Abstract
הפרוטוקול הבא הוא שימוש להעריך תפקוד לב לקוי או עלבונות איסכמי מתונים הבאים מדהים שריר לב. הטכניקה שימושית לדוגמנות פגיעת איסכמית קשורה עם תופעה רלוונטית קליני רב, כולל ניתוחי לב עם מעצר cardioplegic ומעקף לב-ריאה, CABG מחוץ למשאבה, השתלה, תעוקת חזה, איסכמיה קצרה, וכו '. הפרוטוקול מציג שיטה כללית למודל מעצר היפותרמיה hyperkalemic cardioplegic וreperfusion בלב מכרסמים המתמקדים במדידה של תפקוד שריר לב התכווצות. בקיצור, לב עכבר perfused במצב Langendorff, instrumented עם בלון תוך חדרי, ופרמטרים תפקודיים לב בתחילת המחקר נרשמים. בעקבות ייצוב, הלב הוא אז נושא לתדרך עירוי של פתרון cardioplegia היפותרמיה על הלב ליזום מעצר הדיאסטולי. Cardioplegia מועבר לסירוגין מעל 2 שעות. הלב אז reperfused וwarmeד לטמפרטורות והתאוששות של תפקוד שריר לב normothermic מנוטר. שימוש בתוצאות פרוטוקול זה בפונקצית התכווצות אמינה מדוכאת לב ללא נזק לרקמות שריר לב ברוטו במכרסמים.
Introduction
שריר לב מדהים מוגדר כפעילות הפיכה מופחתת התכווצות למרות שיקום של זרימת דם נאותה לאחר תקופה קצרה של איסכמיה או תקופות ממושכות של עלבונות איסכמי עם 1,2,3,4,5 הלבבי. השיטה הוצגה משמשת במיוחד למודל עלבונות איסכמי רלוונטיים קליני אשר יכול לגרום לליקויים הפיכים בתפקוד התכווצות (כלומר, עלבונות איסכמי הקשורים לניתוח לב ניצול מעצר cardioplegic, תקופות קצרות של איסכמיה, תעוקת חזה, וכו '). בניגוד למחקרים חמורים איסכמיה (אוטם שריר לב, נמק) פרוטוקול זה פותח כדי להעריך התאוששות שריר לב פונקציונלית ולבבי ללא פגיעה ברקמות, שיפוץ, ומוות של תאים. רוב הנייר דן פרוטוקול מעצר cardioplegic סטנדרטי עם אלמנטים דומים לניתוח לב באמצעות היפותרמיה ומשלוח cardioplegia לסירוגין.
prot שריר לבשיקוף ברוב ניתוחי לב מסתמך על cardioplegia ומעקף לב-ריאה. למרות cardioplegia פתרונות (CP) ואסטרטגיות להשתנות במידה רבה (דם, גְבִישָׁן, וכו 'קר, חם) האלמנטים הנפוצים ביותר הם) היפרקלמיה 1 ו / או אסטרטגיות אחרות למעצר הלב בירוויח, וכך להגביל את ניצול אנרגיה כתוצאה מהתכווצות שריר לב, ו -2) היפותרמיה כדי להאט את חילוף החומרים ומסייעות לשמור על ATP ועתודות אנרגיה אחרות בזמן שנעצרה. פתרונות cardioplegia נוכחיים לספק הגנה ללב מפני עלבונות איסכמי שאחרת היה להוכיח קטלני. עם זאת, אסטרטגיות על הלב במהלך עלבונות איסכמי כירורגית אינן מושלמים, ולפציעתם איסכמי קלה כתוצאה עלולה לגרום לבעיות בתפקוד התכווצות לב הפיכה למרות זרימת דם מספקת (שריר לב מדהים), חמצת, נזק cardiomyocyte, והשפעות של כלי דם הכליליים כוללים זלוף המופחת וvasospasm.
נבדל פרוטוקול זהממודלי איסכמיה לב מבודדים סטנדרטיים הערכת אוטם שריר לב ואיסכמיה קשה בכך שהוא מעריך עלבונות איסכמי מתונים יותר אשר יכול לגרום לתפקוד לב הלקוי הבא איסכמיה הקצרה או עלבונות איסכמי הקשורים מעצר cardioplegic. (לסקירה על טכניקות זלוף Langendorff ואני / לימודי R לראות 6-8). להנחיות כלליות וניתוח מעמיק של פרמטרים ניסוי קשורים מבודד לב perfused עכבר לראות אל t דואר סאתרלנד. 2,003 9 הטכניקה המוצגת כאן מפרטת את הציוד הדרוש, חומרים כימיים, צעדים, אסטרטגיות וטיפים כדי לגרום באופן מהימן מדהים בלב עכבר. שינויים קלים יש צורך ליישם את הטכנולוגיה על חולדות.
