Protocol
Etik uttalande: Projektet har godkänts av IUCPQ s forskningsetiska nämnden inför patientrekrytering. För den här artikeln / videon, vi fått vävnader från 2 patienter: 1) en 62-årig manlig patient med ett BMI på 50,7 kg / m 2 och 2) en 35-årig kvinnlig patient med ett BMI på 57 kg / m 2. Experiment kan göras med både fett fack, men har begränsats till ett fett fack för syftet med denna video. Tekniska aspekter på videon utfördes med patienten 1 och FABP4 immunofluorescens utfördes med avdifferentierade celler från patienten 2.
1. Provbearbetning
- Be kirurger att samla fettvävnad från omental och subkutana fett fack vid tidpunkten för laparoskopisk kirurgi för viktminskning.
- Snabbt ta fett proverna till laboratoriet vid RT och bearbeta omedelbart.
- Utför matsmältningen i laboratoriet, i en icke-steril atmosfär. Denceller kommer så småningom att överföras till odlingsrummet och odlades under sterila betingelser. För att undvika kontaminering, förbereda KRH buffert med destillerat och filtreras vattnet och följer med en filtrering (0.22μM filter) innan matsmältningen. Grundligt rena rör med etanol före överföring i cellodlings huven för kolv och platta förberedelser.
- Placera fettvävnad på en i förväg vägd skålen och rekordvikt. Fäst en liten bit av varje vävnadsprov (mindre än 1 cm 2) i 10% formalin buffert vid RT i minst 24 timmar innan paraffininbäddning. Använd denna inbäddade prov för immunohistokemi experiment (teknik visas ej).
- Placera en annan bit i ett 50-ml rör och blixt skyddsmedel i flytande kväve före förvaring vid -80 ° C för vidare studier på hela fettvävnad (t.ex. genuttryck - teknik visas inte).
2. kollagenasdigestion
- Placera resterande fettvävnad stycke i en 50 ml tuvara för matsmältningen.
- Lägg 4 ml KRH-WB kompletterad med kollagenas (350 U / ml) per gram prov i uppslutningsröret.
- Finhacka fettvävnad med sax.
- Placera malet fettvävnad suspension i en skakmaskin, 37 ° C, 90 rpm maximal, för en 45-minuters inkubation (högst en timme).
3. Rening av Adipocyter och Preadipocyter
- Häll genomskinliga lösningen med några bitar av fett genom en 400 iM nylonnät i en plastbägare.
- Med pincett, gnugga cell preparatet på nylonnät och tvätta med 5 ml KRH-WB.
- Försiktigt överföra den filtrerade cellsuspension i en 50 ml rör med plaströret i den och en 60cc spruta fäst vid slangen extremitet.
- Låt suspensionen med mogna adipocyter står för ungefär 10 minuter, vilket tillåter cellerna att nå toppen av bufferten genom flotation.
- Sakta aspirera buffert vid botten av röret med hjälp 60cc syringe sug.
- Tillsätt 20 ml KRH-WB att tvätta. Upprepa från steg 3.4 för ytterligare 2 tvättar.
- Samla bufferten att bringa adipocyt suspensionen till en slutlig volym av 5 eller 10 ml, beroende på cell kvantitet. Fortsätta med stegen i avsnitt 5.
- Åter den stromala-vaskulära fraktionen från bufferten uppsamlades med 60cc sprutan genom centrifugering (3000 rpm, RT, 5 min) för ytterligare primär cellodling om så önskas (teknik ej visad).
4. Äldre adipocyt celltal
- Load 10 pl skakas försiktigt adipocyt suspension i en räkningskammare (haemocytometer). Utför celltal i fyra exemplar.
- Beräkna antal isolerade mogna celler.
5. Äldre adipocyt dedifferentiering in T-25 Flask
- Fyll en 25 cm 2 vävnadskultur kolv till ¾ av volymen med DMEM / F12-20% kalvserum.
- Enligt celltal, häll 500.000 mogna celler i kolven. Fyll kolven helt med hjälp av en 50 ml tub med medium och ta bort så många bubblor som möjligt.
- Skruva oventilerade locket på flaskan.
