Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

מכשור של כבשים עוברי לטווח הקרוב להקלטות ללא הרדמה כרוניות רבות-משתנים

Published: October 25, 2015 doi: 10.3791/52581
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 2, 2, 2,3,4
1Département de sciences cliniques, CHUV, Université de Montréal, St-Hyacinthe, QC, 2Département d'obstetriques et de gynécologie, CHU Ste-Justine Research Centre, Université de Montréal, 3Département de neurosciences, CHU Ste-Justine Centre de recherche, Université de Montréal, 4Centre de recherche en reproduction animale (CRRA), Université de Montréal, St-Hyacinthe, QC

Summary

מודל הכבשים העוברי instrumented כרונית שאינו מורדם משמש ללמוד התפתחות העובר אדם בבריאות ובחוליים, משום שהיא מאפשרת מיקום כירורגית ותחזוקה של צנתרים ואלקטרודות, דגימת דם חוזרת ונשנית, הזרקת חומר, הקלטה של פעילות ביו-אלקטרונית, ובהדמית vivo. אנו מתארים את ההליכים הנדרשים להקמת מודל זה.

Introduction

מגוון של מודלים של בעלי החיים קיימים למחקר של שני הריונות תקינים ונפגעו, כולל מכרסמים מעבדה, פרימטים לא אנושיים ומעלי גירה מקומיות. 1,2,3,4,5 הכבשים הרה instrumented כרונית כבר בשימוש נרחב במשך 50 שנים כ מודל של התפתחות העובר אנושית ותגובות לגירויי pathophysiologic כגון lipopolysaccharide (LPS). 6-10 הנגעים בעקבות חשיפת LPS לחקות בדיוק את מה שהוא ראה בפגים עם לויקומלציה סביב חדרי המוח, שנובעת מפרופיל התבגרות דומה של שני המינים. 11, 12

סיבוכי הריון אחרים גם נחקרו בפירוט רב כגון הגילוי שסטרואידים לפני לידה לקדם פיתוח ריאות 13-15 והבנת ההשפעה של הגבלת צמיחה תוך רחמית (IUGR) על העובר 16,17.

השימוש הנרחב במודל הכבשים העוברי בשל uniqamenability UE של הכבשים העובריים אינם מורדמים להשמה והתחזוקה של צנתרים ואלקטרודות כירורגית, המאפשר דגימת דם חוזר ונשנה, הקלטה של פעילות ביו-אלקטרונית, יישום של גירוי חשמלי ובהדמיה מוחית vivo. 18 טלמטריה היא גם אפשרית, אם כי בתדירות נמוכה יותר בשימוש עדיין בשל התחכום גבוה יותר להגדיר, כמו גם את העלות הראשונית ותחזוקה. 19

יתר על כן, מודל הכבשים העוברי הוא מאוד תכליתי כווריאציות רבות של מכשור אפשריות בהתאם למדדים של עניין. לדוגמא, ניתן להקליט על ימים עד שבועות אותות משתנים בזמן אמת, כגון תנועות עוברים נשימה, פעילות מוחית חשמלית, תגובות לב וכלי דם, אק"ג, זרימת דם אזורית למגוון איברים באמצעות זרימת בדיקות או microspheres, וכו 'תודה ל רבגוניות זו, מגוון רחב של מחקרים שנערך כולל הפיתוח של Cardiמערכת ovascular 20,21, ציר (HPA) hypothalamo-יותרת המוח-יותרת הכליה 22, התפתחות מוח פיתוח 23 והשינה הברית ב -24 מסוימים, השפעות של היפוקסיה / חנק 25, היפותרמיה טיפולית 26, דלקת 6-11, שילוב של שניהם 27, סטרואידים 28,29, תרופות נגד דיכאון 30, דיספלזיה סימפונות ריאה (BPD) 31,32, תכנות עוברי 33,34,35,36,37,38,39 או פיתוח של שיטות ניטור עוברי רומן במהלך לידה ולשם לפני אבל כמה אזורים של חקירה. 40,41,42,43

המטרה הכוללת של השיטה שהוצגה היא להראות יישום הבסיסי של מודל רב-תכליתי זה. היא מאפשרת הקמת מגוון רחב של פרוטוקולי ניסוי אקוטיים וכרוניים לומדים פיזיולוגיה של העובר והפתופיזיולוגיה על אינטגרטיבי, האיבר, הסלולרי ורמות מולקולריות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

טיפול בבעלי חיים ואחרי ההנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים ובאישור על ידי מועצת אוניברסיטת מונטריאול בטיפול בבעלי חיים (פרוטוקול המס '10-Rech-1560). מידע מפורט על חומרים ושיטות מסופק בטבלת 1.

