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Biology

Chitosane / ARN interférant nanoparticules Mediated Gene Silencing dans la maladie vectorielle larves de moustiques

Published: March 25, 2015 doi: 10.3791/52523
Automatic Translation
*1, *2,3, 3,4, 1, 3,4, 5, 2,3,4
1Division of Biology, Kansas State University, 2Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 3Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 5Department of Entomology, Kansas State University
* These authors contributed equally

Summary

Nous décrivons ici une procédure pour inhiber la fonction des gènes chez les moustiques vecteurs de la maladie grâce à l'utilisation de chitosane / interférer nanoparticules d'ARN qui sont ingérés par les larves.

Abstract

moustiques vecteurs infligent des souffrances plus humain que ne importe quel autre organisme - et tuent plus d'un million de personnes chaque année. Les projets sur le génome de moustiques ont facilité la recherche dans de nouvelles facettes de la biologie des moustiques, y compris les études génétiques fonctionnels dans le principal vecteur africaine du paludisme Anopheles gambiae et de la dengue et le vecteur de la fièvre jaune Aedes aegypti. ARN de (RNAi-) le silençage génique médiation a été utilisée pour cibler des gènes d'intérêt dans ces deux espèces de moustiques vecteurs de maladies. Ici, nous décrivons une procédure pour la préparation de chitosane / ARN interférant nanoparticules qui sont combinés avec de la nourriture et ingérés par les larves. Ceci, à haut débit techniquement simple et relativement peu coûteux méthodologie, qui est compatible avec de longs ARN double brin (ARNdb) ou de petits ARN interférents (siARN) de molécules, a été utilisé pour le knock-down réussi d'un certain nombre de différents gènes dans A. gambiae et A. aegyptilarves. Après tétées larvaires, démontable, qui est vérifiée par qRT-PCR ou hybridation in situ, peuvent persister au moins jusqu'à la fin du stade de pupe. Cette méthode peut se appliquer à une grande variété de moustique et d'autres espèces d'insectes, y compris les parasites agricoles, ainsi que d'autres organismes non-modèles. En plus de son utilité dans le laboratoire de recherche, à l'avenir, le chitosane, un polymère peu coûteux, non toxique et biodégradable, susceptibles d'être utilisés dans le domaine.

Introduction

moustiques vecteurs de l'alimentation sanguine des genres anophèles et Aedine transmettent agents responsables de plusieurs des pires fléaux de l'humanité pathogènes. On estime que 3,4 milliards de personnes sont à risque de contracter le paludisme, qui est responsable de plus d'un demi-million de décès chaque année dans le monde entier. les résultats de la lutte contre le paludisme de l'infection par Plasmodium sp., des parasites qui sont transmis à l'homme par les piqûres de moustiques infectés du genre Anopheles, y compris le principal vecteur africain Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Aedes aegypti est le moustique vecteur principal de virus de la dengue, qui provoque de la fièvre de la dengue, une maladie fébrile non spécifique qui est l'arbovirose la plus répandue et importante dans le monde. virus de la dengue est actuellement une menace pour> 2,5 milliards de personnes dans les tropiques, avec une façon fortuite annuelleCE d'environ 50 millions de cas résultant en ~ 24 000 décès par an ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. Malgré l'impact mondial dévastateur de maladies transmises par les moustiques sur la santé humaine, des moyens efficaces de prévention et de traitement de ces maladies font défaut. lutte contre les moustiques est actuellement la meilleure méthode de prévention de la maladie.

Le potentiel de lutte contre les maladies transmises par les arthropodes par la manipulation génétique des insectes vecteurs a été reconnue depuis plus de quatre décennies 3. Souches transgéniques de A. aegypti conçu pour avoir un phénotype spécifique de voler-femme répressible ont récemment fait la possibilité d'utiliser des stratégies de lutte antivectorielle transgéniques une réalité 4-6. Ces progrès ont contesté les chercheurs à identifier les cibles génétiques nouvelles pour la lutte antivectorielle et des moyens supplémentaires de manipuler la fonction des gènes chez les moustiques vecteurs. Altération de l'expression des gènes ddéveloppement ors, comme ce était le cas chez les moustiques femelles de 4-voler, peut promouvoir l'élucidation des stratégies de lutte antivectorielle nouveaux. Cependant, en grande partie en raison de problèmes techniques, les fonctions de très peu de gènes ont été caractérisées au cours du développement de A. gambiae, A. aegypti, ou d'autres espèces de moustiques.

