Abstract
जल्दी पता लगाने के ज्यादातर बीमारियों का सफल इलाज करने के लिए एक महत्वपूर्ण है, और कैंसर के कई प्रकार के निदान और उपचार के लिए विशेष रूप से आवश्यक है। उपयोग किया सबसे आम तकनीकों जैसे चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), पोजीट्रान एमिशन स्थलाकृति (पीईटी), और गणना स्थलाकृति (सीटी) के रूप में तौर तरीकों इमेजिंग और रोग की शारीरिक संरचना को समझने के लिए उपयोगी हैं, लेकिन केवल एक बार प्रदर्शन हर चार के लिए किया जा सकता है कर रहे हैं इमेजिंग एजेंटों और कुल लागत के उपयोग की वजह से छह सप्ताह। मन, इस तरह के उपचार प्रोटोकॉल में क्रांतिकारी बदलाव होगा, बीमारी और / या चिकित्सक के कार्यालय में उपचार की प्रभावकारिता के मंच का मूल्यांकन करने और एक समय पर ढंग से ऐसा करते हैं जो biosensors, के रूप में तकनीक, "देखभाल के बिंदु" का विकास। एक के रूप में इस के साथ जैविक रूप से प्रासंगिक अणुओं दो का पता लगाने के लिए ferrocene आधारित biosensors की खोज के लिए एक साधन, तरीकों के साथ साथ वर्णित ferrocene बायोटिन जैव conjugates के निर्माण करने के लिए विकसित किए गए। इस रिपोर्ट में एक सोने की सतह पर स्थिर किया जा सकता है कि एक बायोटिन ferrocene-सिस्टीन प्रणाली पर ध्यान दिया जाएगा।
Introduction
Biosensors चयनात्मक विश्लेषण के लिए मंच के रूप में biomolecular मान्यता प्रौद्योगिकी को रोजगार और उनकी विशिष्टता, गति, और कम लागत के लिए उपयोग किया जाता है कि छोटे उपकरणों रहे हैं। Biomolecules के पता लगाने के लिए विद्युत biosensors के कारण उनकी सादगी, लागत प्रभावशीलता, और उच्च संवेदनशीलता को इस क्षेत्र में सबसे आगे रहे हैं। इन सेंसरों के 1,3 सामान्य शरीर रचना ब्याज की जैविक मार्कर के लिए विशिष्ट एक मान्यता अणु से लैस एक इलेक्ट्रोड है । मान्यता अणु द्वारा बायोमार्कर के बंधन साधारण माप से पता लगाया जा सकता है कि संभावित या वर्तमान की एक स्थानीय परिवर्तन में परिणाम है। एंजाइमों से 4-8 एंटीबॉडी, 9-12 पूरे कोशिकाओं, 13-16 रिसेप्टर्स, 17-20 पेप्टाइड्स 21-23 और डीएनए 24 और काफी हद तक बड़े, जैविक अणुओं पर ध्यान केंद्रित किया है रेंज कर सकते हैं मान्यता आधा भाग तारीख करने के लिए। 25-28 रिसर्च इस क्षेत्र में प्रयास immunosensors whe पर मुख्य रूप से ध्यान केंद्रित किया हैएक इम्युनोग्लोबुलिन एक redox सक्रिय कोर के साथ स्थिर (जैसे ferrocene के रूप में) और ब्याज की एक एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए किया जाता है फिर से। इन अध्ययनों प्रतिजन / एंटीबॉडी के उपयोग से उत्पन्न होने वाली जटिलताओं से उत्पन्न होने के कारण गरीब सटीक और समय की खपत के लिए नैदानिक अनुप्रयोगों से बाहर रखा गया है। 1,3 बढ़ते ध्यान जैव चिकित्सा के छोटे अणुओं का पता लगाने (कम से कम 1 किलो / मोल) पर ध्यान केंद्रित किया है , भोजन और राष्ट्रीय सुरक्षा के अलावा पर्यावरण ब्याज। 29 biosensor उपकरणों का सबसे अच्छा ज्ञात उदाहरण एक जेबी Amperometric मीटर करने के लिए युग्मित स्क्रीन मुद्रित एंजाइम इलेक्ट्रोड है, जो आत्म परीक्षण ग्लूकोज मॉनिटर, कर रहे हैं। इन पद्धतियों आमतौर पर ग्लूकोज ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया से उत्पन्न प्रभारी की कुल राशि समय की अवधि में मापा जाता है, जहां एक coulometric विधि का उपयोग। विक्रेय उपकरणों, पोर्टेबल मजबूत और होना चाहिए बड़े पैमाने पर आबादी के लिए सतही उपयोग करने के लिए हाथ से आयोजित की।