1. הרדמה

  1. הכנס קטטר חד-לומן לוריד הצוואר.
  2. שקט ורגוע acepromazine הכבשה באמצעות (10 מ"ג / מ"ל ​​Atravet) 2 מ"ג לוריד כ 30 דקות לפני האינדוקציה של הרדמה כדי להפחית את הלחץ הקשורים בהליך אשר בתורו מפחית את הרמות הקורטיזול.
  3. לנהל diazepam (וליום 5 מ"ג / מ"ל) 20 מ"ג, קטמין (מ"ג Ketalar 100 / מ"ל) 4-5 מ"ג / קילוגרם וpropofol (propofol 10 מ"ג / מ"ל) 0.5-1 מ"ג / קילוגרם לוריד כדי לגרום להרדמה כללית.
  4. הכנס קטטר תמורה בדרכי נשימה לתוך קנה הנשימה באמצעות לרינגוסקופ עם להב סוג ויסקונסין (350 מ"מ אקסטרה-ארוך שמאלי Blade) כדי לסייע עם אינטובציה. חלק את הטובוס סיליקון (קוטר 9 עד 12 מ"מ פנימי) את צנתר התמורה בדרכי נשימה ולתוך קנה הנשימה. טכניקה זו מאפשרת תהליך אינטובציה. לנפח את השרוול של הטובוס בזהירות כדי למנוע כיבים הנגרמים על-לחץ של קנה הנשימה ולקבע את הצינור לראש הכבשה.
  5. חבר את הטובוס למעגל הנשימה של המכונה ההרדמה ולהתחיל אוורור מכאני מייד. התאם את הגדרות הנשמה לשמור P CO 2 בגבולות נורמלים של 35 עד 45 מ"מ כספית.
  6. הכנס קטטר לתוך עורק אוזן (22-20 G; 1 ב[ 0.9 x 25 מ"מ] ל1.16 ב[ 1.1 x 30 מ"מ]) ולהתחבר לצינורות שאינם תואמים לניטור לחץ דם עורקים ישיר.
  7. השתמש בצג פיסיולוגי רב פרמטר להקליט רל, לחץ דם עורקים ישיר, ריווי חמצן (SpO 2), capnography (CO P ET 2), וטמפרטורה כל 5 דקות. העבר את כל phנתונים ysiologic באמצעות כבל טורים למחשב איסוף נתונים פיסיולוגי מרכזי. לשמור על טמפרטורת גוף נורמלית באמצעות שמיכת מים במחזור.
  8. נהל פתרון פולי-יוניים מאוזן בשעת 10 מ"ל / קילוגרם לשעה הראשונה של הרדמה כללית ולאחר מכן להפחית עד 5 מ"ל / קילוגרם / שעה.
  9. לנהל trimethoprim-sulfadoxine 5 מ"ג IV / קילוגרם לכבשה רק לפני החתך בעור כטיפול מונע באנטיביוטיקה.
  10. להשתמש בטכניקות אספטיים סטנדרטיים עם כל המניפולציות כירורגית של הכבשה והעובר.
  11. אחות מחסום כבשים בכל העת. זה כולל גם אנשים שאינם ניתוחיים. זה יהיה למזער את פוטנציאל enzootic לדוגמה, burnetii Coxiella. השתמש בכפפות ומסכות (N-95 סוג) בכל העת.

