Protocol
Dichiarazione etica: Il progetto è stato approvato dal Comitato Etico della Research IUCPQ prima del reclutamento dei pazienti. Ai fini del presente articolo / video, abbiamo ottenuto i tessuti da 2 pazienti: 1) A 62 anni, paziente di sesso maschile con un BMI di 50,7 kg / m 2 e 2) 35 anni paziente di sesso femminile con un BMI di 57 kg / m 2. Esperimenti può essere fatto con due scomparti grasso, ma sono limitati a un compartimento grasso ai fini di questo video. Aspetti tecnici del video sono state effettuate con il paziente e 1 FABP4 immunofluorescenza è stata eseguita con le cellule dedifferenziate da paziente 2.
Elaborazione 1. Campione
- Chiedi chirurghi a raccogliere il tessuto adiposo dal comparto grasso omentale e sottocutaneo, al momento della chirurgia bariatrica laparoscopica.
- Portare rapidamente campioni adipose al laboratorio a temperatura ambiente ed elaborare immediatamente.
- Eseguire la digestione in laboratorio, in un ambiente non sterile. Ilcellule saranno eventualmente trasferiti nel locale cultura e coltivati in condizioni sterili. Per evitare la contaminazione, preparare tampone KRH con acqua distillata e filtrata e seguire da una filtrazione (filtro 0.22μM) prima della digestione. Tubi accuratamente puliti con etanolo prima cessione nel cofano coltura cellulare per pallone e preparazione piastra.
- Collocare il tessuto adiposo su un piatto pre-pesate e il peso record. Fissare una piccola parte di ogni campione di tessuto (meno di 1 cm 2) in 10% formalina tampone a temperatura ambiente per almeno 24 ore prima della paraffina. Utilizzare questo esempio incorporato per esperimenti di immunoistochimica (tecnica non mostrato).
- Inserire un altro pezzo in una provetta da 50 ml e flash-congelamento in azoto liquido prima della conservazione a -80 ° C per ulteriori studi sui tessuti adiposi interi (ad esempio, l'espressione genica - tecnica non mostrati).
2. Collagenase Digestione
- Posizionare il restante pezzo di tessuto adiposo in un ml tu 50essere per la digestione.
- Aggiungere 4 ml di KRH-WB integrati con collagenasi (350 U / ml) per grammo di campione nel tubo di digestione.
- Tritate tessuto adiposo con le forbici.
- Inserire sospensione tessuto adiposo macinate in un agitatore, 37 ° C, 90 rpm massima, per una incubazione di 45 minuti (massimo 1 ora).
3. Purificazione di adipociti e preadipociti
- Versare la soluzione traslucido con pochi pezzi di grasso attraverso un nylon 400 micron maglia in un bicchiere di plastica.
- Con pinzette, strofinare la preparazione cellulare sulla rete di nylon e lavare con 5 ml di KRH-WB.
- Delicatamente trasferire la sospensione cellulare filtrato in un tubo da 50 ml con il tubo di plastica in esso e una siringa 60cc attaccata all'estremità tubo.
- Sia la sospensione con adipociti maturi riposare per circa 10 min, permettendo alle cellule di raggiungere la parte superiore del buffer galleggiamento.
- Lentamente aspirare il tampone nella parte inferiore del tubo utilizzando 60cc Syrinaspirazione ge.
- Aggiungere 20 ml di KRH-WB per lavare. Ripetere la procedura dal punto 3.4 per 2 lavaggi aggiuntivi.
- Raccogliere il buffer di portare la sospensione adipociti ad un volume finale di 5 o 10 ml, a seconda della quantità di cellule. Perseguire con passaggi nella sezione 5.
- Recupero della frazione stromale-vascolare dal buffer raccolti con la siringa 60cc mediante centrifugazione (3000 rpm, RT, 5 min) per ulteriore coltura cellulare primaria se desiderato (tecnica non mostrato).
Cell Count 4. adipociti maturi
- Carico 10 ml di sospensione degli adipociti scosso delicatamente in una camera di conteggio (emocitometro). Eseguire conta delle cellule in quadruplicato.
- Calcolare il numero di cellule mature isolate.
5. Coppia degli adipociti dedifferenziazione in T-25 Flask
- Riempire a 25 cm 2 tessuto pallone di coltura a ¾ del volume con il siero di vitello DMEM / F12-20%.