בקצרה לבבות עכבר בודד הם Langendorff perfused לכ 30 דקות עם חיץ קרבס-Henseleit פיסיולוגי (KHB), ואחריו דום לב מוגן קר באמצעות משלוח של hypotherm hyperkalemicפתרון cardioplegia IC. בעקבות מעצר, התאוששות תפקודית לב להשגחה במהלך החימום מחדש וreperfusion של הלב עם KHB. שינויים במידת ההתאוששות של תפקוד התכווצות לב ניתן להעריך להעריך סוכנים על הלב ואסטרטגיות לבביות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הנהלים אושרו על ידי ועדת תוחלת החיים המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש וכל חיות והנהלים על פי מדריך המועצה הלאומית למחקר לטיפול ושימוש בחי המעבדה 10.
1. ייצור בלון ולחץ השמאל חדרית ניטור מעגל
- לבנות בלוני LV לפי et al מילר. 11 בכוס עם בר ומערבבים, לערבב 9.5 מיליליטר של מים מזוקקים, 14.2 מיליליטר של סירופ תירס אור ו33.8 גרם של סוכרוז, וחום על צלחת חמה, לערבב עד שהסוכר נמס . המשך פתרון חימום עד שמגיע לכ -150 מעלות צלזיוס.
הערה: שיטות רבות קיימות לבניית בלוני LV כוללים שינוי של טיפים קונדום ובניית ניילון נצמד 9,12. אנו מוצאים את השיטה הנ"ל להיות קלה יחסית לבניית בלוני דליפה-חופשיים, אולם יתרון של בלוני ניילון נצמדים כולל אפיון קודם לfrequen המתאיםיחסי CY-תגובה 9. - לשבור גדילי ספגטי יבשים לחתיכות על 5 ס"מ האורך ולטבול הצד השני של כל חתיכה אחת על 1 סנטימטר עמוק לתוך תמיסת הסוכר ולהסיר לאט.
- מניחים את הקצה היבש של גדיל הפסטה לתוך גוש קצף פוליסטירן ולהשעות כל כך תערובת הסוכר מטפטפת למטה ויוצרת עובש צורת דמעה. השאר O / N בייבוש כך העובש מתקשה.
- למחרת, טובלים את התבניות לג'ל סיליקון פיזור. הנח גדילי פסטה חזרה לגוש קצף פוליסטירן ומקום בaa תנור המעלות צלזיוס 37 לשעה 2 או עד יבש. חזור על פעולה זו פעם נוספת, כך שתי שכבות של סיליקון מיושמות.
- לאחר יבש, מקום במים למספר שעות כדי לסייע בהסרת הבלון מהתבנית. בלוני חנות ב0.02% פתרון אזיד הנתרן.
- השתמש איסוף דם 23 G להגדיר לייצר צינורית בלון מותאמת אישית על ידי חיתוך מחט כדי ליצור קצה קהה והצבת חריצים במחט.
- חבר את צינורות ללחץ טרנסducer ולשטוף עם מים, תוך שמירה על צינורות וצינורית שקוע לחלוטין כדי למנוע אוויר מלהיכנס למערכת. מניחים בלון שכבר מלאים במים על הצינורית ולהשתמש 2-0 תפרי משי לקשור על צינורית. בלון בדיקה על ידי היכולת לשמור על לחץ (~ 100 במשך שעה לפחות 1 מ"מ כספית)
2. הכנת מערכת זלוף לב מבודדת
- בתחילה, לשטוף ולחמם את המערכת. הפעל circulator אמבט מים חמים 37 מעלות צלזיוס שכבר מחובר למנגנון Langendorff, ולמלא את מאגר חיץ עם מים מזוקקים. חבר מסנן סיבי זכוכית חדש לצינורות זורם לתוך מכשיר ולהפעיל משאבה כדי לשטוף את המערכת. במהלך זמן הכנה, לנטר את הטמפרטורה של מים גורשו מגוש Langendorff באמצעות בדיקה טמפרטורה, על מנת להבטיח שאמבט המים מוגדר בצורה מדויקת. כמו כן, להפעיל משאבת circulator קירור ולהגדיר עד 20 מעלות צלזיוס, שתשמש בעת מעצר cardioplegic של הלב.