ऐसे ferrocene रूप रिडॉक्स टैग necessa हैंसबसे बायोमार्कर आंतरिक रूप से electrochemically सक्रिय नहीं हैं RY समाधान में बायोमार्कर या छोटे अणुओं की विद्युत का पता लगाने प्रदान करते हैं। 30-38 Ferrocene यह विद्युत biosensors में एकीकरण के लिए एक शानदार विकल्प है, जो बनाता electrochemistry के लिए एक स्वर्ण मानक है, कि एक organometallic अणु है। Ferrocene आधारित रेडॉक्स सक्रिय प्रजातियों पहले से ही होने के कारण उनके छोटे आकार, अच्छा स्थिरता, सुविधाजनक सिंथेटिक का उपयोग, आसान रासायनिक संशोधन, रिश्तेदार lipophilicity, और रेडॉक्स ट्यूनिंग की आसानी के लिए काफी ध्यान हुई है। 3,30-42 छोटे अणुओं है ferrocene कोर के आधार पर धातु आयनों और छोटे अणुओं की डिटेक्टरों के रूप में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया। इस तरह के biomolecules के रूप में बड़ी प्रजाति को लक्षित 32-38,43 सिस्टम एक विद्युत की सतह पर एम्बेडेड किया गया है कि ferrocene डेरिवेटिव के लिए बड़ी एंटीबॉडी या इम्युनोग्लोबुलिन की कुर्की का उपयोग किया है। 1,3,39 प्रत्येक मामले में 44, संभावित और मौजूदा intensiफ़े तृतीय / फ़े द्वितीय रेडॉक्स जोड़ी की Ty इस प्रकार विश्लेष्य अणु की उपस्थिति का संकेत एक नया स्पेक्ट्रोस्कोपी संभाल उत्पादन, आणविक युग्मन पर बदल दिया गया था। यह परिवर्तन cyclopentadienyl छल्ले के पीआई-प्रणाली और लोहे डी कक्षाओं के बीच होता है कि व्यापक ओवरलैप से उठता है। पीआई-प्रणाली संशोधित किया जाता है, यानी, derivatized या, फिर कक्षीय बातचीत करेंगे, बारी में, परिवर्तन प्रतिक्रिया व्यक्त की। इस फ़े कोर को प्रभावित करेगा और फ़े तृतीय / फ़े द्वितीय जोड़े की क्षमता में बदलाव के रूप में देखा जा सकता है। 40,45,46 इन गुणों के एक विद्युत Immunoassay या biosensor में एक बढ़ाता एजेंट के रूप में उपयोग के लिए एक ऐसी प्रणाली आकर्षक बनाते हैं।
Biosensor क्षमता के लिए विशिष्ट ferrocene युक्त सिस्टम का उत्पादन करने के लिए आदेश में यह एक अणु लक्ष्य के लिए विशिष्ट जैव रिसेप्टर के साथ एक सी.पी अंगूठी को संशोधित करने और विद्युत readout या चुनाव के लिए एक आणविक पगहा के रूप में अन्य सी.पी अंगूठी का उपयोग करने के लिए इष्टतम हैtrode (चित्रा 1)। इन विषम ferrocene डेरिवेटिव के संश्लेषण की ओर प्रतिक्रियाओं और अंतरआणविक पार से जोड़ने पर गठित dimeric और polymeric प्रजातियों के गठन के द्वारा चुनौती दी है। 47 हालांकि, एक एमाइड बांड उत्पादन युग्मन रसायन विज्ञान जैविक घटकों जैसे शामिल ferrocene के सरल डेरिवेटिव प्रदान करने के लिए सबसे सीधा रास्ता है पेप्टाइड्स और उनके चयापचयों के रूप में। इसलिए, पहले पेप्टाइड संश्लेषण के लिए Merrifield द्वारा 1950 के दशक में विकसित ठोस चरण तकनीक ferrocene युक्त organometallic यौगिकों के लिए लागू किया जा सकता है। है orthogonally एवजी 1'-Fmoc-एमिनो ferrocene-1-कार्बोक्जिलिक एसिड अणु, एक रिसेप्टर आधा भाग (बायोटिन), विद्युत readout (ferrocene), और immobilizing-संयोजक घटक (सिस्टीन) को शामिल कर सकते हैं कि एक ferrocene प्रणाली के उपयोग के माध्यम से का निर्माण किया और इस के साथ साथ विस्तृत किया गया। इस जैव-साधना के संश्लेषण के लिए एक सोने की सतह पर स्थिरीकरण के लिए साक्ष्य के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चर्चा की है। इस काम के प्रतिनिधिबायोटिन, ferrocene और एक सोने की सतह पर स्थिरीकरण के लिए एक एमिनो एसिड से बना एक प्रणाली की पहली प्रस्तुति टीएस।
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Protocol
बायोटिन एफसी-सिस्टीन 1. संश्लेषण (1)
- ठोस चरण के तरीकों एक राल समयबद्ध निर्माण करने के लिए।
- एक fritted सिरिंज में बायोटिन लोड राल (250 मिलीग्राम, 0.145 mmol) प्लेस और Dimethylformamide (5 एमएल) ड्राइंग और 20 मिनट के लिए एक प्रयोगशाला प्रकार के बरतन पर सिरिंज झटकों से राल प्रफुल्लित। समाधान निष्कासित और एक बार और सूजन Dimethylformamide दोहराएँ।
- झटकों के 10-15 मिनट के द्वारा पीछा सिरिंज Dimethylformamide में 20% piperidine के 4-6 मिलीलीटर जोड़कर Fmoc की रक्षा के समूह निकालें। Piperidine की एक और 4-6 मिलीलीटर के साथ deprotection प्रक्रिया को दोहराएं। ~, 3x dichloromethane 5 मिलीलीटर प्रत्येक मेथनॉल (1: 1), 3x मेथनॉल: dichloromethane (1 1) 3x Dimethylformamide के एक दृश्य, 3x Dimethylformamide साथ राल धो लें। हीटिंग पर नीले रंग की उपस्थिति से सफल deprotection पुष्टि करने के लिए मोतियों की एक छोटा सा नमूना (~ 10) पर एक ninhydrin टेस्ट (+) करें।
- 1'-Fmoc-एमिनो ferrocene-1-कार्बोक्जिलिक एसिड युक्त समाधान मिक्स(203.3 मिलीग्राम, 0.4350 mmol), एक-hydroxybenzotriazole हाइड्रेट (58.8 मिलीग्राम, 0.413 mmol), diisopropyl carbodiimide (0.0673 मिलीग्राम, 0.435 mmol), diisopropyl एथिल एमाइन (0.0757 मिलीग्राम, 0.435 mmol), और एक 4: dichloromethane के एक मिश्रण है और Dimethylformamide। Fritted सिरिंज में इस ड्रा और छह घंटे के लिए एक प्रयोगशाला प्रकार के बरतन पर हिला धीरे। तब सिरिंज से समाधान निष्कासित और पहले से वर्णित के रूप में धो लें।
- युग्मन पुष्टि करने के लिए ऊपर वर्णित के रूप में (-) ninhydrin परीक्षण प्रदर्शन। ninhydrin परीक्षण अभी भी आधा भाग युक्त लोहे की कुर्की से निकाली गई मनका के नारंगी रंग के बावजूद युग्मन की पुष्टि करने में उपयोगी हो सकता है।
- तब Dimethylformamide में 20% piperidine के अलावा द्वारा Fmoc समूह को हटा दें और ऊपर वर्णित के रूप में धोया। ninhydrin टेस्ट (+) Fmoc निकाले जाने की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
- (0.0673 मिलीग्राम Fmoc-Cys (ठ्ठ) से बना एक समाधान ओह (254.8 मिलीग्राम, 0.4350 mmol), एक-hydroxybenzotriazole हाइड्रेट (58.8 मिलीग्राम, 0.4125 mmol), diisopropyl carbodiimide तैयार करें, 0.4350mmol), diisopropyl एथिल एमाइन (0.0757 मिलीग्राम, 0.4350 mmol), और एक 4: dichloromethane और Dimethylformamide का एक मिश्रण। इस सिस्टीन युग्मन कॉकटेल fritted सिरिंज जोड़ें और धीरे छह घंटे के लिए हिला। पहले से वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर धो लें।