2. סקירה כללית של ההליך הכירורגי

  1. לעשות חתך קו האמצע 20 סנטימטרים דרך קיר הבטן התחתון מייד גולגולת לעטין דרך alba Linea כדי למזער נזק לשרירי בטן.
    1. Retract omentum יותר cranially וקרני הרחם מישוש ידני. למשש כל קרן מהגוף של הרחם ועד לקצה של הקרן להבחין במספר העובר וגודלם. אם יש יותר מעובר אחד, לבחור את העובר הגדול יותר על ידי הערכה ידנית את גודל הראש והרוחב בין המסלולים.
    2. החזק את הראש של העובר בחר בחוזקה דרך הרחם exteriorized באופן חלקי. בצע hysterotomy 10 סנטימטר על העקמומיות הגדולה עם מספריים מצנבאום. שים מייד על ראש כפפה כירורגית סטרילית ללא לטקס מלא בתמיסת מלח סטרילית כאילו היו יד. לחלופין, להשתמש ברכבי שטח 4X4 הלחים כדי לשמור על ראש העובר לח. אבטח את הרחם לדופן הבטן.
      1. Exteriorize הגפיים חזה ימין ושמאל ולמשוך את העובר בעדינות מתוך הרחם עד לתהליך xyphoid.
    3. הכנס צנתרים פוליוויניל לוריד זרוע ימין ושמאל ועורקים בטכניקת חיתוך למטה סטנדרטית. הכנס anothקטטר פוליוויניל אה לתוך החלל מי השפיר ידי להתקבע הסוף 'לעצם החזה של העובר.
      1. השתמש בצנתרי סטרילי בלבד. אנו ממליצים עיקור גז במתקן הסטנדרטי שלך. לצרף כל צנתר למחט והמחט לברזלים כפולים כדי לאפשר דגימת דם מאוחר יותר או ניטור לחץ.
    4. לתפור אלקטרודות נירוסטה לmanubrium, תהליך xiphoid ולכל נקודה של כתף כדי לפקח על רל (אק"ג).
    5. להחזיר את העובר ברחם. כל יציאת הצנתרים ואלקטרודות דרך חתך דקירה קטן באגף השמאלי.
    6. לסגור את חתך laparotomy באמצעות סגירת שלוש שכבה. לתפור את דופן הבטן עם תפר נספג סינטטי monofilament USP 2 באופנה רציפה פשוטה. סגור את החלל תת עורית עם תפר נספג סינטטי קלוע USP 0 באופן רציף פשוט. השתמש בסיכות נירוסטה כירורגית כדי לסגור את החתך בעור.
  2. הסר צמר על ידי גילוח תהליך xyphoid לבלוטת החלב ולאורך הקיפול של האגף בכל צד עם להב # 40. נקי בטן הגחון אז ביסודיות עם 4% gluconate chlorhexidine ומברשת רכה במשך 3 דקות.
    1. בצע לשפשף סטרילי סטנדרטי עם 4% gluconate chlorhexidine החל ממרכז הבטן ומתקדם בצורה צנטריפוגלי 3 דקות. יוצקים תמיסת מלח סטרילית על הבטן כדי להסיר את סבון החיטוי. לשלב האחרון של ההכנה כירורגית, לבצע שלושה קטעים חלופיים של פתרון chlorhexidine gluconate 2% ואלכוהול איזופרופיל 70%.
  3. להבטיח את עומק ההרדמה הוא נאות לפני החתך. לעשות חתך laparotomy סטנדרטי מהטבור רק גולגולת לעטין דרך alba Linea כדי למזער נזק לשרירי בטן.
  4. הכנס מלקחיים ספוג ארוכים בבטן לאורך הקיר עד הבטן השמאליתלאתר היציאה המתוכנן לצנתרים באזור paracostal.
    1. לדחוף את קצות המלקחיים בקיר עד עוזר יכול לאתר אותו ולאשר את האתר המתאים. פתח מעט (1 סנטימטר) מלתעותיו של המלקחיים ולתת העוזר לעשות 2 סנטימטר חתך דקירה בעובי מלא.
    2. Exteriorize קצות המלקחיים דרך החתך, לפתוח שוב, בעדינות לתפוס את הצנתרים עם המלקחיים שסופו של הדבר יצאו מהבטן דרך החתך בבטן הגחון. ראוי לציין, כמה קבוצות להשתיל צנתרים ולאחר מכן exteriorize. זה יש החסרון כי ניטור אק"ג העוברי intrasurgical אינו אפשרי.
  5. למשש את הרחם כדי לקבוע עמדה ומספרים עובריות. לקבוע את העובר הגדול באמצעות המרחק בין שמיעתי. לחתוך את דופן הרחם על העקמומיות הגדולה על dorsum של הראש, הימנעות הפסיגים.
    1. הכנס צינורית בוטה הסתיים דרך קרומי השליה להשיג בבוקרנוזל niotic מדגם חינם מדימום. לחתוך את קרומי השליה באמצעות מספריים.
  6. Exteriorize מחצית הגולגולת של העובר דרך חתך זה. הנח כפפה סטרילית לטקס שאינו ניתוחית מלאות בתמיסת מלח סטרילית על 37 מעלות צלזיוס על ראש העובר כדי לעזור לשמור על טמפרטורה נורמלית.
    1. במהלך הסרת הגוף העליון של העובר מהרחם, יש לי העוזר להחזיק את של בבקוק כדי למנוע האובדן של מי שפיר. ואז, שוב באמצעות מלקחיים בבקוק, מהדק את הקרומים עובריים ודופן רחם לעור על מנת למנוע זיהום בבטן עם מי שפיר.
    2. לחשוף רק את חלקי הגוף של העובר שצריך instrumented ולשמור על החלקים שנותרו בתוך הרחם או מכוסה בבגדים סטריליים לחים וחמים (37 מעלות צלזיוס), בהתאמה.