Depuis sa découverte en C. elegans 7, l'ARN interférence (ARNi), qui est conservé chez les animaux, les plantes et les micro-organismes, a été largement utilisé pour des études génétiques fonctionnelles dans une grande variété d'organismes, y compris les insectes 8,9. La voie ARNi est initiée par Dicer, qui clive à long ARN double brin en courts 20-25 siRNA nucléotidiques de long qui fonctionnent comme des ARN interférents séquence-spécifique. gènes de silence siRNA qui sont complémentaires dans l'ordre par la promotion de chiffre d'affaires de la transcription, le clivage et la perturbation de la traduction 9. Longues molécules ARN double brin (typiquement 300-600 pb) ou personnalisés siRNA ciblant un particulièremenr séquence peut être utilisée dans le laboratoire de recherche pour faire taire ne importe quel gène d'intérêt. En gérant lorsque ARN interférent est livré, les chercheurs peuvent contrôler l'heure à laquelle silençage génique initiés. Cet avantage est utile car elle peut être utilisée pour surmonter des défis tels que la létalité de développement ou de stérilité, ce qui peut entraver la production et l'entretien des souches portant des mutations héréditaires, un processus coûteux et de main-d'œuvre qui ne est pas encore disponible dans toutes les espèces d'insectes. Bien que le degré de silençage génique par ARNi peut varier de gène à gène, un tissu à tissu, et un animal à l'ARNi est largement utilisé pour l'analyse fonctionnelle des gènes dans les moustiques et autres insectes 8,9.

Trois stratégies d'interférence de livraison d'ARN ont été utilisés dans les moustiques: micro-injection, l'application trempage / topique, et ingestion. Pour une histoire détaillée et une comparaison de l'utilisation de ces trois techniques chez les insectes, se il vous plaît se référer à Yu et al 8. We ont utilisé avec succès la micro-injection 10 comme un moyen de fournir des siRNA pour cibler les gènes du développement chez A. aegypti embryons, larves, pupes et 11-14. Cependant, cette stratégie de prestation de main-d'œuvre exige à la fois une installation de micro-injection et une main habile. En outre, la micro-injection est stressant pour l'organisme, un facteur de confusion, en particulier lorsque phénotypes comportementaux seront évalués. Enfin, la livraison de micro-injection ne peut pas être étendu au domaine de la lutte antivectorielle. Comme alternative, le trempage l'organisme en interférant solution d'ARN est également devenu un moyen populaire d'induire le silençage génique, car il est pratique et nécessite peu d'équipement ou la main-d'œuvre. Le trempage a surtout été appliquée dans la lignée cellulaire d'insectes étudie 8, mais dans une étude récente, knockdown a été atteint en A. larves de aegypti immergé dans une solution de 15 l'ARN double brin, où les animaux semblaient être ingéré. Cependant, les études portant sur l'analyse de plusieurs experimentagroupes de L ou phénotypes, le trempage est assez coûteux. Lopez-Martinez et al. 16 décrit réhydratation entraîné ARNi, une nouvelle approche pour la livraison de l'ARN interférant qui implique la déshydratation dans une solution saline et la réhydratation avec une seule goutte d'eau contenant de l'ARN interférant. Cette approche ne coupe les coûts associés à l'immersion de l'animal entier, mais est plus cher que la micro-injection et peut être limitée dans son application aux espèces qui peuvent tolérer fortes pressions osmotiques. En outre, il est difficile d'imaginer comment l'immersion ou la méthode d'immersion / de réhydratation de déshydratation pourraient être adaptées pour la lutte antivectorielle dans le domaine. Pour ces raisons, pour les études post-embryonnaires, la livraison des ARN interférant avec de la nourriture ingérée est une stratégie alternative viable.

Bien que des stratégies fondées sur l'ingestion-ne fonctionnent pas chez toutes les espèces d'insectes, peut-être surtout Drosophila melanogaster, l'administration orale d'ARN interférents mélangé avec de la nourriture a favorisé si géniquelencing dans une variété d'insectes 8,17, y compris A. aegypti adultes 18. Nous avons décrit des nanoparticules de chitosan à médiation par ARNi dans A. gambiae larves 19 et ont appliqué avec succès cette approche pour la réduction de l'expression génique dans A. aegypti larves 20,21. Ici, la méthodologie pour cette procédure ARNi, qui consiste à piéger des ARN interférents par le chitosane de polymère, est détaillée. Chitosan / ARN interférents nanoparticules sont formées par auto-assemblage de polycations avec des ARN interférent par les forces électrostatiques entre les charges positives des groupes amino dans le chitosane et les charges négatives portées par les groupes phosphate sur le squelette de 19 l'ARN interférent. La procédure décrite est compatible avec les molécules d'ARNdb longs (ci-après dénommée ARN double brin) ou double brin siRNA (ci-après dénommé siRNA). Après la synthèse, le chitosane / interférents nanoparticules d'ARN sont mélangés avec de la nourriture des larves et livrés àlarves à l'ingestion. Cette méthodologie est relativement peu coûteux, nécessite peu de matériel et la main-d'œuvre 19, et facilite l'analyse à haut débit de plusieurs phénotypes, incluant l'analyse des comportements 20,21. Cette méthode, qui peut être adaptée pour les études d'inactivation de gène dans d'autres insectes, y compris d'autres vecteurs de maladies et les insectes nuisibles agricoles, pourrait être utilisée pour le silençage génique dans une variété d'autres espèces animales. En outre, le chitosane, un polymère peu coûteux, non toxique et biodégradable 22, pourrait être utilisée dans le domaine de lutte contre les moustiques spécifique de l'espèce.

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Protocol

1. Mosquito espèces et l'élevage

  1. Maintenir A. gambiae G3 et A. souches aegypti Liverpool IB12 (utilisés dans les études représentatives ci-dessous) ou d'autres souches d'intérêt conformément à la pratique de laboratoire standard ou comme décrit précédemment 23,24.