- אניn בינתיים להכין את הפתרונות הבאים. הכן 1 ליטר של פתרון cardioplegia (110 מ"מ NaCl, 16 מ"מ KCl, 16 מ"מ MgCl 2, 1.5 מ"מ CaCl 2, 10 מ"מ NaHCO 3) ומסנן. כמו כן, להכין 2 ליטר של KHB (118 מ"מ NaCl, 4.8 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ KH 2 PO 4, 1.7 מ"מ MgSO 4, 2 מ"מ Na-פירובט, דקסטרוז 6 מ"מ, 24.9 מ"מ NaHCO 3 (טרום-מוגזים עם CO 2) , 1.4 מ"מ CaCl 2 (הוסיף שעבר). ברגע שנמסו, להסיר משקעים ידי סינון לתוך בקבוק בעזרת זכוכית 5 מיקרומטר fritted משפך. מקום קצת לתוך צלחת קטנה על קרח לשימוש במהלך ניתוח ובידוד.
- חמצן perfusate (KHB) עם 95% O CO 2/5% 2 לפחות 30 דקות לפני השימוש. מערכת perfuse Langendorff עם KHB כדי להסיר כל מים שנותרו ממערכת וחיץ מאגר. לעכברים, לקבוע את מהירות משאבה הראשונית ל~ 2.0 מיליליטר / דקה. מניחים 2-0 ו4-0 תפרי משי ליד צינורית זלוף. הפעל את המשאבה עד צינורות ומכשירים מלאים שנינותperfusate שעות ולהבטיח strup הבועה מתמלא perfusate.
הערה: לתקופות של זלוף ותפקוד יציב זמן זה מומלץ מאוד להתקין מסנן סיבי זכוכית ב- קו (~ מיקרומטר 1) במעגל זלוף לאסוף כל משקעים שיכולים ליצור קרישים בלב
3. ניתוח עכבר
3.1) עכבר הרדמה וטיפול
- הכן מזרק עם חומר הרדמה במינון של 80 מ"ג / קילוגרם קטמין ו -5 מ"ג / תערובת xylazine מיליליטר, ולהוסיף מלח 0.9% סטרילי כדי להעלות את הנפח 0.2 מיליליטר. הזרק הפרין IP (50 μl של 1,000 U / פתרון מיליליטר).
- מניחים את העכבר בחזרה לתוך מיכל תחבורה (~ 10-20 דקות) ולחכות שזה אבד את ההכרה כהפרין ייכנס לתוקף. מעת לעת לעשות קמצוץ הבוהן כדי לפקח רפלקס כאב.
3.2) הסר את הלב
- ברגע שהעכבר הוא מודע באופן מלא ואינו מגיב לקמצוץ הבוהן, לאבטח אותו לשולחן ניתוחים מתאימים באמצעות סיכות או 25 G טיפים מזרק דרך הגפיים. לבצע פתיחת בית החזה כדי לחשוף את הלב. לחתוך חור קטן ממש מתחת לעצם החזה ולהרחיב את החתך לצדדים של עכבר הימנעות הסרעפת.
- במהירות לחתוך את הסרעפת ולאחר מכן במהירות לחתוך את הצדדים של כלוב הצלעות. להעיף בחזרה כלוב הצלעות כמו פגז צדפות לחשוף את חלל בית החזה. אוחז בעדינות בלב, מקום מספריים מתחת ולהסיר את הלב.
הערה: זה חיוני כדי להסיר במהירות את הלב ברגע שהוא נחשף בחלל בית החזה והריאות שאינן פונקציונליות.
3.3) נקה את הלב
- מניחים את הלב לKHB הקר כקרח המכיל המנה ולקצץ את כל חתיכות גדולות של רקמת ריאה המצורפת. שימוש במלקחיים כדי להרים את הלב ולאתר את אב העורקים. יש ללחוץ בעדינות הלב ולחפש כל דם שמופיע, כמו זה צריך להיות הסוף הפתוח של אב העורקים. השתמש פינצטה קצה הקנס להחזיק הלב עד הסוף הפתוח של אב העורקים.
