Summary
Het doel van dit protocol is ischemische letsel fotochemisch ertoe te bewegen de achterste oogzenuw in de rat. Dit model is kritisch voor onderzoek van de pathofysiologie van posterieure ischemische optische neuropathie, en therapeutische toepassingen voor deze en andere optische neuropathieën, evenals andere CNS ischemische ziekten.
Abstract
Achterste ischemische optische neuropathie (PION) is een sight verwoestende ziekte in de klinische praktijk. Echter, de pathogenese en natuurlijke historie gebleven slecht begrepen. Onlangs ontwikkelden we een betrouwbaar, reproduceerbaar diermodel van PION en geteste het behandelingseffect van bepaalde neurotrofe factoren in het model 1. Het doel van deze video is om onze fotochemisch geïnduceerde model van posterior ischemische optische neuropathie te tonen, en om de effecten ervan met retrograde etikettering van retinale ganglioncellen evalueren. Na chirurgische blootstelling van de achterste oogzenuw, een fotogevoelige kleurstof, erythrosine B, intraveneus geïnjecteerd en een laserbundel wordt gefocusseerd op de optische zenuw oppervlak. Fotochemische interactie van erythrosine B en de laser tijdens bestraling schade het vasculaire endotheel, wordt gevraagd microvasculaire occlusie gemedieerd door trombocytentrombose oedemateus en compressie. De resulterende ischemische letsel levert een geleidelijke, maar pronounced retinale ganglioncellen afsterving, wegens het verlies van axonale ingang - een afstandsbediening-geïnduceerde verwonding en klinisch relevant resultaat. Aldus Dit model verschaft een nieuw platform om de pathofysiologische loop van PION bestuderen, en kunnen verder worden geoptimaliseerd voor het testen van therapeutische toepassingen voor optische neuropathieën en andere CNS ischemische ziekten.
Introduction
Bij patiënten boven de 50 jaar oud, ischemische optische neuropathie (ION) is de meest voorkomende vorm van acute opticusneuropathie 2. De aandoening kan presenteren als een van de twee subtypes volgens de bron van specifieke aangetaste bloedvoorziening en klinische presentatie: anterior (AION) of zitvlak (PION) 3. Hoewel de pathogenese en verloop van AION zijn uitvoerig bestudeerd 4-7 is PION bleef slecht begrepen vanwege de lage prevalentie variabele presentatie slecht gedefinieerde diagnostische criteria en het ontbreken van een diermodel. Verder zijn er geen behandelingen bewezen effectief te voorkomen of reverse visie verlies van AION of PION. Daarom is een reproduceerbaar en betrouwbaar diermodel van PION is van grote waarde voor het ziekteproces in vivo bestuderen en testen van nieuwe therapeutische strategieën voor neuroprotectie en axon regeneratie.
Fotochemisch geïnduceerde ischemische schade aan de microvasculatuur gevolg vasogENIC oedeem en trombose effectief creëert regionale weefselischemie 8-12. Na injectie in het vasculaire circulatie, de fotogevoelige erythrosine B produceert reactieve singlet moleculaire zuurstof bij aktivering met laserbestraling van doelschepen. De singlet zuurstof direct peroxidizes het vasculaire endotheel, het stimuleren van bloedplaatjes hechting / aggregatie en leidt tot de vorming van trombus occlusief. Ischemische schade wordt verspreid naar aangrenzende gebieden en verder verergerd door microvasculaire compressie vanwege vasogeen oedeem. De algemene doelstelling van dit protocol is te fotochemisch ischemie in de retrobulbaire oogzenuw bewegen om de schade veroorzaakt door PION weerspiegelen.
Voor zover wij weten is dit het eerste model van ischemisch letsel in het achterste oogzenuw 1. Aangezien dit model produceert ischemie terwijl het vermijden van fysieke trauma's, de fysiologische processen van de achterste ischemische optische neuropathie zijn beter nagebootst en studeerde. Ook dit model heeft een nieuw platform voor de screening van kandidaat-therapeutica voor optische zenuwaandoeningen en andere CNS ischemische ziekte. Hier, een gedetailleerd protocol voor dijader catheterisatie, optische zenuw blootstelling, intraveneuze injectie van Erythrosin B en laser bestraling in een rat PION model worden beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Universiteit van Californië in San Diego en Universiteit van Miami institutionele dierlijke zorg en gebruik commissies (IACUC) en uitgevoerd in overeenstemming met de ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Visual Research. Alle reagentia en instrumenten die gebruikt worden bij chirurgische procedures zijn steriel.