- 20% piperidine और धोने के साथ Fmoc घटक को हटाने के बाद, (-) ninhydrin परीक्षण का उपयोग युग्मन की पुष्टि करें। Ninhydrin टेस्ट (+) का उपयोग एमाइन मुक्त टर्मिनल की जाँच करें।
- राल से एक की दरार।
- एक TFA के समाधान (9.45 मिलीग्राम), पानी (0.25 मिलीग्राम), 1,2-ethanedithiol (0.25 मिलीग्राम), और triisopropyl silane (0.1 मिलीलीटर) बनाओ सिरिंज करने के लिए इसे जोड़ने के लिए और 4 घंटे के लिए धीरे हिला।
- एक Eppendorf ट्यूब में जिसके परिणामस्वरूप लाल-भूरे रंग के समाधान लीजिए और धीरे-धीरे हवा की एक धारा का उपयोग कर TFA के लुप्त हो जाना।
- ठंड Diethyl ईथर जोड़ें (~ 15 मिलीलीटर) Eppendorf ट्यूब को कोमल आंदोलन के रूप में होगा, जो एक वेग। Centrifugation के माध्यम से उत्पाद (1 ग्राम, 5 मिनट) पृथक। टीDiethyl ईथर धोने (~ 60 मिलीलीटर कुल) और सेंट्रीफ्यूज की मुर्गी दोहराने चक्र एक लाल / ब्राउन ठोस रूप में एक प्राप्त करने के लिए।
2. विशेषता और एक के विश्लेषण
- पहचान 1 एच (16 स्कैन) और deuterated मेथनॉल (300 μl) और ईएसआई एमएस विश्लेषण में 13 सी एनएमआर (512 स्कैन) का उपयोग चित्रा 2 में दिखाया गया कनेक्टिविटी और संरचना से मेल खाता है की पुष्टि करें।
निम्न परिणाम उम्मीद करते हैं:
1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम (सीडी तीन ओवर ड्राफ्ट) δ / पीपीएम: 1.407-1.684 (एम, 6H), 2.245 (टी, 2H), 2.665-3.150 (एम, 12H), 4.015 (टी, 1H), 4.104 (घ, 2H ), 4.274 (क्यू, 1H), 4.426 (घ, 2H), 4.479 (क्यू, 1H), 4.595 (टी, 1H) और 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रम (सीडी तीन ओवर ड्राफ्ट) δ / पीपीएम: 24.644 (सीएच 2), 25.472 (सीएच 2), 28.051 (सीएच 2), 28.300 (सीएच 2), 35.474 (सीएच 2), 38.698 (सीएच 2), 39.241 (सीएच 2), 39.717 (सीएच 2), 55.340 / 55.538 (सीपी अंगूठी), 60.286 (सीएच), 61.964 (सीएच), 62.521 / 62.821 (सीपी अंगूठी), 66.038 / 66.170 (सीपी अंगूठी), 69.153 / 69.328 (सीपी अंगूठी), 71.468 / 71.593 (सीपी अंगूठी), 76.466 (सीएच), 171.770 (सी ओ =), 175.361 (सी ओ =)।
ईएसआई एमएस (एम / Z): मिला: 639.00 [1 + ना], सैद्धांतिक: 639.1 [1 + ना] + और मानव संसाधन एमएस (एम / Z): मिला: 617.2049 [1 + एच] + सैद्धांतिक: 617.1622 [1 + एच]। - एचपीएलसी, पृथक एक की संरचना पुष्टि करने के लिए मौलिक विश्लेषण करते हैं।
एक सी 8 का उपयोग कर बाहर ले जाने के एचपीएलसी chromatograms 0.5 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर 100% MeOH के साथ चरण स्तंभ उलट। नोट: एचपीएलसी प्रतिधारण टाइम्स थे: 3.198-4.674 मिनट।
एक सोने की सतह पर एक 3. स्थिरीकरण
- कट बहुलक 2 में ~ 0.25 वर्गों में सोने की स्लाइड का समर्थन किया।
- 1 (~ 1 मिमी) की एक डि पानी के घोल के साथ एक 50 मिलीलीटर बीकर भरें।
- बीकर के लिए सोने स्लाइड जोड़ें और एक घड़ी गिलास के साथ कवर किया। सभीओउ गिलास स्लाइड कोई आंदोलन के साथ आरटी पर हे / एन सेते हैं।
- समाधान से सोने की स्लाइड निकालें और हवा में यह सूखा अनुमति देते हैं।
- एक स्थिर निरीक्षण करने के लिए एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (या समतुल्य) का उपयोग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों स्कैनिंग प्राप्त करते हैं।
