Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.
ويضم المجمع الأنواع الأنوفيلة الغامبية الملاريا رئيسيا نقل البعوض في أفريقيا. لأن هذه الأنواع هي بهذه الأهمية الطبية، وعادة ما تتميز بعدة صفات باستخدام المقايسات الجزيئية للمساعدة في الدراسات الوبائية. وتشمل هذه الصفات تحديد الأنواع، ومقاومة الحشرات، حالة عدوى الطفيليات، وتفضيل المضيف. منذ السكان من مجمع الأنوفيلة الغامبية لا يمكن تمييزها شكليا، يتم استخدام سلسلة البوليميراز رد فعل (PCR) تقليديا لتحديد الأنواع. مرة واحدة ومن المعروف أن الأنواع، ويتم تنفيذ عدة فحوصات المصب بشكل روتيني لتوضيح المزيد من الخصائص. على سبيل المثال، والطفرات المعروفة باسم KDR في جين الفقرة تمنح مقاومة ضد DDT والمبيدات الحشرية البيروثرويدات. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام فحوصات انزيم مرتبط المناعي (ELISAs) أو المتصورة كشف DNA الطفيلي المقايسات PCR للكشف عن الطفيليات الموجودة في الأنسجة البعوض. وأخيرا، فإن combinatioن من PCR وتقييد انزيم هضم يمكن استخدامها لتوضيح تفضيل المضيف (على سبيل المثال، الإنسان مقابل دم الحيوانات) من خلال فحص وbloodmeal البعوض لDNA المضيف محددة. قمنا بتطوير فحص متعددة كشف (MDA) الذي يجمع بين كل من المقايسات المذكورة أعلاه في واحد متعدد 33SNPs التنميط الجيني رد فعل لمدة 96 أو 384 عينات في وقت واحد. لأن MDA يتضمن علامات متعددة الأنواع، والكشف عن المتصورة، وتحديد الدم المضيف، يتم تقليل احتمال توليد ايجابيات كاذبة أو السلبيات كثيرا من فحوصات السابقة التي تتضمن علامة واحدة فقط لكل سمة. هذا الاختبار قوي وبسيط يمكن الكشف عن هذه الصفات البعوض الرئيسية على نحو فعال من حيث التكلفة وفي جزء من الوقت من المقايسات القائمة.
ارابينسيس الأنوفيليس، الأنوفيليس coluzzii والأنوفيلة الغامبية هي ناقلات الرئيسية المسؤولة عن انتقال الملاريا في أفريقيا 1. هذه الأنواع الثلاثة هي شكليا تمييزه 2 و يمكن إلا أن يكون ميزت من قبل المقايسات الجزيئية 3-9. وبالإضافة إلى ذلك، هناك العديد من المقايسات المصب أجريت بشكل روتيني لمساعدة الوراثة الوبائية والسكان الدراسات. وتشمل هذه (1) مقايسة التنميط الجيني لأنواع جديدة الجزر 10-12، (2) مقايسة التنميط الجيني الاعتراف تعدد الأشكال غير مرادفة في 1014 عشر من الأحماض الأمينية موقف كودون من الفقرة الجين (المقاومة تدق إلى أسفل، أو KDR، SNP) 13 -18، (3) كشف الطفيلي PCR 19-23، و (4) لفحص الحمض النووي المضيف محددة في midguts البعوض 24،25.
وضعنا مقايسة متعددة كشف (MDA) الذي يجمع بين كل هذه المقايسات إلى رد فعل واحد مع تعدد الإرسال مرماه من هدفalyzing الخصائص المهمة وبائيا لنواقل الملاريا في أفريقيا. ويشمل الفحص MDA علامات متعددة للكشف عن (1) أنواع (A. ارابينسيس، A. الغامبية، A. coluzzii، أو غيرها (أي من) ثلاثة)، (2) مقاومة الحشرات ممثلة في KDR تعدد الأشكال (سواء L1014F وL1014S) ، (3) وجود اثنين من طفيليات الملاريا الكبرى، المتصورة المنجلية وP. النشيطة، و (4) مصدر الدم من الطيور وستة المضيفين الثدييات.
تقليديا، أجريت هذه المقايسات في التفاعلات منفصلة البلمرة المتسلسل. عندما تتم كل هذه المقايسات باستخدام منصة PCR التقليدية، فإنه يتطلب إجراء فحوصات 8-10 PCR رد فعل والمرافق هلام الخطوات الكهربائي. كل رد فعل PCR الفردية من الإعداد إلى النتائج توثيق يأخذ 4-5 ساعة، في حين أن طريقة MDA المقدمة هنا يستغرق حوالي 5 ساعة في مجملها. وهذا يعادل وفورات بنسبة 90٪ في تكاليف العمالة وحدها. قدم MDA هنا يكلف 5 $لكل عينة إلى التركيب الوراثي جميع النيوكلوتايد 33. هذا هو إلى حد كبير أقل تكلفة من فحوصات القائم على هلام الاغاروز واحدة، والتي تكلف نحو 1،50 $ لكل عينة. ان فحوصات الكشف عن الخصائص التي تغطيها MDA تتطلب ما لا يقل عن 8-10 المقايسات القائم على هلام الاغاروز منفصلة بتكلفة 12-15 دولارا للعينة. وعلاوة على ذلك، فإن MDA يقلل كثيرا من فرصة لتوليد كاذبة إيجابية أو سلبية من خلال الاستفادة من ثلاثة على الأقل من علامات لكل الطفيليات أو مصدر المضيف الكشف.
منصة نحن المستخدمة لا يقتصر على نواقل الملاريا ولكن يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من التطبيقات مثل الطب، والطب البيطري، والبيولوجيا الأساسية 26-28. الدراسات جمعية أو علم الوراثة السكانية الدراسات التي تنطوي على كبير (في ترتيب 100S) عدد العينات تتطلب متعمقة المقايسات فعالة من حيث التكلفة لفحص علامات متعددة في وقت واحد. يمكن أن معظم الدراسات التي تستخدم اثنين أو أكثر من المقايسات PCR منفصلة تنفيذ MDA للحصول على نتائج أسرع وبتكلفة أقل. </p>
ويتكون MDA من خمس خطوات رئيسية هي: PCR التضخيم، رد فعل قلوية الروبيان الفوسفاتيز (SAP)، والإرشاد SNP، تكييف المنتج التمديد، وبمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز / التأين – الوقت الرحلة (MALDI-TOF) قياس الطيف الكتلي 33-37. أول خطوة التضخيم PCR تضخيم DNA المرافقة كل SNP بحيث DNA قالب يكفي ?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكاترة. أنتوني كورنيل ولورا نوريس في جامعة كاليفورنيا في ديفيس والدكتور كاتارينا Kreppel في جامعة غلاسكو لتوفير عينات البعوض من تنزانيا. نشكر السيدة سميتا داس والدكتور دوغلاس نوريس من مدرسة جونز هوبكنز للصحة العامة لتبادل عينات البعوض من زامبيا. كما نشكر السيد لي V. ميون في مختبر علم الوراثة البيطرية للتدريب على تصميم الفحص. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة منح R01AI 078183 وR21AI062929.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids. |
MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP |
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set | Sequenom | 10158 | Reagents used for iPLEX assay including SAP kit. |