- Rengör kolven med etanol före inkubation för att undvika kontaminering.
- Inkubera kolven upp och ner för en vecka utan att röra den för att undvika rörelse i den kultur som kan störa cellulär vidhäftning.
- Före backning kolven vid 7 dagars inverterad kultur, försiktigt manipulera kolven och ta bort alla medium i kolven genom aspiration, undvika plötsliga rörelser.
- Lägg 12 ml DMEM-F12-20% kalvserum och odla celler med standardtekniker. En filtrerad, ventilerat lock kan sättas till kolven.
6. Mogna adipocyt dedifferentiering i en 6-brunnars platta
- Placera på ett täckglas på botten av varje brunn i en 6-brunnars platta
- Lägg till en ½ "plastbussning på toppen av varje täckglas.
- Fyll brunnarna med 8 ml av 20% kalvserum-DMEM-medium.
- Sätt en täck på varje plastbussning.
- Sätt pipettspetsen mellan bild och röret för att injicera celler under sliden (50.000 celler per brunn).
- Inkubera plattorna i en standardcellodlingsinkubator vid 37 ° C med 5% CO2 under en vecka.
- Omvänd täckglas med bifogade celler i varje brunn innehållande 2 ml av medium kompletterat med 20% kalvserum och utöva kultur.
- Använd täck med celler som genomgår dedifferentiering för flera ändamål inklusive immunofluorescens (teknik visas ej).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Större morfologiska förändringar mogna adipocyter under dedifferentiering (Figur 1). Såsom visas i figur 2, var celler som genomgår dedifferentiering färgades med en anti-FABP4 antikropp för fluorescensanalys. Celler med en rund morfologi uttryckte FABP4 proteinet medan majoriteten av fibroblastliknande celler inte gjorde det. Efter dedifferentiering kan DFAT celler odlas med standardförfaranden för flera passager. Vi har kunnat nå mer än 15 passager för mänsklig omental och subkutan DFAT cellinjer (data visas ej).
Figur 1. Morfologi av dedifferentiating mogna adipocyter över tid (A) vid 4 dagar (B) vid 7 dagar och (C) på 12 dagar Pictures kultur. Togs vid olika tidpunkter under inkubationen med hjälp av en fas-kontrast microscope. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Detektion av FABP4 protein i adipocyter genomgår dedifferentiering. Celler fixerades efter 13 dagar av dedifferentiering och färgas med anti-FABP4 antikropp för immunofluorescens. Kärnor visualiserades med DAPI-färgning. Vänster: Bright bild av motsvarande immunofluorescens. Höger: Den sammanslagna bilden visas (FABP4 röda, Kärnor-blue-10X). Adipocyter med rund morfologi express FABP4, en mogen adipocyt markör, medan långsträckta celler inte längre uttrycka det. Skala bar: 1 enhet = 0,25 mm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dedifferentiering av mogna adipocyter med taket kulturen tekniken är en ny metod för att få fett stamceller från ett litet urval av infödda fettvävnad. Baserat på vår erfarenhet och andras 2, är ett gram vävnad tillräcklig för att plattan en 25-cm 2 kolv och för att erhålla en population av DFAT celler för vilka homogenitet har visats genom Poloni och kollaboratörer 3. Adipocyt dedifferentiering verkar möjligt med celler från en donator, oberoende av ålder, kön och andra egenskaper. Bland den resulte befolkning DFAT erhållits, kvarstår ett fåtal runda eller delvis avlånga celler som inte fullt ut dedifferentiate. Dessa celler är oftast kastas genom kulturen passagen som de flyter i mixen trypsin-media.
Multipotens av dessa celler är etablerad och stöder deras användning för cellterapi 2,3. Deras hög proliferativ kapacitet har också rapporterats, som jagsa värdefulla aspekt av cellodling för stamcellstillämpningar 2. Studier med humana DFAT celler indikerade att de kan vara mer effektiva än ASC från samma donator, baserat på deras replika och differentiering kapacitet 18. En färsk studie fallet stöder att DFAT celler var mer effektivt att differentiera till adipocyter och osteoblaster, och hade högre telomeras nivåer än ASC från samma individ, en donator med fetma och diabetes 18. Således kan användningen av taket kultur ger effektivare fett stamceller än den som redan används ASC. Men ytterligare experiment behövs för att klart bedöma den här punkten.