  7. לחטוף שני גפיים החזה כדי להקל על החשיפה לעורק הזרוע והווריד בילטרלי. לחתוך לאורך ההיבט המדיאלי של שני antebrachium וטיפוללנתח באופן מלא סביב עורק הזרוע והווריד.
  8. הכנס צנתרים פוליוויניל לימין ועורקי זרוע שמאלי וזרוע שמאל וריד באמצעות טכניקה לחתוך למטה סטנדרטית.
    1. לשחרר את הכלי לצינתור מרקמות סמוכות מעל 1 סנטימטר. לקשור את החלק הדיסטלי של כלי השיט עם תפר נספג סינטטי קלוע USP 2-0. Preplace מייתר בהיבט הפרוקסימלי של הכלי אבל לשמור את זה לא קשור.
      1. בעזרת המספריים Castroviejo, לחתוך את הספינה transversally לכ -30% מקוטרו. עצור את זרימת הדם באופן חלקי על ידי משיכת התפר הפרוקסימלי. הכנס את הצנתר בכיוון הפרוקסימלי.
    2. הכנס את הקטטר עד פוליוויניל עד 8 סנטימטר proximally או עד ההתנגדות מזוהה ולאחר מכן משוך מעט לאחור. באופן זמני לאבטח את ההיבט הפרוקסימלי של הצנתר באמצעות מהדק כלי דם. מניחים תפר אחר סביב שני הפרוקסימלי וההיבט הדיסטלי של הקטטר. עוזר הוא ברציפות ASPirating ושטיפת הצנתר כדי להבטיח patency של הקטטר.
    3. סגור את העור של העובר באמצעות תפר נספג סינטטי קלוע USP 2-0, עם דפוס תפר מתמשך.
  9. מימין ובכתף שמאל, manubrium ותהליך xyphoid, לקבע אלקטרודה נירוסטה מבודדת כדי להקל על הניטור של א.ק.ג. העוברי.
  10. לתפור את הלחץ מי השפיר וקטטר דגימה לעצם החזה. צנתר זה fenestrated בגפיים שלה.
  11. לאבטח את כל הצנתרים על dorsum של העובר באמצעות חומר USP 2-0 קלוע סינטטי נספג תפר.
  12. לפני ההחלפה של העובר בחזרה אל תוך הרחם, לנהל Clenbuterol 30 IV מיקרוגרם לאט מעל 15 דקות, כדי למנוע ירידה בלחץ דם ולספק הרפיה רחם.
  13. לתפור את הקרומים העובריים באמצעות חומר USP 4-0 קלוע סינטטי נספג תפר עם דפוס מתמשך. לשלב רק קטטר אחד או אלקטרודה בכל פעם לתוך קלויור כדי להבטיח סגר הדוק. השתמש בתבנית קושינג השכבה כפולה כיבוד עקרונות הלסטד כדי לסגור את שכבת שרירי הרחם באמצעות חומר USP 0 קלוע סינטטי נספג תפר. לקבור את הקשרים כירורגית בזהירות.
  14. באמצעות דפוס תפר תיק מיתרים, לאבטח את כל צנתרים וכבלי אק"ג כפי שהם יציאת החתך paracostal עזב.
  15. שימוש בחומר תפר נספג סינטטי monofilament USP 2 לאבטח את אלבה Linea עם דפוס מתמשך. סגור את הרקמות תת עורית באמצעות USP 2-0 קלוע חומר תפר נספג סינטטי עם דפוס מתמשך. אבטח את שכבת העור עם סיכות כירורגי.
  16. נהל 250 מ"ג של אמפיצילין לוריד ושוב באמצעות הצנתר מי השפיר לתוך החלל מי השפיר. להחליף נוזלים מי שפיר אבודים עם מי מלח חמים.
  17. מניחים את כל הצנתרים exteriorized ואלקטרודות א.ק.ג. לתוך שקית מקום כדי לשמור על סטריליות. הנח stockinette סביב פלג הגוף העליון של הכבשה כדי לאבטח את כל הצנתריםאלקטרודות ד לגוף של הכבשה.
  18. תפסיק הרדמה כללית, וextubate הכבשה אחת רפלקסים גרון חזרו לקדמותו.
  19. להחזיר את הכבשה לכלוב מטבולים ברגע שהיא יציבה הבאה הרדמה כללית. הכבשה תהיה להתגורר בכלוב מטבולים לתקופת הניסוי. הכבשה צריכה להיות מסוגל לעמוד, לשכב ולאכול כרצונך מודעה תוך מעקב העובר-מורדם ללא ללא מרגיע אמא.
  20. בשלושה הימים הבאים, לנהל אנטיביוטיקה מונעת לכבשה (sulfadoxine Trimethoprim 5 מ"ג / קילוגרם) והעובר (250 מ"ג של אמפיצילין לוריד ושוב באמצעות הצנתר מי השפיר).
  21. להעריך את המצב המטבולי של שתי כבשה והעובר באמצעות דם גז ניתוחים.
  22. רוקן את כל הצנתרים עם הנפח המינימלי של מלח heparinized אפשרי. זהירות - לא תעלה על המנה היומית של הפרין ונוזלים מותר לעובר. אפשר נוזל להעמיס העובר. סומק פעם לאטיום ~ 5 מ"ל NaCl בכל שורה אחרי טיפול מונע באנטיביוטיקה.
  • הקלטה וניתוח של נתונים
    1. במהלך ניתוח, לחלופין להקליט שיעורים אימהיים ועובריים א.ק.ג. ולב, כמו גם את לחץ דם בעורקים של האם ולחץ אוויר (Paw) ברציפות (איור 1). השתמש בחי חלון הצג לרכוש את כל הנתונים מלבד אימהיים א.ק.ג.. הזנת נתונים אלה לממיר אנלוגי-דיגיטלי יחד עם אותות א.ק.ג. עובריים ואימהיים; לעבור א.ק.ג. האימהי והעוברי ראשון ל1,901 קדם מגבר. שיא ולהציג את כל הנתונים בתוכנה של היצרן.