2. ARNdb et siRNA Conception et production

  1. Concevoir des amorces pour construire des modèles de longs ARNdb spécifiques du gène d'intérêt. Utilisez l'outil E-ARNi 25. Produire ARNdb selon la méthode de choix ou 19 comme décrit précédemment.
    1. Pour un témoin négatif, 19 synthétiser l'ARN double brin correspondant à la séquence de la protéine fluorescente verte (GFP), la β-galactosidase (β-gal) ou un autre gène non exprimé chez les moustiques. Si on le souhaite, 19 l'ARNdb utilisé pour générer les résultats représentatifs sont résumées ci-dessous peut être utilisé comme témoin positif. Magasin ARNdb dissous dans l'eau sans RNAse à -80 °; C jusqu'à utilisation.
  2. Alternativement, la conception siRNA spécifique du gène selon la pratique de laboratoire standard ou comme décrit précédemment 10. Brouiller la séquence d'un effet de choc pour concevoir siRNA siRNA contrôle négatif qui ne correspond pas à ne importe quel gène de moustique. Achetez les siRNA personnalisés, qui sont disponibles à travers un certain nombre de vendeurs de bonne réputation.
    1. Si on le souhaite, des siRNA 20,21 utilisée pour obtenir des résultats représentatifs sont résumées ci-dessous peuvent être utilisés comme témoins positifs. Magasin siRNA dissous dans l'eau sans RNase à -80 ° C jusqu'à utilisation.

3. Préparation de chitosane / ARN interférent nanoparticules

  1. Recueillir le sulfate de sodium 100 mM RT pré-fabriqué (100 mM de Na 2 SO 4 dans H 2 O déminéralisée) et de l'acétate de sodium 0,1 M (0,1 M NaCl 2 H 3 O 2 -0,1 M d'acide acétique, pH 4,5 dans désionisée H 2 O) tampons.
  2. Dissoudre chitosane (≥75%désacétylée) dans du tampon acétate de sodium 0,1 M pour faire 0,02% (p / v) de solution de travail et maintenir la solution à la température ambiante avant utilisation.
  3. Dissoudre ARNdb ou siRNA dans 50 ul de H 2 O déminéralisée et l'ajouter au tampon de sulfate de sodium 100 mM pour obtenir une solution de 100 ul de 32 ug d'ARN double brin / siRNA pour 100 ul de sulfate de sodium à 50 mM.
  4. Ajouter 100 ul de solution de chitosane dans la solution ARNdb / siRNA, puis chauffer le mélange dans un bain d'eau à 55 ° C pendant 1 min. Mettre en place un contrôle par addition de 100 ul de sulfate de sodium à 50 mM à 100 pi de solution de chitosane et suivre la même procédure.
  5. Mélanger les solutions immédiatement pendant 30 secondes au vortex à grande vitesse à la température ambiante pour faciliter la formation de nanoparticules.
  6. Centrifuger le mélange à 13 000 xg pendant 10 min à température ambiante, temps au bout duquel une pastille doit être visible. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. Air-sécher le culot pour ≈10 min à température ambiante avant de l'utiliser pour préparer la nourriture de moustique.
  7. Mesure la concentration de l'ARN double brin / siRNA dans le surnageant en utilisant le surnageant de la commande (voir 3.5) comme un blanc pour calculer le montant total de l'ARN double brin / siRNA qui restait dans le surnageant. Utiliser la différence entre les montants de départ de l'ARN double brin / siRNA et les montants restants dans les surnageants pour calculer le pourcentage d'ARNdb / siRNA piégé dans les nanoparticules. Cette efficacité de chargement est normalement plus de 90%.
  8. Répétez la même procédure si plus de nanoparticules sont nécessaires. Utiliser immédiatement les nanoparticules séchées. L'impact de l'entreposage frigorifique des particules avant l'utilisation n'a pas été évaluée.

4. Préparation des aliments contenant du chitosane Mosquito / ARN interférent nanoparticules

  1. Préparer 1 ml d'une solution d'agarose à 2% (p / v) dans de l'eau déminéralisée, faire fondre l'agarose, et de garder solution d'agarose fondu dans un bain de 55 ° C de l'eau avant utilisation.
  2. Mélangez les flocons de nourriture pour les poissons (47% de protéines brutes, min. Matières grasses brutes 10%, max. Cellulose brute de 3%) et la levure sèche à unerapport de 2: 1 (p / p). Broyer le mélange à de petites particules avec un mortier et un pilon (passer à travers n ° 50 USA tamis standard). Utilisez la nourriture au sol, qui devrait être de couleur brunâtre, soit immédiatement, soit le stocker dans un récipient étanche à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
  3. Dans un tube de 1,5 ml, mélanger 6 mg de nourriture au sol avec les nanoparticules séchées de la section 3.7 avec un cure-dent.
  4. Ajouter 30 ul d'une solution à 2% de pré-gel d'agarose fondu au mélange alimentaire nanoparticules; remuer immédiatement et abondamment à l'aide d'une pointe de cure-dent ou pipette.
  5. Utiliser le gel contenant de la nourriture et des nanoparticules pour alimenter les larves de moustiques immédiatement. En variante, une fois que le gel est complètement solidifié à la température ambiante, le gel stocker à 4 ° C et en utilisant le lendemain, ou à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.