4.1) התקנה וCannulating הלב
- לפני הובלת הלב למנגנון Langendorff, להפעיל את המשאבה על מנת להבטיח כי לחץ זלוף הוא נמוך (~ 20 מ"מ כספית). החזק את הלב על ידי אב העורקים מתחת לצינורית. באמצעות קבוצה נוספת של פינצטה קצה קנס, לפתוח בזהירות את אב העורקים ולהחליק את לב על הצינורית. להחזיק אותו במקום עם סט אחד של פינצטה ולאחר מכן להשתמש בקליפ קצוות רך כדי לאבטח אותו באופן זמני לצינורית.
הערה: במהירות הגוברת הלב לצינורית זלוף היא קריטית להכנה טובה. עם ניסיון, הנהלים מפתיחת חלל בית החזה עד ההרכבה הלב צריכים לקחת בין 1 ו- 2 דקות. - עניבה וליזום זלוף כדלקמן, באמצעות אב העורקים מאובטחים תפר 4-0 משי לצינורית ישירות מתחת לסרטון. ודא העניבה היא גם סביב צינורית אב העורקים מתכת, כך אב העורקים אינו מקבלים קשורים כבוי כאשר הידוקאת הקשר. ברגע שעניבה אחד ממוקמת היטב, להסיר את הסרטון.
- השתמש תפרי משי נוספים להדק את אב העורקים היטב לצינורית והקפד לקשור את המשך כל סניפי כלי שניתן יורדים אב העורקים. אלה לעתים קרובות יכולים להיות הבחינו על ידי דולפים perfusate או ירי מ- אב העורקים.
הערה: בשלבים הראשונים של זלוף הדם צריכה להיות שטיפה מהלב וכל הלב אמור להופיע בצבע ורוד רך. הכתמים כהים שלא לשטוף את מצביעים אזורי איסכמי הנראה בשל תסחיפי אוויר או קרישים והלב לא אמור לשמש.
4.2) מדידת זלוף וLVP הקמת
- לאט לאט להגביר את לחץ זלוף ולהגדיל את מהירות משאבה עד לחץ זלוף מגיע 70 מ"מ כספית.
הערה: לחצי זלוף תקן לזלוף עכבר יכולים להיות 70-90 מ"מ כספית, אבל חייב להישמר קבוע מחיה לחיה בתוך ניסוי. - נקה את הרקמה (הריאה הנותרת, בלוטת התריס וכו ') שעשוי עדיין להיות מחובר ללב. השתמש במספריים כדי לחתוך את פרוזדורי השמאל כדי ליצור פתיחה לתוך החדר השמאלי.
- מניחים את הבלון על בעל ולהוציא את האוויר. מקם את צינורית הבלון ליד צינורית אב העורקים, ישירות על הפתיחה לתוך החדר השמאלי. בזהירות להכניס בלון כלפי מטה לתוך החדר השמאלי תוך החזקת הלב במקום כל כך את אב העורקים לא ייקרעו.
- ברגע שזה במקום להתחיל לאט לנפח את הבלון עד LVEDP מגיע ~ 8 מ"מ כספית. מניחים את הבדיקה הטמפרטורה נגד החלק התחתון של לב כל כך שהוא מודד את הטמפרטורה של השפכים.
4.3) מדידה בסל
- לאטום את הלב בתא זלוף מים במעייל. במהלך תקופה זו ברציפות ינקב הלב עם KHB, ולהבטיח שהטמפרטורה ממשיכה לעלות. לנטר את הטמפרטורה ולהתאים את אמבט המים בהתאם עד שהוא מגיע כ ~ 37 מעלות צלזיוס.
הערה: טמפרטורות ניטוריור בשלבים הראשוניים של זלוף הוא קריטי כתזרימי כלילית ולאחר מכן טמפרטורה יכולה להשתנות מלב אל לב. טמפרטורה של perfusate השפכים מנוטרת לטמפרטורה רצויה באמצעות שריר לב בדיקה טמפרטורה ממוקמת בשיא של הלב. בנוסף, בהשוואה לפרוטוקולים זלוף Langendorff אחרים, הלב אינו שקוע בCP או KHB במהלך זלוף או מעצר, זה נעשה בעיקר כדי להתאים טמפרטורה במהירות, כמו גם לספק משלוח CP יעיל ללא דיפוזיה. - תתחיל להקליט ברציפות מדידה פונקציונלית באמצעות מערכת רכישת נתונים המצורפת לחיישנים המתאימים, כולל לחץ זלוף, לחץ של חדר השמאלי (מתמר לחץ המחובר לבלון LVP), טמפרטורה, ופרמטרי אלקטרו (EKG, MAP אם כן מצויד) (קובץ מצורף יהיה על פי יצרנים וספציפיים לחיישנים הבודדים ונתוני מערכת רכישה). ברגע שKHB השפכים מגיע ~ מעלות צלזיוס 37 לפחות 15 דקות ופרמטרים תפקודיים לב יציבים, שים לב לזמן למדידות בתחילת המחקר.