    2. קח לדוגמא עורקי מ"ל 1 בו זמנית מהכבשה והעובר לניתוח גז דם עורקים, חומצת החלב, גלוקוז ולבסס את הקביעה עודפת (בפלזמה) בתתחיל מהניתוח העוברי (מייד לאחר החדרת צנתר העורקים הראשון) ולאחר סגירת הרחם .
    3. במהלך התאוששות לאחר ניתוח, לקחת דגימת דם עוברי 3 מ"ל למדוד את IL-6 וinflamm TNF-αפרופילי atory. צנטריפוגה הפלזמה ב 4 ° C (4 דק ', 4000 XG), למזוג ולאחסן את הפלזמה ב -80 ° C לבדיקת ELISA שלאחר מכן.
      הערה: המטרה של תוצאות הנציג דיווחו, שישה ימים לאחר ניתוח בעלי החיים הוקרבו באמצעות הזרקה תוך ורידית של 20 נתרן pentobarbital מ"ל. צמיחה עוברית הוערכה על ידי גוף, מוח, כבד ומשקולות אימהיות. משך תקופת הניסוי יהיה ברור משתנה בהתאם לעיצוב שנבחר לשאלת מחקר המסוימת ויכול להגיע ~ 6 שבועות.
  • ניתוחי ציטוקינים (שלב אופציונאלי)
    1. לקבוע ריכוזי ציטוקין (IL-6, TNF-α) בפלזמה באמצעות כריך כבש ספציפי ELISA. נוגדנים חד שבטיים נגד כבשים עכבר טרום מעיל (נוגדן ללכוד IL-6) או נוגדנים חד שבטיים נגד שור עכבר (TNF-α) בריכוז 4 מיקרוגרם / מיליליטר בצלחת ELISA על 4 מעלות צלזיוס לO / N, אחרי 3 פעמים לשטוף עם חיץ כביסה (0.05% Tween 20 בPBS, PBST).
    2. חסום את הצלחות עבור h 1 עם BSA 1% בPBST. לשטוף את הצלחות עם חיץ כביסה 3 פעמים.
    3. משתמש בחלבוני כבשים רקומביננטי (IL-6, TNF-α) כסטנדרט ELISA, להכין דילולים סידוריים נעים בין 1 סטנדרטי של 2,000 / מיליליטר ng לpg / ml 7 של 31.25 סטנדרטי.
    4. עומס 50 μl של סטנדרטים סידוריים מדוללים חלבון ודוגמאות לכל גם דגירה במשך שעה 2 ב RT, לשטוף את הצלחות 3 פעמים. הפעל את כל הסטנדרטים ודגימות בשני עותקים.
    5. החל 50 μl של נוגדני polyclonal אנטי-כבשים ארנב (IL-6 נוגדן זיהוי) או נוגדני polyclonal אנטי-שור ארנב (TNF-α) בדילול של 1: 250 בבארות דגירה במשך 30 דקות ב RT. לשטוף את הצלחות עם חיץ כביסה 5 פעמים.
    6. הוסף 50 μl של נגד הארנב העז IgG-HRP מצומדות (דילול 1: 5,000) למשך 30 דקות.
    7. דגירה עם 50 μl של פתרון מצע TMB בכל טוב.
    8. קץ פיתוח צבע בזמן רצוי עם 25 μl של 2 N חומצה גופרתית.
    9. קרא plאטס על קורא צלחת ELISA ב 450 ננומטר, עם תיקון גל 570 ננומטר.
      הערה: במבחנים שלנו, הרגישות של IL-6 ELISA הייתה 16 pg / ml, הרגישות של ELISA היה 13.9 pg / ml, בהתאמה α-TNF. לכל מבחני, מקדמי התוך assay ובין-assay של שונות היו <5% ו- <10%, בהתאמה.
  • ניתוחים סטטיסטיים
    הערה: השיטות הסטטיסטיות המדויקות יהיו תלויות בשאלת המחקר. כאן אנו מדווחים שיטות המשמשות לבדיקה לכל הבדלים משמעותיים בגזים בדם דווחו בטבלה 2.
    1. בדוק התפלגות נורמלית נתונים באמצעות בדיקת קולמוגורוב-סמירנוב אחרי בדיקות פרמטרית או אי-התאמה פרמטרית עם להשוואות מרובות, כמתאים.
    2. השימוש K-משמעות ניתוח אשכולות לזהות עוברים בכל הדור שהיו באופן ספונטני חוסר חמצן ולקבוע PO 2 ו- O 2 ערכי שבת בהתאמה (לשקול PO 2 <20 מ"מ כספית או O 2 שבת <55% כפטההיפוקסיה יב). 44-48
    3. השתמש בתוכנה סטטיסטית כגון SPSS לניתוח.
    4. נתוני הווה כממוצע ± SD עם הבדלים סטטיסטיים בp <0.05 נחשב משמעותי.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    38 כבשים מיושנים זמן הריון היו instrumented ב128 ± 2 ימים להריון (דג"א, ~ 0.88 הריון, טווח 145 דג"א) עם עורקים, ורידים וצנתרים מי שפיר ורל (אק"ג) אלקטרודות עם טכניקה סטרילית בהרדמה כללית (שתי כבשה והעובר ). במקרה של הריון תאומי העובר הגדול יותר נבחר מבוסס על מישוש והערכת קוטר intertemporal; לחלופין, העובר להיות instrumented ניתן לבחור באופן אקראי, כדי למנוע כל הטיה פוטנציאלית או שניהם העוברים ניתן instrumented. משך הזמן הכולל של ההליך היה 124 ± 27 דקות. החלק מהגוף העליון העוברי להיות instrumented נשאר מחוץ לרחם ל± 92 19 דקות. רוב הכבשים instrumented היו חיות F2. הסכר שלהם היה F1 (גבול לסטר * רומנוב) והאדונים היו איל המפשייר; הם חצו כדלקמן: המפשייר (50%) - גבול לסטר (25%) - רומנוב (25%) = HABLRV.