5. Nourrir larves de moustiques avec les aliments contenant du chitosane / ARN interférent nanoparticules

  1. Alimentation A. gambiae larves de moustiques:
    1. Suppression d'un SIngle granulés de gel du tube de 1,5 ml en utilisant un cure-dent et le couper en six tranches égales en utilisant une lame de rasoir propre ou un cure-dent.
    2. 20 Transfert de troisième stade larvaire dans une boîte de Petri de 500 ml contenant 100 ml d'eau désionisée.
    3. Nourrir les larves de moustiques en ajoutant une tranche de la pastille de gel (finement haché en petits morceaux) par boîte de Pétri une fois par jour pendant quatre jours. Veillez à respecter les larves se nourrissent de la pastille, qui devrait être considérablement réduite en taille ou complètement absent le lendemain. Après un temps, les moustiques se développeront en fin de quatrième stade larvaire.
    4. Enregistrez les modifications phénotypiques visibles pendant l'expérience. Examiner les niveaux de transcription et d'autres changements phénotypiques comme indiqué dans l'article 6 à la fin de la période de quatre jours.
  2. Alimentation A. aegypti larves de moustiques:
    1. Couper la pastille de gel en tranches égales 6 en utilisant une lame de rasoir propre ou cure-dent.
    2. Placez 50 ans synchronisé 24 heures après l'éclosion des œufs fipremier stade larvaire dans une boîte de Pétri en ≈40 ml d'eau déminéralisée.
    3. Les larves se nourrissent une tranche par boîte de Pétri pendant 4 heures / jour, puis de transférer les larves de retour à l'alimentation des larves régulière de 2: 1 sol flocons de nourriture pour les poissons et la levure sèche pour le reste de la journée. Répéter l'opération tous les jours pendant les quatre stades larvaires.
    4. Examiner les niveaux de transcription et d'autres changements phénotypiques comme indiqué dans l'article 6 sur les points souhaités de temps de développement.

6. Confirmation de Gene Knockdown

  1. Transcription relative quantification par qRT-PCR dans A. aegypti et A. larves gambiae.
    1. Effectuer et analyser des essais qRT-PCR avec trois répétitions biologiques sur au moins 10 commande groupée vs larves expérimentale comme décrit 11,19,20, ou selon la procédure de laboratoire standard. Les résultats représentatifs sont incluses ci-dessous.
    2. Pour l'analyse d'une partie notamment le type de tissu / corps (ie., Le cerveau ou antenne), perform qRT-PCR comme décrit dans 6.1.1 dissection suivante pour récupérer le tissu d'intérêt (par exemple, voir Mysore et al. 21).
  2. Confirmation de l'effet de choc par hybridation in situ
    1. Synthétiser antisens digoxygénine marqué et le sens ribosondes de contrôle conformément à la pratique de laboratoire standard ou comme décrit 26.
    2. Exécuter une hybridation in situ par le protocole Haugen et al. 27 pour la confirmation d'effet de choc, comme décrit précédemment dans 11,20 et discuté dans la section des résultats représentatifs ci-dessous.
  3. Confirmation de l'effet de choc par immunohistochimie
    1. Si des anticorps contre le produit protéique du gène ciblé sont disponibles, effectuer l'immunohistochimie comme décrit précédemment 28, ce qui facilite l'identification des personnes ayant les plus grands niveaux de knock-down pour l'analyse du phénotype 20 comme illustré dans la representative section des résultats ci-dessous.

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Representative Results

A. gambiae:

Des nanoparticules de chitosan / ARNdb sont formées grâce à l'interaction électrostatique entre les groupes amino du chitosane et les groupements phosphate de l'ARN double brin. L'efficacité de l'incorporation dans l'ARN double brin nanoparticules est généralement supérieure à 90% telle que mesurée par l'appauvrissement de l'ARN double brin à partir de la solution. Atomiques images de microscopie de force montrent que le chitosane-ARNdb moyennes de taille de particules de 140 nm de diamètre, allant de 100 à 200 nm (Figure 1).

Figure 1
Figure 1. formation de nanoparticules par le chitosane et ARN interférents. Image de microscopie à force atomique de nanoparticules de chitosane / ARN double brin (A) ou solution de chitosane sans addition d'ARN double brin (B). La taille des images est de 1,0 pm x 1,0 pm. Barre d'échelle = 250 nm.e.com/files/ftp_upload/52523/52523fig1large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Nourrir de ces particules qui sont combinés avec de la nourriture des larves standard et incorporées dans agarose soutient le développement larvaire normal. Surtout, knockdown spécifique de transcriptions AgCHS1 ectoderme dérivés ainsi que AgCHS2 spécifique intestin (Figure 2) est possible 19, ce qui démontre que l'ARN double brin repris par l'ingestion de nanoparticules initiés ARNi delà l'intestin moyen. Efficacité Knockdown ≈40-60% ont été observées (par exemple, fig. 2) et varient entre les transcriptions.