הערה: קריטריונים להכללה / אי הכללה חלות על כל לב. LVDP של <60 מ"מ כספית בתחילת המחקר מצביע על לב שיש להסיר מניתוח. בנוסף, זרימה כלילית> 4.5 מיליליטר / דקה, או חוסר יכולת לשמור על לחץ זלוף בתחילת המחקר מציינת שקיים דליפה או אב העורקים נקרעו. כמו כן כל לב שיש לי אזורים ברורים איסכמי שניתן לאשר באופן חזותי (כלומר, קריש) או הפחתה הקשורים איסכמיה תערוכה בתפקוד לב (כלומר, הגדלת LVeDP, מאוד בקצב לא סדיר) יוסרו מניתוח. - למדוד את הזרימה כלילית באמצעות אוסף של השפכים כליליים בגליל סיים דקות 1. סגור את התא ולאפשר טמפרטורה ולתפקד לחזור לערכי בסיס. לחלופין למדוד את הזרימה כלילית ברציפות בקו זלוף באמצעות זרימת בדיקה הניחה אחרי מעגל ההקלה לחץ.
- מקום חיץ cardioplegia הקר 100 מיליליטר למאגר אחר ו. להעביר את צינורית מאגר KHB למאגר cardioplegia.
- לנתק את דיור מים במעייל ומעגל התחממות זלוף מאמבט המים החם ולהתחבר לcirculator הקירור באמצעות צינורות ניתוק מהיר. השתמש circulators חימום והקירור הנפרד כדי לאפשר שינויי טמפרטורה מהירים של הלב וperfusate.
- בצע את בועת האוויר שמקבל הציגה לתוך צינורות במתג, וברגע שהוא מגיע ליד הלב המבודד להתחיל העיתוי לcardioplegia. לספק cardioplegia למשך 2 דקות. לאחר המנה הראשונית להפסיק את המשאבה. ודא לעצור את הלב בירוויח ולהיות קרובים לטמפרטורה הרצויה CP.
הערה: מלכודת בועה מספיק יש צורך להימנע מתסחיפי אוויר בלב. לחלופין מערכת מסירה לשני המאגרים עברו על ידי ברזלים ניתן לבנות בקלות, עם זאת אנו מוצאים מעקבing הבועה הקטנה האוויר שהוא הציג, כאשר החלפת הצינורית בין מאגרים, שיטה קלה של משלוח CP עיתוי נתנה מהירויות משאבה שונות שעלולים להיות בין ניסויים (כלומר, בשל עכבר / עכברוש, לחץ זלוף, התנגדות מסנן, וכו '.) - שמור את הלב בcardioplegia לשעה 2 ב ~ 20 מעלות צלזיוס. כל חצי שעה במהלך CP להפוך את המשאבה בחזרה על דקות 1 כל כך מנה נוספת מנוהלת.
הערה: מינונים לסירוגין של CP בכל 30 דקות תוצאות בליקוי תפקודי של הלב ללא נמק של הרקמה. תקופות ארוכות יותר בין המינונים של CP (כלומר,> 45 דקות) יכולות לגרום לנימק והתכווצות איסכמי ויהיה מתאים יותר למודל של פגיעת נמקים הקשורים איסכמיה לא מוגנת.
6. reperfusion
- בסופו של CP, להעביר את צינורית המאגר בחזרה לKHB החומץ. חבר את מעגלי בקרת הטמפרטורה לcirculator החימום ולהפוך את המשאבהעל להתחיל reperfusion. בשלב cardioplegia שוטף את זה, לראות את עליית הטמפרטורה והלב מתחיל לפעום שוב לאחר 2-4 דקות של reperfusion. כאשר הלב מתחיל פעימות הלב היא איטיות ולעתים קרובות בקצב לא סדירה.