    אימהי נציג ופיזיולוגי של העוברמאפיינים במהלך ניתוח והמכשור מוצגים באיור 1 והיו בנורמה הפיזיולוגית לגיל ההריון של העובר והתנהגות אימהית במהלך הרדמה.

    משקולות אימהיות בממוצע 75 ± 11 קילוגרם ו -21 מתוך 38 תאומים בוצעו (כלומר, בשיעור של 1.6 ± 0.5). בזמן הנתיחה לאחר המוות (134 ± 3 דג"א), בקרב רווקי עוברי instrumented שקל 4090 ± 800 גרם ואילו משקלם של התאומים היה נמוך ב3,300 ± 740 גרם (p = 0.003). המשקל של תאומים uninstrumented ב3,300 ז ± 670 היה דומה למשקל של התאומים instrumented (p = 0.78). 18 של עוברי instrumented היו נשים ו -20 מהם היו גברים.

    הדינמיקה של גזים בדם עורקי העובר, מצב גלוקוז וחומצה-בסיס בזמן ניתוח והתאוששות שלאחר ניתוח מדווחת בטבלה 1. אנו נצפו התאוששות הדרגתית של מעמד חומצה-בסיס עוברי והידרדרות מתונה של חמצון עם שינוי קטן בזlucose ואלקטרוליטים מימים שלאחר ניתוח 1 עד 3. יש לציין, ביום שלאחר ניתוח 3, 42% מהעוברים נמצאו באופן ספונטני עם חוסר חמצן העורקים PO 2 11 מ"מ כספית של O 2 ושבת של 28%. PO העוברי של אשכול normoxic 2 היה מרוכז ב 22 מ"מ כספית וO 2 שבת על 56%. עוברי תאומים היו לא יותר מאשר חוסר חמצן עוברי סינגלטון (p = 0.26).