Figure 2
niveaux de transcription Figure 2. de chitine synthase 2 (AgCHS2) après l'ingestion ARNdb dans <em> A. larves de gambiae. des niveaux relatifs d'ARN messager AgCHS2 chez les larves nourries sur des nanoparticules avec ds AgCHS2 ou ds de contrôle GFP. Les données sont présentées comme moyenne ± SD de trois expériences indépendantes biologiques. Des lettres différentes sur les barres indiquent des différences significatives sur la base de tests t appariés (p = 0,003).

Knockdown de AgCHS1 réduit de manière significative la teneur totale en chitine de quatrième stade larvaire et augmente la sensibilité à l'insecticide inhibiteur de la synthèse de la chitine, le diflubenzuron 19, knockdown de AgCHS2 augmenté de manière significative l'effet de calcofluor blanc et le dithiothréitol qui a perturbé la matrice péritrophique (PM) en quatrième stade larvaire larves (figure 3) donnant lieu à une mortalité accrue 17.

Figure 3
AgCHS2 ingéré des nanoparticules sur A. gambiae matrice péritrophique (PM) perméabilité. traitements blanc ou TNT Calcofluor perturbe le PM de A. larves de gambiae qui est encore exuberated par AgCHS2 knockdown par ingestion du chitosane / ARNdb nanoparticules 19. (A) Mosquito avec PM intacte. (B) Mosquito avec PM perturbé, fuit dans le bleu dextran ceacae gastrique.

A. aegypti:

Chitosane / nanoparticules siARN ont été utilisés pour cibler le gène de guidage axonal sémaphorine-1a (sema1a) pendant A. développement larvaire aegypti 20. Knockdown de sema1a a été confirmée par hybridation in situ, qui a détecté des niveaux de sema1a réduite ≈60% des cerveaux larvaires culEssed et n'a pas réussi à détecter l'expression sema1a dans ≈40% de cerveaux d'animaux knockdown (figure 4C vs. B; flèche jaune indique le lobe antennaire). dosages qRT-PCR effectuées sur des animaux entiers mis en commun ont révélé que cette technique a donné lieu à 32 la réduction de ± 10% dans les transcriptions de sema1a par rapport au témoin-nanoparticules animaux nourris (Figure 4A; P <0,01 sur la base de test t apparié, N = 5, N est le nombre de répétitions biologiques). Knockdown dans le cerveau persisté pendant au moins 24 h de développement des pupes, comme en témoigne la perte de l'anti-Sema1a anticorps expression (Figure 4E1 vs D1), qui a été utilisé pour identifier les animaux avec effet de choc important au cours des analyses phénotype olfactif des larves et des pupes. Défauts de lobe antennaire larves et des pupes (quantifiés dans le tableau 1) ont été détectés dans sema1a knockdown larves et les nymphes (figure 4E2, E3 vs. (figure 4E2 vs D2, visualisées avec mAbnc82; superpositions de deux signaux sont représentés sur la figure 4D3, E3). Phénotypes comparables ont été générés avec deux sema1a séparée siRNA knockdown, qui a contribué à assurer que les défauts constatés ne étaient pas le résultat de l'extérieur du site de ciblage soit par siRNA. Les plus hauts niveaux de knockdown ont été générés lorsque les siRNA ont été combinés, une stratégie qui peut être utilisé pour accroître l'efficacité knockdown (voir Mysore et al. 20 pour plus de détails).

Figure 4
Figure 4. Le chitosan / siRNA induite knockdown de sema1a dans le système olfactif développement de A. aegypti. QRT-PCR (A) et l'hybridation in situ (B, C) ​​a confirmé les essais knockdown de sema1a larves nourries dans un mélange de siRNA ciblant sema1a 890 et 1198 chitosane / siRNA nanoparticules d'ARN interférents par rapport aux nanoparticules de contrôle. Perte d'expression Sema1a entraîné dans les glomérules qui sont déformé (E1-3 vs D1-3). Voir le texte pour plus de détails. Dorsale est dans tous les panneaux. La barre d'échelle = 25 um. Ce chiffre a été publié dans Mysore et al 20. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les larves Pupes
siRNA n <strong> de type sauvage Défauts AL n Sauvage Défauts AL
Contrôle 69 69 (100%) 0 (0%) 68 68 (100%) 0 (0%)
sema1a KD 77 42 (54,5%) 35 (44%) * 75 51 (68%) 24 (32%) *

Tableau 1. Quantification des défauts des antennes du lobe suivantes knockdown sema1a. Un résumé compilé des résultats obtenus pour le contrôle siRNA contre sema1a knockdown (KD) siRNA 890 + siRNA 1198 chitosane Les animaux de nanoparticules nourris sur un total de huit expériences répétées effectuées dans les larves ( gauche) et les nymphes (à droite) se affiche. Le totalnombre de personnes évaluées (n) et aux numéros / pourcentages d'animaux présentant une morphologie de type sauvage contre lobe antennaire (AL) défauts (neurones de récepteur olfactif défauts de ciblage, neuropiles défectueux et formation glomérules) sont indiqués. Knockdown a été vérifiée par immunohistochimie anti-Sema1a coloration des anticorps dans un sous-ensemble d'animaux (15 larves et pupes 10) qui affichent les défauts les plus graves (notée avec *). Tous les animaux knockdown évalués de cette manière ont été trouvés à avoir des niveaux réduits de Sema1a, tandis que les niveaux Sema1a chez les animaux témoins nourris ne ont pas été sensiblement modifiées. Ce tableau a été publié dans Mysore et al 20.