הערה: יש בדרך כלל לא עלייה גדולה בLVP הדיאסטולי (כלומר, ≤10 עליית מ"מ כספית) אשר לעתים קרובות אופייני בדגמי איסכמיה טהורים. הפרעות קצב יכול להימשך גם לתוך reperfusion ומדי פעם הלב צריך להיות defibrillated. זו יכולה להיות מושגת תוך השימוש בסט ממריץ למתחים גבוהים יותר (~ 10-50 V) ואלקטרודות המונחים בבסיס ושיאו של הלב. - לאפשר ללב reperfuse למשך 30 דקות, ובמהלך פרק זמן זה ייקח מדידות זרימה כלילית בהתאם לצורך. למדוד את הזרימה כלילית על ידי איסוף השפכים בגליל סיים 30-60 שניות.
7. איסוף רקמות
- להוציא את האוויר הבלון ולהסיר אותו מהחדר השמאלי. קח את הלב מצינורית ולשקול אותו. בניסויים ראשוניים, פרוסה רוחבית אחד לפחות של הלב יש לנקוט וTTC מוכתם להעריך נמק כדי להבטיח שהלב הוא ללא כל פגיעת נמקים.
- לאסוף פרוסות לב ללימודי מיקרוסקופיה, משקולות רטובות / יבשות, וכו 'השארית או כל הלב צריך להיות קפוא במהירות על ידי הצבת לתוך חנקן נוזלי. לבבות חנות קפוא במקפיא ºC -80.
הערה: למדידה של תרכובות אנרגיה גבוהה פוספט (כלומר, ATP, קריאטין פוספט), יש להקפיא את לבם באופן מיידי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג תוצאות טיפוסיות מניסוי עכבר אחד. LVP (קו אדום), DP / DT (קו ירוק), וטמפרטורה (קו סגול) נרשמו continusouly על ~ 3 שעות. מכתבים מצביעים - מדידת בסיס, B, C, D, E - משלוח של פתרון cardioplegia, ו - תחילת reperfusion, G, H, I, J - מדידה של זרימת cornary במהלך reperfusion. הערה, LVDP המדוכא וDP / DT על reperfusion לעומת תחילת המחקר. איור 1 כולל את הנתונים מ~ 2 שניות נרשמו מעל. שים לב, הירידה בLVP וDP / DT דומה ל, ירידות קלות בעליות HR וקלים בLVEDP. בדרך כלל לאחר 30 דקות של reperfusion יש ירידה ~ 40% בתפקוד לב כפי שמעיד LVDP הלחץ פיתח החדר השמאלי מתואר באיור 1 ג.
1. תוצאת נציג איורים של כל ניסוי. הקלטה () עזבה לחץ חדרית (למעלה), נגזרת הראשונה של לחץ LV, וטמפרטורה. הקלטות מרווח (ב) קצרות כדי לראות פירוט עקבות וQuantitation (C) של לחץ של החדר השמאלי מפותח (LVDP) לניסויים מרובים (n = 6). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטות פרטי פרוטוקול הקודמת להעריך מדהים משנית שריר לב לאיסכמיה הגלובלית הקשורים מעצר cardioplegic. בידיים שלנו פרוטוקול זה מייצר ירידה של 40% בקירוב ~ בתפקוד לב (LVDP, +/- DP / DT) עם שינויים מינימאליים בקצב לב בנקודת הזמן שלאחר reperfusion-30 דק '. כלב reperfused ומחמם מחדש את כל הפרמטרים של תפקוד לב מופחתים בנקודות זמן ראשוניות עם קצב לב מופחת במידה ניכרת לפני הייצוב בין 20 ל 30 דקות. זרימה כלילית היא בדרך כלל גדלה מאוד במהלך reperfusion המוקדם בשל hyperemia, ואז נופלת ל~ 20-30% פחות מרמות השליטה הבאות 30 reperfusion דקות.
