Generazione di cellule staminali adiposo umano attraverso dedifferenziazione di adipociti maturi in Culture soffitto

Summary

Gli adipociti maturi possono rappresentare un'abbondante fonte di cellule staminali attraverso la dedifferenziazione, che porta a una popolazione omogenea di cellule simili a fibroblasti. La digestione della collagenasi viene utilizzata per isolare gli adipociti maturi dal grasso umano. L'obiettivo del nostro protocollo è quello di ottenere cellule adipose multipotenti e dedifferenziate da adipociti maturi umani.

Abstract

Gli adipociti maturi hanno dimostrato di invertire il loro fenotipo in cellule simili a fibroblasti in vitro attraverso una tecnica chiamata coltura a soffitto. Gli adipociti maturi possono anche essere isolati da tessuto adiposo fresco per la caratterizzazione specifica del deposito della loro funzione e delle loro proprietà metaboliche. Qui, descriviamo un protocollo consolidato per isolare gli adipociti maturi dai tessuti adiposi utilizzando la digestione della collagenasi e i passaggi successivi per eseguire colture a soffitto. In breve, i tessuti adiposi vengono incubati in un tampone Krebs-Ringer-Henseleit contenente collagenasi per distruggere la matrice tissutale. Gli adipociti maturi galleggianti vengono raccolti sulla superficie superiore del tampone. Le cellule mature vengono piastrate in un pallone T25 completamente riempito di terreno e incubate capovolte per una settimana. Un approccio alternativo di coltura su piastra a 6 pozzetti consente la caratterizzazione di adipociti in fase di dedifferenziazione. La morfologia degli adipociti cambia drasticamente nel corso della coltura. L'immunofluorescenza può essere facilmente eseguita su vetrini coltivati in piastre a 6 pozzetti, come dimostrato dalla colorazione in immunofluorescenza FABP4. La proteina FABP4 è presente negli adipociti maturi ma è sottoregolata attraverso la dedifferenziazione delle cellule adipose. La dedifferenziazione degli adipociti maturi può rappresentare una nuova strada per la terapia cellulare e l'ingegneria tissutale.

Introduction

La dedifferenziazione in vitro degli adipociti maturi si ottiene attraverso una tecnica chiamata coltura del soffitto¹. A causa della loro naturale tendenza a galleggiare in soluzioni acquose, gli adipociti maturi isolati aderiscono alla superficie di un pallone capovolto completamente riempito di terreno di coltura. Nel giro di pochi giorni, le cellule modificano la loro morfologia sferica e diventano cellule simili ai fibroblasti. Le cellule risultanti, chiamate cellule adipose dedifferenziate (DFAT), sono multipotenti². Gli articoli di ricerca sulla dedifferenziazione degli adipociti, in particolare sulle cellule umane, sono limitati.....

Protocol

Dichiarazione etica: Il progetto è stato approvato dal Comitato Etico della Research IUCPQ prima del reclutamento dei pazienti. Ai fini del presente articolo / video, abbiamo ottenuto i tessuti da 2 pazienti: 1) A 62 anni, paziente di sesso maschile con un BMI di 50,7 kg / m ² e 2) 35 anni paziente di sesso femminile con un BMI di 57 kg / m ^2. Esperimenti può essere fatto con due scomparti grasso, ma sono limitati a un compartimento grasso ai fini di questo video. Aspetti tecnici del video sono state effettuate con il paziente e 1 FABP4 immunofluorescenza è stata eseguita con le cellule dedifferenziate da paziente 2.

E....

Results

Importanti cambiamenti morfologici avvengono a maturare adipociti durante dedifferentiation (Figura 1). Come mostrato in Figura 2, le cellule in fase dedifferentiation state colorate con un anticorpo anti-FABP4 per analisi di fluorescenza. Le cellule con una morfologia rotonda espresso la proteina FABP4 mentre la maggior parte delle cellule di fibroblasti, come non ha fatto. Dopo dedifferentiation, cellule DFAT possono essere coltivati ​​con procedure standard per diversi passaggi. Siam.......

Discussion

Dedifferenziazione di adipociti maturi con la tecnica di coltura soffitto è un nuovo approccio per ottenere cellule staminali adipose da un piccolo campione di tessuto adiposo nativo. Sulla base della nostra esperienza e quella di altri ^2, un grammo di tessuto è sufficiente al piatto un pallone da 25 cm ² e per ottenere una popolazione di cellule DFAT per i quali l'omogeneità è stata dimostrata da Poloni e collaboratori ^3. Adipociti dedifferentiation sembra possibile con le cellule d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumina sierica bovina	Sigma	A7906
Adenosina	Sigma	A4036
Acido ascorbico	Sigma	A0278
NaCl			È possibile utilizzare qualsiasi marca
KCl			È possibile utilizzare qualsiasi marca
CaCl2			Qualsiasi marca può essere utilizzata
MgCl2			Qualsiasi marca può essere utilizzata
KH2PO4			Qualsiasi marca può essere utilizzata
HEPES			Qualsiasi marca può essere utilizzata
Glucosio			Qualsiasi marca può essere utilizzata
I collagenasi	Worthington Biochemical Corp	LS-004196
DMEM/F-12, HEPES, senza rosso fenolo	Gibco-Life Technologies	11039-021	Aggiungi al terreno : 20% siero di vitello, gentamicina (50 µ g/ml) e fungizone (2,5 µ g/ml)
Siero di vitello, integrato con ferro, da vitelli alimentati con latte artificiale	Sigma	C8056-500 ml
1/2 In boccola di plastica	Iberville	2704-CP	SKU:1000120918 (Home Depot)
Azoto liquido	Soluzione di formalina Linde
, tamponato neutro, 10%	SIGMA	HT501128
Pinzetta
Forbici
Siringhe da 60 cc	Siringa
Tubo di plastica Tampone
madre Krebs-Ringer-Henseleit (KRH)			Preparare il tampone madre come segue: 25 mM HEPES pH 7,6, 125 mM NaCl, 3,73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2,5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Regolare il pH a 7,4.
Tampone di lavoro Krebs-Ringer-Henseleit (KRH-WB)			Aggiungere i seguenti componenti freschi al tampone KRH: 4% di albumina sierica bovina, 5 mM di glucosio, 0,1 e micro; M adenosina, 560 &; M acido ascorbico
KRH-WB integrato con collagenasi			Aggiungere 350 U/ml di collagenasi di tipo I
T25 fiaschetta per coltura tissutale con tappo non ventilato	Sarsted o altra marca
Piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti	BD Falcon o altra marca
Vetro di copertura per microscopio 22x22	Fisherbrand	12-542-B
Becher		sterili