1. Verdoven en Bereid de Rat voor Heelkunde
- Vóór behandeling worden de ratten verdoofd met een intraperitoneale injectie van ketamine (60 mg / kg) en xylazine (8 mg / kg) naar lichaamsgewicht. Voldoende diepte van de anesthesie dient te worden bepaald door een negatieve reactie op de teen knijpen stimulus.
- Eenmaal verdoofd, trek de tong uit naar verstikking te voorkomen en gelden smeren zalf voor beide ogen om uitdroging van het hoornvlies tijdens de operatie te voorkomen.
- Scheren de chirurgische sites met behulp van een tondeuse en veeg het gebied drie keer met 10% providon jodium detergent oplossing en 70% ethanol.
- Laken tHij dier binnen een steriel veld. Steriele handschoenen en chirurgische instrumenten worden gebruikt tijdens de operatie te overleven. Opnieuw steriliseren van de tips van de instrumenten met behulp van een hete kraal sterilisator tussen dieren.
2. Chirurgische Aanpak
- PION inductie
- Dijbeenader catheterisatie
- Voorbereiden en reinigen van de operatiewond. Scheer de juiste dijbeen met een tondeuse en veeg het gebied drie keer met elk 10% providon jodium detergent oplossing en 70% ethanol.
- Bereid de slang. Snijd een lengte van 40cm polyethyleen slang (PE 10) gesteriliseerd in 70% ethanol. Spoel de buis met zoutoplossing en sluit deze aan een 1 ml spuit met een afgemeten oplossing van 2% erythrosine B kleurstof (1 pl / mg, waarbij een dosis van 20 mg / kg lichaamsgewicht). Monteer de spuit in een voet-schakelaar gecontroleerde infuuspomp ingesteld op een snelheid van 600 ul / min.
- Met behulp van een No. 15 mes, een kleine horizontale incisie aande basis van de rechter dij. Knippen en verspreid het membraan binnen en reinig het gebied met steriele wattenstaafjes.
- Scheid de spier met een pincet, totdat de tak van de dijader zichtbaar is. Een omhulsel omringt de slagader, ader en de zenuw. Knijpen en trek deze mantel omhoog met een pincet (fijne punt Dumont tang) en snijd een kleine incisie (2-4 mm doorgaans voldoende) nabij de basis van de driehoekige wig Vannas veer schaar. Vouw de cut als dat nodig is.
- Scheid de ader en slagader met een stompe microchirurgische haak evenwijdig aan de richting van de ader. Wees niet naar de delicate membraan en ader takken beschadigen. Dan til de ader en het scheiden van het onderliggende bindweefsel.
- Het verkrijgen van een naaldloze nylon hechtdraad en plaats deze naast de lies. Met behulp van de micro-chirurgische haak, verheffen de ader en laat de fijne tip pincet onder de distale regio. Pak het ene uiteinde van de hechtdraad en trek deze onder deader. Ligeren de distale ader stevig vast. Laat een tweede hechting op overeenkomstige wijze onder de proximale ader en een losse knot.
- Maak een kleine snede in de ader nabij de distale ligatie met Vannas voorjaar schaar. Vouw het gat zo nodig met de fine-tip pincet. Wat bloed kan lekken door de snede. Reinigen van de chirurgische gebied met koud, steriel BSS en steriele wattenstaafjes.
- Houd de aderwand aan de rand van de snede, katheteriseren het schip met de voorbereide zoutoplossing gespoeld buizen met behulp van een naald houder. Draai de proximale knoop rond de ader en slangen. Vervolgens verankeren van de buis te koppelen aan het distale hechtdraad.