- Secondo il conteggio delle cellule, versare 500.000 cellule mature nel pallone. Riempire il pallone completamente utilizzando un tubo da 50 ml con il mezzo ed eliminare come bolle che possibile.
- Avvitare il tappo non ventilate sul pallone.
- Pulire il pallone con etanolo prima dell'incubazione per evitare la contaminazione.
- Incubare la beuta capovolto per una settimana senza toccarlo per evitare movimenti nella cultura che potrebbero disturbare l'adesione cellulare.
- Prima invertendo il matraccio a 7 giorni di coltura invertito, manipolare delicatamente il matraccio e rimuovere tutta medie nel pallone per aspirazione, evitando movimenti bruschi.
- Aggiungere 12 ml di siero di vitello% DMEM-F12-20 e coltivare cellule con tecniche standard. Un filtrato, tappo ventilato può essere aggiunto al pallone.
6. maturo degli adipociti dedifferenziazione in un 6-pozzetti
- Inserire un coprioggetto sul fondo di ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti
- Aggiungi un ½ "boccola di plastica sulla parte superiore di ogni coprioggetto.
- Riempire pozzetti con 8 ml di 20% di siero di vitello-DMEM.
- Metti un coprioggetto su ogni boccola in plastica.
- Inserire puntale tra la slitta e il tubo di iniettare le cellule sotto il vetrino (50.000 cellule per pozzetto).
- Incubare le piastre in un incubatore standard di coltura cellulare a 37 ° C con 5% di CO 2 per una settimana.
- Coprioggetto Reverse con le cellule attaccate in ogni pozzetto contenente 2 ml di media integrato con siero di vitello del 20% e perseguire la cultura.
- Utilizzare coprioggetto con cellule in fase di de-differenziazione per diversi scopi, tra cui immunofluorescenza (tecnica non mostrato).
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Representative Results
Importanti cambiamenti morfologici avvengono a maturare adipociti durante dedifferentiation (Figura 1). Come mostrato in Figura 2, le cellule in fase dedifferentiation state colorate con un anticorpo anti-FABP4 per analisi di fluorescenza. Le cellule con una morfologia rotonda espresso la proteina FABP4 mentre la maggior parte delle cellule di fibroblasti, come non ha fatto. Dopo dedifferentiation, cellule DFAT possono essere coltivati con procedure standard per diversi passaggi. Siamo stati in grado di raggiungere più di 15 passaggi per omentale umana e sottocutanei linee cellulari DFAT (dati non riportati).
Figura 1. Morfologia di dedifferentiating adipociti maturi nel tempo (A) a 4 giorni (B) a 7 giorni e (C) a 12 giorni di coltura. Foto sono state scattate in diversi punti temporali durante l'incubazione con un Microscopio a contrasto di fasee. Fare clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Rilevamento di proteine FABP4 in adipociti sottoposti dedifferenziazione. Le cellule sono state fissate dopo 13 giorni di de-differenziazione e colorati con anti-FABP4 anticorpi per immunofluorescenza. I nuclei sono stati visualizzati con colorazione DAPI. A sinistra: immagine Brightfield del corrispondente immunofluorescenza. A destra: L'immagine unita viene mostrato (FABP4-rosso, Nuclei-blu-10X). Gli adipociti con morfologia rotonda FABP4 express, un marcatore adipociti maturi, mentre le cellule allungate esprimono più esso. Scala bar: 1 unità = 0,25 millimetri Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Dedifferenziazione di adipociti maturi con la tecnica di coltura soffitto è un nuovo approccio per ottenere cellule staminali adipose da un piccolo campione di tessuto adiposo nativo. Sulla base della nostra esperienza e quella di altri 2, un grammo di tessuto è sufficiente al piatto un pallone da 25 cm 2 e per ottenere una popolazione di cellule DFAT per i quali l'omogeneità è stata dimostrata da Poloni e collaboratori 3. Adipociti dedifferentiation sembra possibile con le cellule da qualsiasi donatore, indipendentemente dalla loro età, sesso e altre caratteristiche. Tra la popolazione risultante DFAT ottenuto, rimane qualche giro o in parte le cellule allungate che non dedifferentiate completamente. Queste cellule sono solitamente scartati attraverso il passaggio cultura galleggiano nel mix tripsina-media.