חשוב לזכור כי בשריר הלב מדהים על ידי הגדרה צריך לעזוב את הלב החופשי של מוות של תאים ונימק שאופייני לאיסכמיה הטהורה / מודלים MI (כלומר,> 20 דק 'לא איסכמיה האזורית זרימה). מחקרים ראשוניים צריכים להעריך histol רקמהogy כדי להבטיח חוסר פציעת נמקים. בנוסף, למרות שמדהים בשריר הלב על ידי הגדרה צריך לגרום לתפקוד תקין לאחר reperfusion הממושך (שעות עד ימים), סביר להניח פרוטוקול זה לא להפגין התאושש לחלוטין פונקציה בשל לשעבר vivo זלוף Langendorff אשר מזוהה עם reductons בתפקוד לב בשליטה לב perfused לאורך זמן. עם זאת שינויים בהתאוששות החריפה של תפקוד לב בהעדר המוות של תאים / נמק יכול לשמש כמדדים של חומרת ההבדל העיקרי המדהים בפרוטוקול זה לעומת פרוטוקולי איסכמיה ללא זרימה קלאסיות הוא השימוש באסטרטגיה לבבית, ב מקרה זה להיות cardioplegia hyperkalemic. פתרונות cardioplegia Hyperkalemic לספק הגנה מפני פגיעת נמקים והמוות של תאים על ידי גרימת דום לב הדיאסטולי. מעצר הדיאסטולי של הלב מקדם שימור מאגרי אנרגיה. בנוסף, פרוטוקולים הלבביים ביותר בשימוש קליני להשתמש היפותרמיה לli נוסףפציעה בשריר הלב mit על ידי הקטנת ביקוש חילוף חומרים. גורמים אחרים שיכול להיות מווסת בפרוטוקול לעיל כוללים ניסוחים שונים של פתרונות cardioplegia (ניסוחים hyperpolarizing, Mg ++, + רמות K, וכו '), אסטרטגיות (,' ירה חם 'לעומת חם קר, וכו'), ותרופות שונות (קינאז מעכבים, מאפנני יון ערוץ, סוכנים על הלב, וכו ').
מאז הלב נמצא במצב יחסית מוגן היטב, כדי לקבל ליקויים תפקודיים לשחזור במודל זה דורש בהכרח פעמים איסכמיה ארוכות יותר (כלומר, יותר מ -2 שעות). מצאנו כי לב מכרסם עמיד יחסית לפגיעה במודל זה, במיוחד בהשוואה לבעלי חיים גדולים יותר (חזירים, בני אדם) אשר באופן מהימן להציג שריר הלב המום בתקופות הרבה יותר קצרות (כלומר, 30 דקות). יש לנו גם מצא כי משלוח לסירוגין יש צורך להגן על הלב מפני נזק איסכמי חמור כfollo מרווח 45-60 דקותמשלוח CP אגף יכול לגרום בעיות בתפקוד הדיאסטולי ברוטו, התכווצות איסכמי, ופגיעה ברקמות על reperfusion. רכיבים להתאמה בקלות אחרים של הפרוטוקול יכולים לכלול חקירות הקשורות למרכיבי מחסום והתפקיד של היפו / מעצר normothermic כמו גם אסטרטגיות מעצר שונות לא סומכים על K + (חוסמי Na ערוץ, סוכני hyperpolarizing) 3.
ישנם גם מספר המגבלות חשובים בטכניקה זו כאשר נעשה שימוש במודל מדהים הקשורים לניתוח לב קליני. ראשית, רוב ברוטו של פתרונות CP קליניים מעורבבים עם דם (~ 4 דם: יחס CP 1). זה בדרך כלל לא אפשרי בעכברים עקב זלוף מעגלי הנפח, כמו גם את הצורך בoxygenators צינורות והסיבים שטופל. גם בעלי חיים תורמים לעתים קרובות לבעלי חיים גדולים יותר (שרקנים / ארנבים) יהיו צורך. בנוסף, כמו בכל דגמי האיבר המבודדים, ההשפעה של גורמים היקפיים (כלומר, אותות דלקתיים, דם מחדשזלוף, וכו ') הוא התעלם לחלוטין. עם זאת הוא מודל מעשי, יעיל וחסכוני למחקרים ראשוניים לבדיקת תוספים תרופתיים ואסטרטגיות לבביות שונות.