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Representative Results
एक के राल बाध्य फार्म चित्रा 2 में दिखाया गया है। ferrocene घटक के सहसंयोजक लगाव द्वारा लोहे के अवशोषण के लिए विरोध के रूप में सतत धोने के साथ लगातार और जटिल युक्त एक स्थिर लोहे का संकेत है कि राल मोतियों के लिए एक नारंगी रंग को जन्म देता है राल मनका के खूंटी घटक। एक के राल से मुक्त फार्म राल मोती के रंग में समान है। राल-मोतियों से परिसर के हटाने के बाद, विधियों से उत्पन्न पवित्रता और उपज (68%) ठेठ समाधान कार्यप्रणाली को कहीं बेहतर है। सी 26 के लिए Calcd (मिला) एच 36 दलदल 6 हे 4 एस 2 4TFA: उत्पाद का मौलिक विश्लेषण एक TFA के नमक के रूप में अलग किया गया था पता चला है कि सी, 38.07 (38.90); एच, 3.76 (4.20); एन, 7.83 (7.70)। एक ठेठ प्रतिक्रिया से उत्पन्न उपज (105.1 मिलीग्राम, 68%) मौलिक विश्लेषण परिणामों पर आधारित है। Deuterated मेथनॉल prov में एनएमआर विश्लेषणided 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम (सीडी तीन ओवर ड्राफ्ट) δ / पीपीएम: 1.407-1.684 (एम, 6H), 2.245 (टी, 2H), 2.665-3.150 (एम, 12H), 4.015 (टी, 1H), 4.104 (घ, 2H), 4.274 (क्यू, 1H), 4.426 (घ, 2H), 4.479 (क्यू, 1H), 4.595 (टी, 1H) और 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रम (सीडी तीन ओवर ड्राफ्ट) δ / पीपीएम: 24.644 (सीएच 2), 25.472 (सीएच 2), 28.051 (सीएच 2), 28.300 (सीएच 2), 35.474 (सीएच 2), 38.698 (सीएच 2), 39.241 (सीएच 2), 39.717 (सीएच 2), 55.340 / 55.538 (सीपी अंगूठी) , 60.286 (सीएच), 61.964 (सीएच), 62.521 / 62.821 (सीपी अंगूठी), 66.038 / 66.170 (सीपी अंगूठी), 69.153 / 69.328 (सीपी अंगूठी), 71.468 / 71.593 (सीपी अंगूठी), 76.466 (सीएच ), 171.770 (सी ओ =), 175.361 (सी ओ =)। एचपीएलसी प्रतिधारण टाइम्स थे: 3.198-4.674 मिनट। HPLC विश्लेषण में मनाया कई चोटियों मौलिक विश्लेषण का उपयोग कर ऊपर वर्णित के रूप में एक की TFA के लवण होने की पुष्टि की गई। संरचना के लिए सहसंबद्ध मास स्पेक्ट्रोमेट्री चित्रा 2 में दिखाया गया है: ईएसआई एमएस (एम / Z): मिला: 639.00 [1 + ना],सैद्धांतिक: 639.1 [1 + ना] + और मानव संसाधन एमएस (एम / Z): मिला: 617.2049 [1 + एच] + सैद्धांतिक: 617.1622 [1 + एच]। इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रा पानी में प्राप्त की है और λ अधिकतम दिखाया गया (ε, एम -1 सेमी -1) 268 (4,779.8), 434 (324.26)।
bioconjugate एक के समाधान में एक छोटे से सोने की स्लाइड सेते तरीकों का इस्तेमाल किया चित्रा 3 में योजनाबद्ध ड्राइंग में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। वापस polymeric सामग्री के साथ सोने की एक पतली परत एक के समाधान के लिए जोड़ा और / एन ओ सेते की अनुमति दी थी। सोने स्लाइड तो डि पानी से धोया और सूखे की अनुमति दी गई थी। समन्वित रूप से, एक सोने की स्लाइड डि पानी में सह-incubated और एक ही तरीके से धोया था। चित्रा 4 में दिखाया गया है दो नमूने, के SEM छवियों, सोने की स्लाइड एक साथ सह incubated की सतह संशोधित किया गया था कि पता चला है। यह इंगित करता है किएक के thiolate बातचीत सोने की सतह से लगाव की एक लंगर प्रदान करते हैं।
