Le uova di gallina fertili sono ampiamente utilizzate per produrre grandi quantità di virus dell'influenza A umana in quanto forniscono un sistema conveniente ed economico per dimostrare alti rendimenti di virus.
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Articolo metodologico
Influenza Virus Propagazione in embrionate di pollo Uova
In questo articolo
Sommario
Abstract
Infezione influenzale è associata con circa 36.000 morti e più di 200.000 ricoveri ogni anno negli Stati Uniti. L'emergere continuo di nuovi ceppi di virus influenzale dovute alla mutazione e ri-assortimento complica il controllo del virus e richiede lo sviluppo permanente di nuovi farmaci e vaccini. Lo studio in laboratorio di influenza richiede un metodo affidabile e conveniente per la propagazione del virus. Qui, un protocollo globale è costituita per influenza A propagazione dei virus in uova di gallina fertili, che produce costantemente le scorte virali ad alto titolo. In breve, esenti da organismi patogeni (SPF) uova di gallina fecondate siero sono incubate a 37 ° C e 55-60% di umidità per 10 - 11 giorni. In questo periodo, lo sviluppo dell'embrione può essere facilmente monitorato mediante un Candler uovo. Virus inoculazione viene effettuata mediante iniezione del virus magazzino nella cavità allantoidea utilizzando un ago. Dopo 2 giorni di incubazione a 37 ° C, le uova sonorefrigerata per almeno 4 ore a 4 ° C. Il guscio d'uovo sopra la sacca d'aria e la membrana corioallantoidea sono poi accuratamente aperto, e il liquido allantoico contenente il virus è raccolto. Il fluido viene cancellato da detriti mediante centrifugazione, aliquotato e trasferito a -80 ° C per la conservazione a lungo termine. La grande quantità (5-10 ml di virus contenenti liquido per uovo) titolo e precisa di virus che di solito si ottiene con questo protocollo ha reso l'utilizzo di uova per la preparazione virus nostro metodo favorevole, in particolare per gli studi in vitro, che richiedono grandi quantità del virus in cui sono necessari dosaggi elevati di virus stesso magazzino.
Introduzione
Influenza A continua ad essere una grave minaccia per la salute umana. Si tratta di una malattia respiratoria potenzialmente devastante con un grande carico globale provocando fino a 500.000 morti nel mondo ogni anno 1. I virus influenzali sono nella famiglia Orthomyxoviridae e portano a 8 negativo-sense singolo filamento di RNA nel loro genoma 1,2. L'elevata mutevolezza (cioè, "drift" antigenico) del genoma virale impedisce immunità a lungo termine. Inoltre, l'influenza è sempre più resistenti ai farmaci anti-virali 3.
Il 2009 H1N1 pandemia influenzale ha evidenziato tutti i problemi diff....
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Protocollo
NOTA: Osservazioni generali: eseguire tutte le procedure che comportano la manipolazione delle uova in condizioni sterili, e una tecnica sterile deve essere utilizzato di conseguenza. Pre-pulire tutte le apparecchiature con il 70% di etanolo prima dell'uso. In generale, l'inoculazione di virus influenzale e la raccolta devono essere condotti in un laboratorio BSL-2. Tuttavia, se si utilizza questo protocollo per propagare molto più patogeno virus influenzali (ad esempio, ceppi pandemici e pre-pandemia, i ceppi che rappresentano un pericolo per pollame e bestiame, i ceppi di influenza aviaria ad alta patogenicità, 1918 H1N1 ceppo), i livelli di biosic....
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Risultati
Più metodi sono stati sviluppati per titolo virale influenzale. Una considerazione quando si sceglie un metodo appropriato è che alcuni determinano particelle totali, indipendentemente della redditività (ad esempio, test emoagglutinina), mentre altri si basano su infettività, che valuterà virioni vitali (ad esempio, test placca) 6. Qui, il titolo virale di liquido allantoico raccolti da uova di pollo inoculate con un virus influenzale mouse adattato (A / PR / 8/34) è stata determinata median.......
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Discussione
Influenza provoca un grande carico globale di malattia, e il lavoro continua nella comprensione della patogenesi del danno polmonare 7. Per la ricerca facilitato in questa malattia mortale, vari metodi sono stati sviluppati per diffondere il virus dell'influenza 6. Qui, descriviamo una tecnica per la produzione di virus dell'influenza in uova di gallina. Il vantaggio di questo metodo è che è altamente riproducibile e si traduce in grandi quantità ad alto titolo di riserve di virus influenza.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il presente studio è stato supportato dalle sovvenzioni NIH HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.) e dall'American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| uova di gallina fecondate senza agenti patogeni (SPF) sieriche | per uova VALO BioMedia | ||
| FARM iNNOVATORS | Modello 2100 | ||
| girauova automatico | FARM iNNOVATORS | Modello 3200 | |
| candelabro per uova | FARM iNNOVATORS | Modello 3300 | |
| Siringa da 1 ml | BD Bioscience | 309659 | |
| ago 18G | BD Bioscience | 305196 | |
| ago 20G / 22G | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Etanolo>99,5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluito al 70% utilizzando la pistola per colla ad acqua |
| "Ad tech Hi Temp Progetto Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Colla modello 1105 | |
| "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| Cellule MDCK | ATCC | CRL-2935 | |
| Globuli rossi di tacchino in pool lavati, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
Riferimenti
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y.
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Ristampe e permessi