Dans une deuxième enquête, 21 chitosane / nanoparticules siARN ont été utilisés pour cibler le facteur de transcription simple d'esprit (Sim) au cours du développement du système olfactif. dosages qRT-PCR avec des cerveaux communs disséqués à partir d'animaux entiers indiqué que les cerveaux knockdown sim avaient en moyenne un reducti 47%dans les transcriptions sur SIM par rapport aux animaux témoins nourris de nanoparticules (P = 0,005 basée sur le test t apparié). Dosages comparables avec des antennes révélées en moyenne une réduction de 77% des niveaux sim par rapport à des animaux (P = 0,002 basée sur le test t apparié) contrôler nourris. Malgré une certaine variabilité des niveaux d'effet de choc entre les tissus et les animaux, les transcriptions SIM ont pas été détectés par hybridation in situ en ≈50% de la knockdown cerveaux d'animaux / antennes après le traitement avec l'un des deux ARNsi knockdown différents (Figure 5B2, B3, C2, C3 vs B1, C1, tableau 2). Dans levure tests comportementaux pendant laquelle les individus qui ont été attirés par la levure ont été attribués un score de 1, tandis que les animaux qui ne ont pas attiré ont reçu un score de 0, les scores moyens pour sim 430 ou la carte SIM 718 animaux étaient si knockdowngnificativement plus faible que celui des animaux témoins nourris dans deux expériences répétées (figure 5A, P <0,001 en fonction de test t apparié). Le comportement des odeurs suivi défectueux (figure 5A) en corrélation avec des niveaux réduits de sim dans les antennes (de figure 5B2, B3 contre B1) et le cerveau (Figure 5C2, C3 vs C1, points jaunes marquer le périmètre du lobe antennaire; voir le tableau 2, pour la quantification des résultats). Plusieurs défauts ont été identifiés dans les antennes et les lobes des antennes d'animaux knockdown SIM (cf. Mysore et al 21. Pour plus de détails). Par exemple, les larves et les nymphes knockdown sim manquaient expression de orco, le co-récepteur obligatoire pour tous les récepteurs olfactifs dans des neurones des récepteurs olfactifs (figure 6). Les niveaux de transcription de Orco réduit ont été détectés chez les individus nourris avec sim 430 ( La figure 6A3, B3) ou la carte SIM 718 (figure 6A4, B4) démontable (KD) de chitosan / nanoparticules siRNA (comparer à des animaux de type sauvage dans la Figure 6A1, B1 et contrôler chitosane / siRNA animaux de nanoparticules nourris de la figure 6A2, B2). La perte du phénotype d'expression orco observée dans larves L4 (Figure 6A1-A4) a persisté pendant au moins 24h après la formation de pupe (Figure 6B1-B4).

Figure 5
Figure 5. sim knockdown spectacle de larves comportement odeur attractif défectueux. L'hybridation in situ a révélé des niveaux réduits d'ARN sim dans les antennes (B2, B3) et le cerveau (C2, C3) de 430 et sim sim 718 animaux knockdown (comparer à contrôler nourris dans B1, C1), qui n'a pas répondu à la levure odorant attractif (A). Voir le texte pour plus de détails. Les extrémités proximales des antennes sont orientées vers le haut dans B1-B3. Dorsale est orientée vers le haut en C1-C3. La barre d'échelle = 25 um. Ce chiffre a été publié dans Mysore et al 21. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Perte d'expression de Orco dans le développement A. antenne aegypti suivante knockdown de sim. de réduction des niveaux de transcription orco ont été détectés dans les individus fed avec sim 430 (A3, B3) ou la carte SIM 718 (A4, B4) démontable (KD) de chitosane / siRNA nanoparticules (à comparer les animaux de type sauvage dans A1, B1 et le contrôle de chitosane / siRNA animaux nourris de nanoparticules dans A2, B2). Voir le texte pour plus de détails. La barre d'échelle = 25 um. Ce chiffre a été compilé à partir d'images publiées dans Mysore et al 21. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Attiré Non Attiré
siRNA n # Animaux Normal Modéré Nul # Animaux Normal Modéré Nul
Contrôle 195 196 (100%) 196 (100%) 0 0 0 0 0 0
sim 430 KD 176 63 (35%) 48 (76%) 15 (24%) 0 113 (64%) 20 (18%) 12 (11%) 81 (71%)
sim 718 KD 177 66 (37%) 44 (66%) 22 (34%) 0 111 (63%) 20 (18%) 9 (8%) 82 (74%)