- Controleer de kwaliteit van de catheterisatie door op de voet-schakelaar om zoutoplossing te injecteren, <1 ml is voldoende. Zorg ervoor dat de slang is vrij en heeft geen lekken. Tijdelijk sluit de incisie met hechtingen aan de catheterisatie en weefsel te beschermen.
- Blootstelling van de oogzenuw
- Prepare de operatieplaats door de pre-geschoren gebied afvegen boven het linkeroog driemaal elk met 10% providon jodium reinigingsmiddel en 70% ethanol.
- Maak een insnijding langs de huid 2-3 mm achter het oog met een nummer 15 mes. Knijpen en til het bindweefsel met gekartelde tang, en maak een kleine incisie met Vannas voorjaar schaar. Deze kleine incisie in het algemeen ongeveer 5 mm lang, maar kan worden verlengd om hogere blootstelling voor een chirurg in opleiding. Blijven botweg ontleden door het bindweefsel langs de hogere rand van de orbitale bot, zorg om te voorkomen dat het verstoren van de bloedvaten. Reinigen van de chirurgische gebied met wattenstaafjes.
- Ontleden omlaag door de conjunctiva totdat de superior rectus spier zichtbaar. Knijpen en ontleden door middel van de spier; de spier wordt bevrijd van diep in de baan. Nu kan omringende weefsels worden gebruikt om te helpen bij het terugtrekken en elevatie van het oog voor gemakkelijke visualisatie.
- Opnieuwdarmkanaal van de flap van de huid en het bindweefsel zijwaarts en naar beneden, en zijn plaats te houden met een hechtdraad en hemostat. Dit zal het oog voren en naar buiten om de vethoudende omhulsel dat de oogzenuw omringt onthullen roteren.
- Vervolgens wordt voorzichtig een paar scherpe pincet en uitbreiding evenwijdig aan de optische zenuw naar de bindweefsel rond de mantel scheiden. Heeft de oogzenuw niet aan met de scherpe uiteinden van de tang.
- Een 5 mm lengte van de oogzenuw en het omringende omhulsel moet nu zichtbaar zijn. Een netwerk van kleine bloedvaten op het manteloppervlak omcirkelt de oogzenuw. Deze zijn gericht tijdens laserbestraling.
- Intraveneuze injectie van Erythrosin B laserbestraling
- Slijtage-oranje gekleurde veiligheidsbril te allen tijde tijdens het bedienen van de Laserbestralingsinrichting om jezelf te beschermen tegen de groen laserlicht. Zet de laser, opent de sluiter en pas de piek en de gemiddelde powers van de laser noodzakelijk. Sluit de sluiter.
- Plaats de rat in het Laserbestralingsinrichting. Voor een goede beam plaatsing garanderen, wordt een zwakke richtstraal door ruimtelijk filteren van de laser door een 100 urn diameter gat gesloten lamel. Re-bloot de oogzenuw met een paar fijne punt tang, en de positie van de bundel gericht op de intraorbitale oogzenuw tussen 3 mm en 4 mm achter de oogzenuw hoofd.
- Spuit de oplossing van 2% erythrosine B via activatie van de infusiepomp. Het kan circuleren gedurende enkele seconden de chirurg voegt een kleine druppel BSS aan het oppervlak van de optische zenuw te bevochtigen.
- Controleert de positie van het doel balk en klik vervolgens op de voet-schakelaar aan bestraling te starten. Een veiligheidsfilter oranje, dat wordt toegevoegd in de optische baan van de microscoop, onmiddellijk overgegaan gevolgd door het openen van de sluiter wordt na een vertraging van 1 sec.
- Bestralen de oogzenuw 90 sec met een piekvermogen van 135mW en het gemiddelde vermogen van 18mW door een balk chopper roterend bij 250 Hz met een duty cycle van 15% (dit minimaliseert hitte). Gele fluorescentie gevisualiseerd zo helder oranje door het veiligheidsfilter, wordt geëmitteerd vanuit het bovenste oppervlak van de optische zenuw en is voldoende om de bundel bestraalt de zenuw symmetrisch.
