Tridimensional modelo de co-cultura para Interaction Tumor estromal-

Summary

Aqui apresentamos um protocolo de co-cultura em três dimensões, que é útil para investigar interações multicelulares e modulação dependente de matriz extracelular do comportamento das células cancerígenas. Neste modelo experimental, as células cancerígenas são cultivadas em géis de colágeno incorporados com fibroblastos associados ao câncer humano.

Abstract

A progressão do câncer (iniciação, crescimento, invasão e metástase) ocorre por meio de interações entre células malignas e as células estromais tumorais circundantes. O microambiente tumoral é composto por uma variedade de tipos de células, como fibroblastos, células imunes, células endoteliais vasculares, pericitos e células derivadas da medula óssea, incorporadas na matriz extracelular (MEC). Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) têm um papel pró-tumorigênico por meio da secreção de fatores solúveis, angiogênese e remodelamento da MEC. Os modelos experimentais para sobrevivência, proliferação, migração e invasão de células cancerígenas basearam-se principalmente em culturas de tecidos monocelulares e monocamadas bidimensionais ou ensaios de câmara de Boyden. No entanto, esses experimentos não refletem precisamente as condições fisiológicas ou patológicas em um órgão doente. Para obter uma melhor compreensão das interações estromais tumorais ou da matriz tumoral, as culturas multicelulares e tridimensionais fornecem ferramentas mais poderosas para investigar a comunicação intercelular e a modulação dependente de ECM do comportamento das células cancerígenas. Como plataforma para este tipo de estudo, apresentamos um modelo experimental no qual as células cancerígenas são cultivadas em géis de colágeno incorporados com culturas primárias de CAFs.

Introduction

O tecido canceroso pode ser percebido como um tipo de órgão, que evolui por meio de interações estreitas entre o câncer e o microambiente estromal tumoral, composto por fibroblastos associados ao câncer (CAFs), células imunes, vasos tumorais e a matriz extracelular (MEC). Os CAFs são a principal fonte de fatores solúveis (citocinas, fatores de crescimento e quimiocinas) que exercem efeitos mitogênicos, pró-migratórios e pró-invasivos sobre as células cancerígenas. Eles também estimulam a formação de vasos tumorais e recrutam células precursoras, como células derivadas da medula óssea (BMDC). Os CAFs ativados estão envolvidos na produção e remodelação da MEC, promovend....

Protocol

NOTA: Este estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética apropriados.

1. cultura primária de pulmão fibroblastos humanos

1. Coleta de tecido pulmonar:
   1. Obter amostras de tecido pulmonar humanos da sala de operação cirúrgica diretamente. Recolha cerca de 1 cm a ³ quarteirões do tecido pulmonar cancerosos e não cancerosos, com a amostra não-cancerosas recolhido o mais longe possível do tumor.
   2. Suspender as amostras em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 0,25 ng / mL de anfotericina B (meio isento de soro). Manter as am....

Results

Este método de co-cultura, imitando o microambiente tumoral, é uma ferramenta útil para pesquisar as interacções entre as células cancerosas e fibroblastos embebidos no gel de colagénio. No estudo anterior, os três parâmetros foram avaliados neste modelo experimental: contração gel de colágeno, a invasão das células do câncer e alteração morfológica. Proliferação de células cancerosas também foi estimado usando Ki67 immunostaining ^4. Amostras de tecido pulmonar foram colhidos a partir de secções cancerosas e .......

Discussion

FAC formam um dos principais componentes da MEC células cancerosas e não apenas fornecer um andaime para o tumor, mas também participar activamente no desenvolvimento do tumor ^7. As evidências acumuladas desvenda o impacto da FAC ou suas moléculas relacionadas à eventual prognóstico, com destaque para os papéis críticos de progressão do tumor CAF mediada ^8.

No estudo anterior, foram empregados método consequência de isolar FAC pulmonares ^4. Nesta experiência,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
FBS	GIBCO	10437
Colágeno tipo IA	Nitta gelatina Inc.	CELL-1A
Tampão de reconstituição	Nitta gelatina Inc.
Lamínula	NUNC	174934
Graxa de silicone	Dow Corning Toray	Graxa
Dispase I	WAKO	386-02271
Placa de 6 poços	BD Falcon	353046
Cell strainer (70 μ m)	Falcão BD	352350