Tableau 2. Niveaus de sim en corrélation avec la performance larvaire dans un test de comportement de la levure. Un résumé compilé des résultats obtenus dans quatre levure odorant attractif répliquer expériences est montré. Le nombre total d'animaux (n) indique le nombre de larves qui ont été testés individu dans ces tests comportementaux. Le nombre de larves individuelle (# Animaux) qui ont été attirés (à gauche, les animaux qui ont touché le culot de levure et avons obtenu un score de 1) ou non attiré (à droite, les animaux qui ne touchent pas le culot de levure et a reçu une note de 0) dans chaque condition (contrôle, sim 430 KD, ou la carte SIM 718 KD chitosane / siRNA nanoparticule nourris) sont présentés, ainsi que les pourcentages d'animaux au total sont inclus ci-dessous les chiffres bruts. Knockdown de sim a été évaluée par hybridation in situ dans les cerveaux et les antennes des animaux attiré (à gauche) ou non attiré (à droite) à la levure. Lenombre brut / pourcentage de personnes ayant normal (comparable au type sauvage niveaux de transcription sim), Null (aucune transcription SIM observable) ou modérée (réduite mais pas de type sauvage) niveaux SIM sont signalés. Perte de sim bien corrélée avec un manque d'attraction à la levure. Ce tableau a été publié dans Mysore et al 21.

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Discussion

Le / interférer méthodologie de nanoparticules d'ARN de chitosane décrit ici a été utilisé pour cibler efficacement les gènes au cours du développement larvaire dans A. gambiae (figures 2, 3) et A. aegypti (figures 4, 5, 6 et aux tableaux 1, 2). Des nanoparticules de chitosan peuvent être préparées avec soit longue ou siRNA ARN double brin, qui ont tous deux été utilisés avec succès dans les moustiques comme en témoignent les résultats représentatifs décrits ici. Synthèse de l'ARN double brin est moins cher que d'acheter siRNA, mais est plus de main-d'œuvre. Si chitosane / siRNA est utilisé, phénotypes peuvent être confirmées avec plusieurs siRNA, permettant une meilleure assurance que le phénotype à découvert ne est pas dû à l'extérieur du site de ciblage. En outre, la production commerciale de siRNA en masse peut mieux faciliter l'expansion de chitosane / ARN interférent échappement pour espèces spécifiques lutte contre les moustiques sur le terrain. Ce sera bien sûr besoin de surmonter obstacles tels que le coût et la livraison.

Bien que nous ayons connu un bon succès avec ce protocole, les méthodologies doivent être optimisés pour chaque gène. Pour cette raison, nous vous recommandons de tester plusieurs siRNA, ou peut-être une siRNA et une longue ARNdb, au début d'un nouveau projet. Une fois que les phénotypes sont identifiés et confirmés par au moins deux ARNsi distinctes correspondant à un gène d'intérêt, il peut être utile de combiner ces ARNsi pour augmenter la pénétrance phénotype (Figure 4). Le calendrier et aussi la durée de chitosane / ARN interférant temps d'alimentation peuvent être optimisés pour chaque étude. A. gambiae prospérer lorsqu'il est alimenté uniquement avec du chitosane / interférence d'ARN nourriture comme décrit ici. Cependant, dans les expériences que nous avons réalisées à ce jour, A. aegypti ont pas bien réussi sans alimentation complémentaire, un problème que nous avons surmonté en les transférant à un régime de nourriture normale après 4 h de chitosane / ARN interférent alimentation. Expérimenter avec le chitosane / interférantla livraison de l'ARN dans un substrat alimentaire différent, ce qui nous ne avons pas encore essayé, peut contourner ce problème. Nous avons constaté que 4 h tétées quotidiennes au cours de plusieurs jours se traduisent par un bon équilibre entre knockdown et une nutrition adéquate, mais une modification de la durée de l'allaitement pouvait être étudié plus que désiré. En outre, le stade larvaire dans lequel le chitosane / ARN interférent nanoparticule alimentaire est débutée / continu peut être adapté pour chaque expérience en fonction de la période de développement critique dans laquelle la fonction du gène est examinée, un avantage majeur de ce protocole.

Vérification de knockdown est bien sûr essentiel, mais peut également exiger dépannage. Pour cette raison, il peut être utile de vérifier simultanément si phénotypes d'intérêt sont générées que l'efficacité knockdown est en cours d'évaluation. Pour qRT-PCR expériences de validation, il est essentiel que les amorces et les conditions de PCR sont optimisés. En outre, il est important que les animaux sont développementalsynchronisé au début de l'expérience, que l'expression de certaines transcriptions peut être très dynamique au cours du développement et en raison de rythmes circadiens 29. En outre, alors que cette technique génère clairement knockdown au-delà de l'intestin, nous commençons à peine à évaluer les tissus pour lesquels cette technique est efficace, et cela peut varier selon les espèces. Il sera donc utile de mesurer effet de choc dans des tissus particuliers, qui peuvent être obtenues en disséquant les tissus d'intérêt des animaux entiers pour QRT-PCR dosages ou par hybridation in situ (figures 4-6) 20,21 et immunohistochimie (Figure 4) 20 dosages (voir Haugen et al., 27 et Clemons et al. 28, respectivement, pour la résolution de ces protocoles). Depuis knockdown varie d'un individu à, il est utile d'effectuer des essais à double étiquetage pour évaluer phénotypes en combinaison avec des niveaux knockdown (Figure 4) 20, ce qui facilite grandement la caractérisation phénotypique. Pour les études de comportement, les niveaux knockdown chez les animaux individuels peuvent être corrélés avec leurs performances comportementales (tableau 2) 20,21.