- Na de bestraling, zal de veiligheid filter-oranje gekleurde automatisch geopend. Microhemorrhage kan worden waargenomen in sommige gevallen.
- Ontlast de tractie op de extra oculaire spieren en terug te keren het oog naar een neutrale positie. Sluit de incisie met onderbroken hechtingen. Trekken dan de katheter en afhechten de dijader strak om lekkage te voorkomen; sluiten met onderbroken hechtingen. Breng antibiotische zalf beide insnijdingen. Controleer de fundus van de vasculaire integriteit van de centrale retinale ader en slagader controleren.
- Dijbeenader catheterisatie
- Retrograde Labelingvan retinale ganglioncellen (RGC). OPMERKING: Om RGC overleven, retrograde labeling met Fluorogold (FG) te evalueren moet een week worden afgerond voor PION. De werkwijze wordt in detail beschreven in Jupiter protocol 819 13.
- In het kort: het dier verdoven met ketamine (60 mg / kg) en xylazine (8 mg / kg) en scheren het hoofd.
- Operatief scrub de incisie en een middellijn incisie over het hoofd om de schedel bloot te leggen.
- Boor bilaterale gaten door de schedel (ø 2x2 mm) 0,5 mm van zowel de sagittale en transversale hechtingen.
- Zuigen de cerebrale inhoud die ligt over het dorsale oppervlak van de superieure colliculus (SC) met behulp van een vacuümpomp zorgvuldig. Plaats dan een klein stukje gelfoam doorweekt met 4% FG op het oppervlak van de SC.
- Sluit de incisie met hechtingen en de zorg voor het dier met behulp van standaard postoperatieve zorg.
- Postoperatieve zorg en euthanasie
- Na de operatie plaats dier in een schone kooi apart op een recirculerende verwarmde water pad totdat hij is hersteld.
- Postoperatieve analgetica (buprenorfine HCl, 0,01 mg / kg) toegediend moet tweemaal per dag gedurende drie opeenvolgende dagen om ongemak te minimaliseren.
- Rat moet apart worden gehouden en geobserveerd totdat zij in staat zijn om borstligging behouden en weer voldoende bewustzijn.
- Herstel en gezondheid dagelijks gecontroleerd gedurende ten minste 5 dagen na de operatie, of tot het verwijderen van hechtingen en adequate genezing van de chirurgische plaats, welke laatste optreedt.
- Euthanaseren van de dieren door perfusie met 4% PFA bij wetenschappelijk geschikte tijdstippen na de operatie volgens onderzoeksjournalist belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resulterende ischemie geïnduceerd door deze techniek levert een geleidelijke maar uitgesproken dood van retinale ganglioncellen na ischemisch letsel axon. Dit is een klinisch relevant resultaat vergelijkbaar met dat van de menselijke ziekte. FG retrograde etikettering wordt gebruikt om RGC overleven kwantificeren na PION. Dezelfde methode wordt toegepast om een succesvolle modelvorming valideren en om de effecten van verschillende therapeutische regimes beoordelen. Figuur 1 toont representatieve confocale beelden van FG-positieve cellen in het netvlies flat mounting controle (figuur 1A), sham behandelde (laser alleen / geen erythrosine B, Figuur 1B), en 2 weken na de PION-behandelde (figuur 1C) dieren. In vergelijking met controledieren, minder FG-positieve cellen aanwezig bij dieren 2 weken na PION inductie. Geen significant verschil tussen het aantal RGC controle en sham behandelde (laser slechts / geen erythrosine B) dieren waargenomen. ThiB geeft aan dat het PION-geïnduceerde RGC verlies wordt opgewekt door de combinatie van erythrosine B en laserbestraling, in plaats van thermische energie van de laser alleen.