एक biosensor 1. मूल बातें चित्रा। एक विद्युत biosensor का एक विशिष्ट उदाहरण सीधे समाधान में एक लक्ष्य का पता लगाने के लिए।
Bioconjugate एक के समाधान में एक छोटे से सोने की स्लाइड सेते करने के लिए इस्तेमाल 1. विधियों का उत्पादन किया जाता चित्रा 2. सिंथेटिक विधियों चित्रा 3 में योजनाबद्ध ड्राइंग में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। वापस polymeric सामग्री के साथ सोने की एक पतली परत के समाधान के लिए जोड़ा गया था 1 / एन ओ सेते करने की अनुमति दी है। सोने स्लाइड तो डि पानी से धोया और सूखे की अनुमति दी गई थी। समन्वित रूप से, एक सोने की स्लाइड डि पानी में सह-incubated और एक ही तरीके से धोया था। दो नमूनों के SEM छवियोंचित्रा 4 में दिखाया गया है, सोने की स्लाइड एक साथ सह incubated की सतह संशोधित किया गया था कि पता चला है। यह एक की thiolate बातचीत सोने की सतह से लगाव की एक लंगर प्रदान करते हैं कि इंगित करता है।
चित्रा एक सोने की स्लाइड पर एक के स्थिरीकरण का प्रतिनिधित्व 3. योजनाबद्ध ड्राइंग। प्रक्रिया पानी में bioconjugate भंग और सोने स्लाइड जोड़ने शामिल है। ऊष्मायन हे / एन स्लाइड की धुलाई के बाद है। सफल स्थिरीकरण के लिए विश्लेषण चित्रा 4 में दिखाया गया स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाता है।
एक प्लास्टिक बहुलक फिल्म पर स्तरित सोने की चित्रा 4. SEM छवियों। (ए) ऊष्मायन सेन्स एक और (बी) के लिएllowing के पानी हे / एन में एक साथ ऊष्मायन और पानी के साथ rinsing।
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Discussion
असममित ferrocene डेरिवेटिव के संश्लेषण के समाधान में चुनौती दे रहा है। उदाहरण के लिए, समाधान वांछित उत्पाद (कम से कम 20%) की कम पैदावार के परिणामस्वरूप में एक निर्माण करने के लिए प्रयास करता है। इसी तरह, 1'अमीनो-ferrocene कार्बोक्जिलिक एसिड (बिना Fmoc) और राल बाध्य बायोटिन उपयोग प्रतिक्रियाओं Baristic एट अल द्वारा रिपोर्ट polymerized उत्पाद के साथ संगत अघुलनशील उत्पाद में हुई। और कम से कम उत्पाद। 47 यह आगे ferrocene से जटिल और उसके डेरिवेटिव प्रकाश के प्रति संवेदनशील होने के नाते और एमिनो congeners समाधान में dimerize होने का खतरा हो जाता है। इन मुद्दों पर व्यापक प्रतिक्रियाओं और workups चुनौतीपूर्ण बना। हालांकि इस जेट पहले पेप्टाइड्स के संश्लेषण के लिए Merrifield द्वारा विकसित ठोस चरण तरीकों का उपयोग कर उन्हें धोखा दिया जा सकता है। ferrocene-पेप्टाइड प्रणालियों के संश्लेषण के कई समूहों द्वारा ध्यान हुई और असममित पेप्टाइड-ferrocene प्रणालियों के एक पुस्तकालय करने के लिए प्रेरित किया है। 46,48-52 कामबायोटिन ferrocene-सिस्टीन युक्त पहली असममित ferrocene जैव conjugates के संश्लेषण के साथ साथ विवरण का वर्णन किया। इस यौगिक अन्य छोटे अणु रिसेप्टर्स जैविक रूप से प्रासंगिक अणुओं का पता लगाने के लिए विचार किया जा सकता है, जिसके माध्यम से एक मॉडल के रूप में कार्य करता है। इस काम में एक सोने की सतह के लिए एक स्थिरीकरण पगहा के रूप में उपयोग किया गया था।