Multipotenza di queste cellule è stabilita e supporta il loro uso per la terapia cellulare 2,3. La loro elevata capacità proliferativa è stato segnalato anche, che isa aspetto importante di coltura cellulare per le applicazioni delle cellule staminali 2. Gli studi con cellule DFAT umani hanno indicato che possono essere più efficiente di ASC dallo stesso donatore, in base alla loro capacità di replicazione e differenziazione 18. Un recente studio caso sostiene che le cellule DFAT erano più efficienti di differenziarsi in adipociti e osteoblasti, e avevano livelli di telomerasi elevati rispetto ASC dallo stesso individuo, un donatore con l'obesità e il diabete 18. Pertanto, l'uso della cultura massimale può fornire cellule staminali adipose più efficienti rispetto alla ASC già utilizzato. Tuttavia, sono necessari ulteriori esperimenti per valutare chiaramente questo punto.
La 6-ben tecnica di coltura soffitto piastra consente lo studio del processo dedifferentiation stesso. Un numero minimo di cellule può essere placcato e consente lo studio di specifici punti temporali. Ad esempio, abbiamo raccolto il vetrino da un 6-pozzetti per eseguire immunofluorescenza da adipociti undergdedifferentiation oing (Figura 2). Esecuzione miscroscopy, con o senza di fluorescenza, è molto rilevante per valutare i vari aspetti della dedifferentiation.
Oltre alle applicazioni di celle staminali, cellule DFAT possono rappresentare un interessante modello per gli studi fisiologici. Solo pochi studi hanno esaminato l'espressione genica e le funzioni di entrambi i tipi di cellule. In breve, ASC e DFAT dallo stesso vano di grassi ha mostrato somiglianze nell'espressione genica e la secrezione 4. Sono necessari altri confronti tra ASC e DFAT dallo stesso donatore.
In conclusione, vi mostriamo in questa relazione tecnica come ottenere cellule DFAT dal tessuto adiposo umano utilizzando la tecnica consolidata di adiposo collagenasi tessuti digestione e la tecnica di coltura soffitto. Il nostro formato originale 6 pozzetti può contribuire ad aumentare la conoscenza del processo di de-differenziazione, mentre il metodo del pallone più comunemente utilizzato permette la generazione di grandi poporegola- di cellule DFAT. Il limite maggiore di questo protocollo è l'accesso al tessuto adiposo umano che si basa sulla collaborazione con un team di chirurgia e di etica di gestione per ottenere paziente consenso informato per iscritto. Cellule mature sono molto sensibile, sono necessarie precauzioni nella manipolazione. Abbiamo ottimizzato il protocollo, in particolare il numero di adipociti da placcati in T-25flask e il formato 6 pozzetti, per ottenere risultati ottimali e potrebbe essere anticipato senza grandi modifiche aggiuntive o risoluzione di problemi.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| Adenosine | Sigma | A4036 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A0278 | |
| NaCl | Any brand can be used | ||
| KCl | Any brand can be used | ||
| CaCl2 | Any brand can be used | ||
| MgCl2 | Any brand can be used | ||
| KH2PO4 | Any brand can be used | ||
| HEPES | Any brand can be used | ||
| Glucose | Any brand can be used | ||
| Type I collagenase | Worthington Biochemical Corp | LS-004196 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Gibco-Life Technologies | 11039-021 | Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50 µg/ml) and fungizone (2.5 µg/ml) |
| Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves | Sigma | C8056-500 ml | |
| 1/2 In plastic bushing | Iberville | 2704-CP | SKU:1000120918 (Home Depot) |
| Liquid nitrogen | Linde | ||
| Formalin soluton, neutral buffered, 10% | SIGMA | HT501128 | |
| Sterile tweezers | |||
| Sterile scissors | |||
| 60 cc syringes | BD Syringe | ||
| Plastic tubing | |||
| Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH) | Prepare stock buffer as following: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4. | ||
| Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB) | Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5 mM glucose, 0.1 µM adenosine, 560 µM ascorbic acid | ||
| KRH-WB supplemented with Type I collagenase | Add 350 U/ml of Type I collagenase | ||
| T25 unvented cap tissue culture flask | Sarsted or other brand | ||
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon or other brand | ||
| Microscope cover glass 22x22 | Fisherbrand | 12-542-B | |
| Sterile beakers |
References
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