    עורקים עוברי IL-6 ELISA שניתנו ערכים מתחת לסף הרגישות של 16 pg / ml לאורך כל תקופת ההחלמה שלאחר הניתוח. כמו כן, רמות TNF-α גם נותרת ללא שינוי ונמוך מאוד בגיל 29 pg / ml עם ~ 30% מבעלי החיים גם מראים ערכים מתחת לסף הרגישות של 13.9 pg / ml לאורך כל תקופת ההחלמה שלאחר הניתוח.

    איור 1
    איור 1. ניטור אימהי ועוברי Intrasurgical. FHR, אני קצב לב עובריn פעימות לדקה (BPM); fECG, רל העוברי (V); כף, לחץ אוויר חיובי אימהי (מ"מ כספית); mABP, לחץ דם עורקים אימהי (מ"מ כספית); MHR, קצב לב אימהי (BPM); mECG, א.ק.ג. האימהי (V). ציר X הוא ציר הזמן בhh: mm:. Ss אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 2
    2. משקל איור ספונטני עוברי היפוקסיה וגוף. אין קשר בין משקל גוף של העובר ועורקי PO 2 ביום שלאחר ניתוח 3 זוהה (ספירמן R = .326, p = .161). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .

    <td> Bioamp: 1902; ADC: micro1401; תוכנת רכישת נתונים: ספייק 2, V7.13 <td> 100 מ"ג / מיליליטר
    מקור ACE אור שוט-Fostec
    לנתח מספריים כלי מדע פיין 14,060-11
    מספריים לנתח זווית כלי מדע פיין 15,006-09
    ידית אזמל כלי מדע פיין 10,003-12 כלי לנתח חלופי
    להבי אזמל מעוקלים # 12 כלי מדע פיין 10,012-00 כלי לנתח חלופי
    מספריים עצם כלי מדע פיין 16,044-10
    מלקחיים תפר קשירת S & T כלי מדע פיין 00,272-13
    מלקחיים דומון SS - זווית כלי מדע פיין 11,203-25
    גודל תפר משי קלוע 6-0 Teleflex רפואי 07 -30-10
    קלטת רפואית transpore 3M
    קטמין הידרוכלוריד 100 מ"ג / מיליליטר Hospira NDC 0409 - 2051 - 05 האם סופי הוא 80 מ"ג / קילוגרם
    הזרקת Tranqui Ved (xylazine 100 מ"ג / מיליליטר) Vecdo NDC 50989 - 234 - 11 האם סופי הוא 10 מ"ג / קילוגרם
    תפוז תגובתי 14 סיגמא - אולדריץ R - 8254
    אצבעות פתרון רכיבים פתרון הוא גז equilibrated עם 95% O2 ו -5 Co2%, pH הסופי 7.4
    נתרן כלורי סיגמא - אולדריץ S7653 ריכוז סופי: 118 מ"מ
    אשלגן כלורי פישר סיינטיפיק P217 - 3 ריכוז סופי: 4.7 מ"מ
    ד סידן כלורידihydrate פישר סיינטיפיק C79 - 500 ריכוז סופי: 2.5 מ"מ
    monobasic פוספט אשלגן פישר סיינטיפיק -285 P ריכוז סופי: 1.2 מ"מ
    מגנזיום סולפט JT בייקר ינואר-00 ריכוז סופי: 0.57 מ"מ
    4 piperazine-1-ethanesulfonic חומצה (2-Hydroxyethyl) (HEPES) פישר סיינטיפיק BP 310-500 ריכוז סופי: 5.95 גר '/ ליטר
    גלוקוז סיגמא - אולדריץ G8270 ריכוז סופי: 5.5 מ"מ
    LifeWindow Digicare ביו-רפואי טכנולוגיה
    יחידות bioamplifier וADC CED מוגבל עיצוב אלקטרוני קיימברידג ',
    יחידת 4, פרק מדע,
    מילטון כביש,
    קיימברידג 'CB4 0FE
    אנגליה.
    bioamplifier אות האנלוגית Neurolog Digitimer בע"מ
    37 Hydeway
    וולווין גארדן סיטי
    הרטפורדשייר, AL7 3BE, אנגליה     		NL108A
    ABL800Flex מדי קרינה קנדה; 200 אברדין ד"ר, לונדון, בN5V 4N2
    אפנדורף 5804R אפנדורף קנדה; 2,810 Argentia כביש, # 2
    מיסיסאוגה, אונטריו, L5N 8L2
    חץ הצוואר צנתור סט החץ International, Inc, 2,400 Bernville כביש, קריאה, הרשות הפלסטינית 19605 ארה"ב
    Atravet 10 מ"ג / מיליליטר
    Diazepam 5mg / מיליליטר
    קטמין Ketalar
    Propofol 10 מ"ג / מיליליטר
    SurgiVeT צינורות endotracheal; Smiths ASD הרפואי, Inc סנט פול, 55,112 MN, ארה"ב
    קוק Airway Exchange צנתר עם מתאמי אונסים-FIT קוק הטיפול הנמרץ 750, Bloomington IN 47,402-0,489 ארה"ב
    Dispomed מאוורר Dispomed בע"מ, 745 Nazaire-לורין, ז'ולייט, קוויבק J6E 0L6
    BD Insyte-W בקטון דיקינסון, עירוי תרפיה מערכות בע"מ, 9450 המדינה St S, סנדי יוטה 84,070 ארה"ב 22-20 G; 1 ב[ 0.9 x 25 מ"מ] ל1.16 ב[ 1.1 x 30 מ"מ]
    אדוארדס lifesciences אסמכתא: ערכת ניטור לחץ PX272 עם לחץ חד פעמי TruWave
    LifeWindow LW6000 Digicare Biomedical 107 הטכנולוגיה מסחר הכביש, בוינטון ביץ ', פלורידה 33,426-9,365 ארה"ב
    Gaymar
    בבקוק
    צנתרים פוליוויניל SCI (מדעי סחורות Inc) 2 מ '
    2-0 Vicryl
    מספריים Castroviejo
    רל (א.ק.ג.) LIFYY, Metrofunk Kabel-המועצות, ברלין, גרמניה ארבע אלקטרודות נחושת בנדן אחת, 2 מ '
    2-O Vicryl
    3-0 Vicryl
    USP PDS השני
    sulfadoxine trimethoprim
    אמפיצילין
    שַׁסתוֹם ארגון רפואי, חתול 041220001A ברזלים 4-דרך זוגית עם מנעול luer גברי
    מחטים Tyco Healthcare 8881202389 מחטי רכזת אלומיניום Monoject בוטות, 22Gx, 0.7mmx 38.1mm: לעורקי העובר וצנתרים ורידיים
    מחטים Tyco Healthcare 8881202322 מחטים קהות רכזת אלומיניום Monoject, 16Gx, 1.6mmx38.1mm: לצנתרים מי שפיר