संश्लेषण के पहले चरण में एक amine आधारित संयोजक का उपयोग कर एक ठोस राज्य राल पर एक स्थिर बायोटिन कोर प्राप्त करने के लिए किया गया था। एन -Biotin- एन '-Fmoc-ethylenediamine राल बायोटिन NovaTag राल के रूप में व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है और जैव-साधना एक की नींव के रूप में इस्तेमाल किया गया था। Fmoc-अमीनो की रक्षा समूह परीक्षण सफल deprotection पुष्टि की ninhydrin Dimethylformamide में piperidine की एक 20% समाधान और एक सकारात्मक (नीला) का उपयोग कर हटा दिया गया था। राल-बाउंड बायोटिन से मुक्त एमाइन तो, diisopropyl एथिल एमाइन से बना एक युग्मन कॉकटेल का उपयोग कर ferrocene लंगर के लिए इस्तेमाल किया गया थाdiisopropyl carbodiimide, और एक-hydroxybenzotriazole हाइड्रेट। 40,46 ferrocene व्यापारियों की एक किस्म ऐसे प्रयोजनों के लिए उपलब्ध हैं और ferrocene कार्बोक्जिलिक एसिड और 1'-Fmoc-एमिनो ferrocene कार्बोक्जिलिक एसिड शामिल हैं। पूर्व प्रणाली पैदावार का प्रयोग केवल एक बायोटिन उपांग के साथ संशोधित cyclopentadienyl के छल्ले में से एक होने जैव conjugates एवजी मोनो। उत्तरार्द्ध ferrocene व्युत्पन्न एक कार्बोक्जिलिक एसिड और एक Fmoc-संरक्षित एमिनो समूह के साथ cyclopentadienyl छल्ले के orthogonal प्रतिस्थापन के शामिल है। इस तरह के प्रतिस्थापन इस तरह एक के रूप में जैव conjugates के निर्माण करने के लिए cyclopentadienyl छल्ले के अलग संशोधन के लिए अनुमति ferrocene कोर की विस्तारित असममित संशोधन के लिए अनुमति देता है। चित्रा 2 में दिखाया गया है हल्के पीले रंग के मोती बायोटिन राल कोर करने के लिए ferrocene के सफल युग्मन पर एक चमकीले नारंगी रंग में बदल दिया है।
संश्लेषण के अगले चरण में Linkers की एक किस्म के साथ संलग्न किया जा सकता हैराल-बाउंड ferrocene congener से मुक्त एमाइन करने के लिए। यह अमीनो एसिड युक्त एक thiolate है के रूप में इस प्रणाली के प्रयोजनों के लिए, सिस्टीन उपयोग किया गया था। नीचे के रूप में चर्चा thiolate घटक, एक सोने की सतह के लिए जैव-साधना की कुर्की के लिए अनुमति देता है। Fmoc-Cys (एमएमटी) ओह साथ राल बाध्य प्रणाली की प्रतिक्रिया से रवाना हुए सिस्टीन साथ संशोधन। Dimethylformamide में 20% piperidine साथ Fmoc समूह का हटाया जाना एक के राल बाध्य रूपों पैदावार। राल-बाउंड जैव-साधना trifluoroacetic एसिड (TFA) के, पानी और triisopropyl silane के समाधान का उपयोग जैव organometallic सिस्टम की दरार से ठोस समर्थन से हटा दिया गया था। मौलिक और एनएमआर विश्लेषण द्वारा की पुष्टि के रूप में एसिड समाधान और ठंड Diethyl ईथर के अलावा के वाष्पीकरण 1 के एक लाल-नारंगी ठोस निर्धारित किया TFA के नमक के रूप में जैव-साधना एक झुकेंगे। पवित्रता HPLC विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई।
के लिए सिद्धांत के सबूत दिखाने के लिएएक सोने की सतह पर जैव-साधना 1, 1 के बयान के लिए एक अनुलग्नक पगहा उपलब्ध कराने सिस्टीन घटक का पता लगाया गया था। जाने-माने एयू-एस आत्मीयता एक बहुलक समर्थित सोने की सतह पर एक के सतही स्थिरीकरण के लिए अनुमति देता है। इस प्रयोग में, सोने की सतह को साफ किया और धीरे पॉलिश किया गया था। स्लाइड तो 1 के एक ~ 1 मिमी पानी के घोल में डूबा हुआ है और / एन ओ स्थापित करने के लिए अनुमति दी गई थी। Au सतह तो आसुत जल से धोया और एक Kimwipe के साथ सूख गया था। सोने की स्लाइड्स तो SEM का उपयोग संशोधन के लिए मूल्यांकन किया गया। चित्रा 4 में दिखाया छवियों सोने की सतह पर गठन करने के बाद एक से एक monolayer के प्रतिनिधि हैं। सतह में खामियों एक की monolayer में 'छेद' का एक परिणाम होने की माने और हमारे समूह द्वारा आगे की खोज के तहत कर रहे हैं कर रहे हैं।