À la suite de chitosane médiation interférer livraison d'ARN à A. larves de aegypti, l'expression du gène réduit est détecté à 24 h de développement des pupes (figures 4, 6) 20,21. Bien que les niveaux d'expression des gènes ne ont pas encore été évalués de manière détaillée au-delà de ce point de développement, la réduction des niveaux d'expression des gènes ont été détectés à la fois 48 et 72 h A. aegypti pupes (KM, non publié). Il serait utile de poursuivre des analyses plus détaillées des niveaux knockdown à plusieurs étapes de A. le développement des pupes aegypti et également à évaluer A. pupes gambiae. Il serait également intéressant de déterminer si knockdown persiste chez l'adulte et à explorer nanoparticules médiation dansterfering stratégies de prestation d'ARN pour les moustiques adultes.

Spécifique au site gène de nucléase approches de ciblage ont été récemment introduites à A. aegypti et A. gambiae et sont permettant la génération de cibles, des mutations héréditaires chez les moustiques et d'autres organismes modèles non-génétiques 30,31. Bien que l'utilisation de ces approches permet perte plus uniforme de la fonction phénotype analyses, un avantage par rapport aux approches ARNi, le dépistage de mutations d'intérêt est encore assez de temps et de main-d'œuvre. En outre, bien que la perte ARNi d'études de la fonction nécessite un entretien de seulement souches de type sauvage, les souches de moustiques mutants doivent être élevés individuellement. Le maintien de mutations létales stériles ou adultes récessifs est actuellement difficile étant donné le manque actuel de équilibreurs marqués chez les moustiques. Ainsi, alors que spécifique au site gène de nucléase approches de ciblage gagnent rapidement en popularité, le chitosane / ARN ciblant peut être optimal interférerchoix pour les laboratoires ne sont pas équipés pour maintenir souches de moustiques et dans les cas pour lesquels la perte de la fonction des gènes au cours du développement est incompatible avec la survie de la souche.

D'après nos constatations, nous prévoyons que le chitosane / ARN interférents peut être largement utilisé pour abattre de nombreux gènes différents au cours du développement de A. gambiae, A. aegypti, ainsi que d'autres insectes, et potentiellement d'autres organismes modèles non-génétiques. Silençage génique réussie avec le chitosane / ARN interférents a été rapporté dans d'autres espèces d'arthropodes, y compris Penaeus monodon (crevette) 32. Une étude récente a démontré que les nanoparticules facilite l'assimilation du ARNdb et ainsi améliorer l'efficacité knockdown par rapport à l'alimentation directe des ARN double brin dans la pyrale asiatique 33, qui souligne la possibilité d'utiliser cette technologie pour cibler les parasites agricoles. L'utilisation possible de siARN-nanoparticules comme agents thérapeutiques chez l'homme attire beaucoup ointérêt de f dans la communauté médicale. Giljohann et al. 34 décrit la synthèse et la caractérisation des nanoparticules polyvalents conjugués ARN-or, qui ont une durée de six fois plus longue demi-vie en comparaison de libérer l'ARN double brin et facilement ENTRER cellules. Davis et al. 35 décrit le premier essai clinique humain impliquant l'administration systémique de siRNA en utilisant un système de transfert de nanoparticule à des patients atteints de tumeurs solides, et la possibilité d'utiliser chitosane / thérapeutiques siARN a été récemment examiné 36. Ainsi, le chitosane / gène de l'ARN interférant technologie de ciblage est une technique de laboratoire précieux ayant un potentiel pour des applications plus larges. Les recherches futures devront explorer les applications supplémentaires pour cette technique. De plus, la modification chimique du chitosane et d'autres polymères, un domaine actif de recherche, peut augmenter l'efficacité de l'interférence ARN de livraison ou de permettre l'administration ciblée à des tissus spécifiques 37.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.02 ml pipetteman Rainin PR20 for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman Rainin PR200 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-120 for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman Rainin PR1000 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-046 for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5 TEKnova S0299 to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade BDH VWR BDH3092-500MLP to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade MP Biomedicals LLC. 800668 to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge Eppendorf AG 5415D to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells Sigma-Aldrich C3646-25G to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast Universal Food Corp NA to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool German Cancer Research Center NA for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food Wardley Goldfish FLAKE FOOD to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath Thermo Scientific 51221048 to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice not applicable not applicable for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
Name Company Catalog Number Comments
Ice bucket Fisher Scientific 02-591-44 for storage of ice used during the procedure
liver powder MP Biomedicals LLC. 900396 to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven A variety of vendors not applicable to prepare 2% agarose solution
petridish (100 x 15 mm) Fischer Scientific 875713 interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter Mettler Toledo S220 for preparation of buffers
Razor blade Fischer Scientific 12-640 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA Thermo Scientific/Dharmacon custom for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) BDH/distributed by VWR VWR BDH0302-500G to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer VWR 61066-046 to measure the water bath temperature
Tooth picks VWR 470146-908 for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer A variety of vendors not applicable for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer Fischer Scientific 02-216-108 for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper Fischer Scientific NC9798735 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings

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References

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