Vår 6-brunnar taket kulturteknik möjliggör studiet av dedifferentiering processen. Ett minimalt antal celler kan pläteras och möjliggör studier av specifika tidpunkter. Till exempel, har vi samlat mikroskopobjektglaset från en 6-brunnars platta för att utföra immunofluorescens från adipocyter undergoing dedifferentiering (Figur 2). Utföra miscroscopy, med eller utan fluorescens, är mycket relevant för att bedöma olika aspekter av dedifferentiering.
Förutom stamcells tillämpningar kan DFAT celler representerar en intressant modell för fysiologiska studier. Endast ett fåtal studier undersökt genuttryck och fungerar både celltyper. I korthet, ASC och DFAT från samma fett facket visade likheter i genuttryck och sekre 4. Fler jämförelser mellan ASC och DFAT från samma donator är nödvändiga.
Sammanfattningsvis, visar vi i denna tekniska rapport hur man erhåller DFAT celler från human adipos vävnad med användning av väl etablerad teknik av fettvävnad kollagenasdigestion och taket odlingstekniken. Vår ursprungliga 6-brunnar formatet kan bidra till att öka kunskapen om dedifferentiering processen medan mer vanligt förekommande flaskmetoden möjliggör generering av större popuningar av DFAT celler. Den största begränsningen av detta protokoll är tillgången till mänskliga fettvävnad som bygger på samarbete med en operation lag och etik ledningen att få patienten skriftligt och informerat samtycke. Mogna celler är mycket känsliga vilket kräver försiktighetsåtgärder vid hanteringen. Vi optimerat protokollet, särskilt antalet adipocyter som ska pläterade i T-25flask och 6-brunnar format, för att få optimala resultat och inga ytterligare större förändringar eller felsökning kan förväntas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| Adenosine | Sigma | A4036 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A0278 | |
| NaCl | Any brand can be used | ||
| KCl | Any brand can be used | ||
| CaCl2 | Any brand can be used | ||
| MgCl2 | Any brand can be used | ||
| KH2PO4 | Any brand can be used | ||
| HEPES | Any brand can be used | ||
| Glucose | Any brand can be used | ||
| Type I collagenase | Worthington Biochemical Corp | LS-004196 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Gibco-Life Technologies | 11039-021 | Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50 µg/ml) and fungizone (2.5 µg/ml) |
| Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves | Sigma | C8056-500 ml | |
| 1/2 In plastic bushing | Iberville | 2704-CP | SKU:1000120918 (Home Depot) |
| Liquid nitrogen | Linde | ||
| Formalin soluton, neutral buffered, 10% | SIGMA | HT501128 | |
| Sterile tweezers | |||
| Sterile scissors | |||
| 60 cc syringes | BD Syringe | ||
| Plastic tubing | |||
| Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH) | Prepare stock buffer as following: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4. | ||
| Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB) | Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5 mM glucose, 0.1 µM adenosine, 560 µM ascorbic acid | ||
| KRH-WB supplemented with Type I collagenase | Add 350 U/ml of Type I collagenase | ||
| T25 unvented cap tissue culture flask | Sarsted or other brand | ||
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon or other brand | ||
| Microscope cover glass 22x22 | Fisherbrand | 12-542-B | |
| Sterile beakers |
References
- Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- Perrini, S., et al. Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans. PLoS One. 8 (3), e57892 (2013).
- Kishimoto, N., et al. The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad. Clin Oral Investig. , (2013).
- Kou, L., et al. The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes. Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).
- Jumabay, M., et al. Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).
- Sugawara, A., Sato, S. Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration. Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).
- Kikuta, S., et al. Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis. Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).
- Obinata, D., et al. Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model. Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).
- Jumabay, M., et al. Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats. J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).
- Ohta, Y., et al. Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats. Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).
- Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. Adipose Tissue Biology. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity). Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).
- Tchernof, A., Despres, J. P. Pathophysiology of human visceral obesity: an update. Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).
- Watson, J. E., et al. Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor. Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).