הפרוטוקול הוא בעצם אותו הדבר בלב חולדה, למעט בלון גדול ו13,14 צינורית אב העורקים. בנוסף, הכנת לב החולדה דורשת שיעורים גבוהים יותר באופן משמעותי את הזרימה (12-20 מיליליטר / דקה). בשל גודלה, הכנת לב העכברוש היא קלה יותר באופן משמעותי כדי ללמוד וreproducibly לבצע. כדי להעריך סוגים אחרים של פגיעה וכתוצאה מכך שריר הלב מדהים הפרוטוקול ניתן לשנות בקלות. לחקות פציעת איסכמי הפיכה, פשוט לעצור את משאבת זלוף לתקופות קצרות. בחולדות ~ איסכמיה העולמית 20 דקות תגרום פונקצית התכווצות מופחתת ללא תופעות ברוטו על מוות של תאים ואוטם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardioplegia Solution (St Thomas II) | Symbol / Concentrations (mM) | ||
| Sodium Chloride | NaCl; 110 | ||
| Potassium chloride | KCl; 16 | ||
| Calcium Chloride | CaCL2; 1.5 | ||
| Magnesium Chloride | MgCL2; 16 | ||
| Sodium Bicarbonate | NaHCO3; 10 | ||
| Krebs-Heinslet Buffer | |||
| Sodium Chloride | NaCl; 118 | ||
| Potassium Chloride | KCl; 4.8 | ||
| Magnesium Sulfate | MgSO4; 1.7 | ||
| Sodium Bicarbonate | NaHCO3; 24.9 | ||
| Potassium Phosphate (monobasic) | KH2PO4; 1.2 | ||
| Calcium Chloride | CaCL2; 1.4 | ||
| Sodium Pyruvate | Na pyruvate; 2 | ||
| Glucose | C6H12O6; 6 | ||
| Balloon reagents | |||
| Corn Syrup | |||
| Spaghetti | |||
| Silicon Dispersion Gel | |||
| styrofoam block | |||
| lab oven/incubator ( 50C) | |||
| Langendorff Perfusion equipment | |||
| Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent) | |||
| Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent) | |||
| Heated water circulator | |||
| Cooling water circulator | |||
| Perfusion pump capable of 2-30 ml/min | |||
| Inline perfusion filters - 1 um glass fiber | |||
| Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure | |||
| Small graduated cylinder (~10 mL) | |||
| Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent) | |||
| perfusion resevoir (1L) | |||
| cardioplegia resevoir (~200 mL) | |||
| gas bubbler | |||
| 95/5 O2/CO2 mix | |||
| Surgical tools and reagents | |||
| Metzenbaum and Potz surgical scissors | |||
| two Dumont size 5 forceps | |||
| ketamine | |||
| xylazine | |||
| heparin | |||
| small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends) | |||
| Silk 2-0 and 4-0 sutures |
References
- Kloner, R. a, Jennings, R. B. Consequences of Brief Ischemia: Stunning, Preconditioning, and Their Clinical Implications: Part 1. Circulation. 104 (24), 2981-2989 (2001).
- Mentzer, R. M. Myocardial protection in heart surgery. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 16 (3-4), 290-297 (2011).
- Chambers, D. J., Fallouh, H. B. Cardioplegia and cardiac surgery: pharmacological arrest and cardioprotection during global ischemia and reperfusion. Pharmacol Ther. 127 (1), 41-52 (2010).
- Bolli, R., Marbán, E. Molecular and cellular mechanisms of myocardial stunning. Physiol Rev. 79 (2), 609-634 (1999).
- Kloner, R. a, Bolli, R., Marban, E., Reinlib, L., Braunwald, E. Medical and Cellular Implications of Stunning, Hibernation, and Preconditioning An NHLBI Workshop. Circulation. 97 (18), 1848-1867 (1998).
- Mersmann, J., Latsch, K., Habeck, K., Zacharowski, K. Measure for measure-determination of infarct size in murine models of myocardial ischemia and reperfusion: a systematic review. Shock (Augusta, Ga). 35 (5), 449-455 (2011).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion). J Mol Cell Cardiol. 50 (6), 940-950 (2011).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. Mouse isolated perfused heart characteristics and cautions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (11), 867-878 (2003).
- Guide for the Care and Use of Laboratory AnimalsSource. , National Research Council. Available from: http://grants.nih.gov/grants/olaw/Guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Miller, A., Wright, G. L. Fabrication of Murine Ventricular Balloons for the Langendorff Heart Preparation. J Biotecnol Biomater. 1 (101), 1-4 (2011).
- Curtis, M. J. Characterisation, utilisation and clinical relevance of isolated perfused heart models of ischaemia-induced ventricular fibrillation. Cardiovasc Res. 39 (1), 194-215 (1998).
- Clements, R. T., Feng, J., Cordeiro, B., Bianchi, C., Sellke, F. W. p38 MAPK-dependent small HSP27 and αB-crystallin phosphorylation in regulation of myocardial function following cardioplegic arrest. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 300 (5), H1669-H1677 (2011).
- Clements, R. T., Cordeiro, B., Feng, J., Bianchi, C., Sellke, F. W. Rottlerin increases cardiac contractile performance and coronary perfusion through BKCa++ channel activation after cold cardioplegic arrest in isolated hearts. Circulation. 124 (11 Suppl), S55-S61 (2011).