Figuur 1. Retinale ganglion cel (RGC) overleving na achterste ischemische optische neuropathie (PION). Retinale ganglioncellen retrogradely gelabeld met Fluorogold werden afgebeeld in retinale flat mounts (AC). Twee weken na PION wordt eenzelfde aantal RGC waargenomen in controle (A) en sham behandelde (B, laser slechts / geen erythrosine B) ogen. Echter, het aantal-Fluorogold gelabelde RGCs aanmerkelijk in de setting van PION (C) verlaagd. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versio bekijkenn van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We zijn schatplichtig aan Eleut Hernandez voor veeteelt, Gabe Gaidosh voor microscopie expertise en Khue Tran en Zhenyang Zhao voor videobewerking. Deze studie werd gefinancierd door de National Eye Institute verleent R01-EY022129 naar JLG en P30 subsidies EY022589 aan UCSD en EY014801 UM; de American Heart Association, de James en Esther Koning Foundation, de promovendus uitwisselingsprogramma fonds van Fudan University Graduate School (No. 2.010.033), en een onbeperkte subsidie van onderzoek ter voorkoming van Blindheid, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 532-nm Nd:YAG laser | Laserglow | LRS-532-KM-200-3 | |
| Beam chopper | custom-made | custom-made | |
| Mechanical shutter and corresponding shutter drive timer | Vincent Associates | SD-10 | |
| 25-cm focal length spherical lens | CVI/Melles-Griot | 01 LPX 293 | plano-convexBK7 glass lens with HEBBARTM antireflection coating |
| Erythrosin B | MP Biomedicals | 190449 | |
| Fluorogold | Fluorochrome,LLC | ||
| Gelfoam | Cardinal Health | CAH1203421 | |
| Polyethylene tubing (PE10) | BD Intramedic | 427400 | |
| No. 10 Blade | Miltex | 4-110 | |
| Fine Forceps | F.S.T. | 91150-20 | Dumont #5 rustless non-magnetic |
| Forceps with Teeth | F.S.T. | 11153-10 | Germany stainless |
| Forceps | F.S.T. | 18025-10 | Germany stainless |
| Vannas spring scissors | F.S.T. | 2-220 | JJECK Stainless |
| Polyglactin suture | Ethicon | J488G | 7-0 suture |
| hemostat | F.S.T. | 12075-12 | Germany stainless |
References
- Wang, Y., Brown, D. P. Jr, Duan, Y., Kong, W., Watson, B. D., Goldberg, J. L. A novel rodent model of posterior ischemic optic neuropathy. JAMA Ophthalmology. 131, 194-204 (2013).
- Rucker, J. C., Biousse, V., Newman, N. J. Ischemic optic neuropathies. Curr Opin Neurol. 17, 27-35 (2004).
- Hayreh, S. S. Posterior ischaemic optic neuropathy: clinical features, pathogenesis, and management. Eye (Lond). 18, 1188-1206 (2004).
- Hayreh, S. S. Inter-Individual Variation in Blood-Supply of the Optic-Nerve Head. Doc Ophthalmol. 59, 217-246 (1985).
- Jacobson, D. M., Vierkant, R. A., Belongia, E. A. Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy - A case-control study of potential risk factors. Arch Ophthalmol-Chic. 115, 1403-1407 (1997).
- Kosmorsky, G., Straga, J., Knight, C., Dagirmanjian, A., Davis, D. A. The role of transcranial Doppler in nonarteritic ischemic optic neuropathy. Am J Ophthalmol. 126, 288-290 (1998).
- Hayreh, S. S., Zimmerman, M. B. Non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy: role of systemic corticosteroid therapy. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology. 246, 1029-1046 (2008).
- Prado, R., Dietrich, W. D., Watson, B. D., Ginsberg, M. D., Green, B. A. Photochemically Induced Graded Spinal-Cord Infarction - Behavioral, Electrophysiological, and Morphological Correlates. J Neurosurg. 67, 745-753 (1987).
- Dietrich, W. D., Busto, R., Watson, B. D., Scheinberg, P., Ginsberg, M. D. Photochemically induced cerebral infarction. II. Edema and blood-brain barrier disruption. Acta Neuropathologica. 72, 326-334 (1987).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17, 497-504 (1985).
- Watson, B. D. Animal models of photochemically induced brain ischemia and stroke. Cerebrovascular Disease - Pathophysiology, Diagnosis and Treatment. , 52-73 (1998).
- Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Green, B. A. Photochemically induced spinal cord injury in the rat. Brain Research. 367, 296-300 (1986).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