कुल मिलाकर, कृत्रिम तरीकों के कर सकते हैं कि ferrocene bioconjugates निर्माण करने के लिएएक सोने की सतह पर स्थिर हो गई है। काम असममित ferrocene यौगिकों की है कि संश्लेषण में उपन्यास कम पैदावार और पवित्रता के लिए अग्रणी ओर प्रतिक्रियाओं के बेहतरीन प्रदर्शन की चुनौती दी है। एक करने के लिए इसी तरह की ferrocene-bioconjugates संभावित biosensors के रूप में आवेदन किया है, इन सिंथेटिक कठिनाइयों पर काबू पाने के लिए सर्वोपरि है। ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण करने जैसा ठोस चरण विधियों का प्रयोग, बायोटिन ferrocene-सिस्टीन में शामिल है कि एक अच्छी तरह से विशेषता bioconjugate एक का उत्पादन किया गया है। इसके अलावा, SEM के इस प्रणाली सिस्टीन घटक की thiolate आधा भाग करने के लिए एक सोने की सतह के लिए धन्यवाद पालन करने में सक्षम है कि दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। कुल मिलाकर, इस के साथ साथ प्रदान की साधारण कृत्रिम पद्धति आसानी से आवेदनों की एक सरणी के लिए पेप्टाइड दृश्यों और जैव-साधना की व्यवस्था के लिए संशोधित किया जा सकता है।
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Acknowledgments
के.जी. आरए वेल्च फाउंडेशन अनुदान पी-1760 के द्वारा समर्थित किया गया था, गणित और (किलो) विज्ञान शिक्षा के TCU एंड्रयूज संस्थान, TCU अनुसंधान और रचनात्मकता गतिविधि अनुदान (किलो) और (जेएचएस के लिए) TCU राज्य विद्युत विनियामक आयोग अनुदान।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin Novatag Resin | NovaBiochem | 8550510001 | |
| TORVIQ 10 ml Luer Lock Fritted Syringe | Fisher | NC9299151 | |
| piperidine | Acros | P/3520/PB05 | |
| ninhydrin test | Sigma-Aldrich | 60017-1ea | |
| 1’-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acid | Omm Scientific | Special Order | |
| N,N′-Diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407-5G | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | Novabiochem | 8520080025 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T5408 | |
| 1,2-ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 2930 | |
| triisopropyl silane | Sigma-Aldrich | 233781 | |
| Eppendorf tubes (20 ml) | any source | ||
| methanol | any source | dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage | |
| dichloromethane | any source | dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage | |
| dimethylformamide | any source | dry with molecular sieves prior to use & store in 100 ml media bottle for easy usage | |
| centrifuge | any source |
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