، وعادة ما تتميز بعدة صفات باستخدام المقايسات الجزيئية للمساعدة في الدراسات الوبائية. وتشمل هذه الصفات تحديد الأنواع، ومقاومة الحشرات، حالة عدوى الطفيليات، وتفضيل المضيف. منذ السكان من مجمع الأنوفيلة الغامبية لا يمكن تمييزها شكليا، يتم استخدام سلسلة البوليميراز رد فعل (PCR) تقليديا لتحديد الأنواع. مرة واحدة ومن المعروف أن الأنواع، ويتم تنفيذ عدة فحوصات المصب بشكل روتيني لتوضيح المزيد من الخصائص. على سبيل المثال، والطفرات المعروفة باسم KDR في جين الفقرة تمنح مقاومة ضد DDT والمبيدات الحشرية البيروثرويدات. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام فحوصات انزيم مرتبط المناعي (ELISAs) أو المتصورة كشف DNA الطفيلي المقايسات PCR للكشف عن الطفيليات الموجودة في الأنسجة البعوض. وأخيرا، فإن combinatioن من PCR وتقييد انزيم هضم يمكن استخدامها لتوضيح تفضيل المضيف (على سبيل المثال، الإنسان مقابل دم الحيوانات) من خلال فحص وbloodmeal البعوض لDNA المضيف محددة. قمنا بتطوير فحص متعددة كشف (MDA) الذي يجمع بين كل من المقايسات المذكورة أعلاه في واحد متعدد 33SNPs التنميط الجيني رد فعل لمدة 96 أو 384 عينات في وقت واحد. لأن MDA يتضمن علامات متعددة الأنواع، والكشف عن المتصورة، وتحديد الدم المضيف، يتم تقليل احتمال توليد ايجابيات كاذبة أو السلبيات كثيرا من فحوصات السابقة التي تتضمن علامة واحدة فقط لكل سمة. هذا الاختبار قوي وبسيط يمكن الكشف عن هذه الصفات البعوض الرئيسية على نحو فعال من حيث التكلفة وفي جزء من الوقت من المقايسات القائمة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ارابينسيس الأنوفيليس، الأنوفيليس coluzzii والأنوفيلة الغامبية هي ناقلات الرئيسية المسؤولة عن انتقال الملاريا في أفريقيا 1. هذه الأنواع الثلاثة هي شكليا تمييزه 2 و يمكن إلا أن يكون ميزت من قبل المقايسات الجزيئية 3-9. وبالإضافة إلى ذلك، هناك العديد من المقايسات المصب أجريت بشكل روتيني لمساعدة الوراثة الوبائية والسكان الدراسات. وتشمل هذه (1) مقايسة التنميط الجيني لأنواع جديدة الجزر 10-12، (2) مقايسة التنميط الجيني الاعتراف تعدد الأشكال غير مرادفة في 1014 عشر من الأحماض الأمينية موقف كودون من الفقرة الجين (المقاومة تدق إلى أسفل، أو KDR، SNP) ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. PCR التضخيم

  1. خلط جميع الاشعال PCR (انظر الجدول تكميلية S1) في microtube 1.5ml. كل SNP اثنين الاشعال (إلى الأمام وعكس). تأكد من أن تركيز الأسهم من كل التمهيدي PCR يتم الاحتفاظ بمبلغ 100 ميكرومتر. تقديم ما يكفي من مزيج التمهيدي ل500-1،000 ردود الفعل للحد من pipetting لخطأ والوقت على مقاعد البدلاء (انظر الجدول التكميلي S2). إذا رغبت في ذلك، وإعداد مأخوذة عن 100-200 ردود الفعل في أنبوب وتخزينها في -20 ° C.
  2. إعداد PCR الكوكتيل كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة (الجدول 1). ويشمل حجم ردود ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد الأنواع:

وفيما يلي 5 النيوكلوتايد تحديد معا ثلاثة أنواع (A. ارابينسيس، A. coluzzii وA. الغامبية) (جدول 4). إذا عينة ليست واحدة من الأنواع الثلاثة، وتعدد الأشكال الثلاثة (01073-213، 04679-157 و10313 -052) تفشل لتضخيم.

KDR النمط الجيني لاستنتاج مقاومة الحشرات:

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتكون MDA من خمس خطوات رئيسية هي: PCR التضخيم، رد فعل قلوية الروبيان الفوسفاتيز (SAP)، والإرشاد SNP، تكييف المنتج التمديد، وبمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز / التأين - الوقت الرحلة (MALDI-TOF) قياس الطيف الكتلي 33-37. أول خطوة التضخيم PCR تضخيم DNA المرافقة كل SNP بحيث DNA قالب يكفي سوف تكون متوفرة في خطوة التمديد SNP. رد فعل SAP يحيد dNTPs غير المستخدمة والتي يمكن أن تتداخل مع خطوة تمديد SNP التالية. تمديد SNP ينطوي على تمديد التمهيدي واحد في موضع SNP والنيوكليوتيدات فا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكاترة. أنتوني كورنيل ولورا نوريس في جامعة كاليفورنيا في ديفيس والدكتور كاتارينا Kreppel في جامعة غلاسكو لتوفير عينات البعوض من تنزانيا. نشكر السيدة سميتا داس والدكتور دوغلاس نوريس من مدرسة جونز هوبكنز للصحة العامة لتبادل عينات البعوض من زامبيا. كما نشكر السيد لي V. ميون في مختبر علم الوراثة البيطرية للتدريب على تصميم الفحص. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة منح R01AI 078183 وR21AI062929.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MassARRAY Analyzer CompactSequenomMT9MALDI-TOF قياس الطيف الكتلي للتطبيقات الجينومية لتحليل الأحماض النووية.
MassARRAY NanodispenserSequenomRS1000ينقل منتجات تفاعل iPLEX المكتملة إلى
كاشف التنميط الجينيGold Sequenom10158الكواشف المستخدمة في اختبار iPLEX بما في ذلك مجموعة SAP.
مجموعة SpectroCHIP iPLEX

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
  2. Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gamb....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Anopheles gambiaeMalaria TransmissionMultiplex PCR AssaySNP GenotypingSpecies IdentificationInsecticide ResistanceParasite DetectionHost Preference AnalysisBloodmeal ScreeningRestriction Enzyme Digest

Related Articles