    טבלת 1. ריאגנטים / ציוד ספציפי.

    טבלה 2
    אנא לחץ עליומחדש כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    טבלת 2. סקירה מלאה של דם גזים, מטבוליטים עובריים ואלקטרוליטים במהלך ניתוח והתאוששות שלאחר ניתוח. PH דם עורקים העוברי, PCO 2, ריווי חמצן (2% שבת O) (מ"מ כספית), PO 2 (מ"מ כספית), גלוקוז (מ"ג ההתחלה של הניתוח עוברי מייד לאחר התקנת קטטר הראשון העוברי העורקים (הרחם פתוח), הסוף של הניתוח עוברי (רחם: /, חומצת החלב (mmol / L) ועודף בסיס (mmol / L) בנקודות שונות בזמן של תקופות המכשור והתאוששות ד"ל) ימים סגורים), שלאחר ניתוח 1 עד 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    ההרדמה וניתוחים מוצגים הנדרשים להקמת מודל חיה ללימוד פיזיולוגיה של העובר והפתופיזיולוגיה: הכבשים העובריים אינם מורדמים instrumented כרונית.

    ארבעה שלבים קריטיים בפרוטוקול יש להדגיש. ראשון, שעבר את הצנתרים ואלקטרודות דרך האגף האימהי: חשוב שזה נעשה בפעם אחת כדי למנוע פציעות איברים פנימיות. שנית, אבטחת אתר ההפעלה uterotomy לפני exteriorizing העובר: זה הוא חיוני כדי למנוע או למזער את האובדן של מי שפיר והתפירה הבאה של הקרום השפיר לפני סגירת רחם. צנתור שלישי, עורקים: עורקי כבשים עובריים הם 1-2 מ"מ בקוטר, ולכן קשה לא לצנתר למנתח מנוסה; צוות של שני מנתחים מבצע טוב והמהיר ביותר במשימה זו שעוזרת לחסוך זמן כדי למזער את אורכו הכולל של ההליך. שניות רביעית, זהירותuring וארגון של כל הצנתרים ואלקטרודות בחלל מי השפיר לפני החזרת העובר לamnion וסגירת הרחם: זה עוזר למנוע מקרי משיכת הצנתרים או קריעה של אלקטרודות א.ק.ג. בשל תנועות אימהיות או עובריות לאחר ניתוח.

    במקום הגישה כאן מוצגת לצנתר כלי זרוע, הצוואר או יכולים לשמש גם כלי הירך. הבחירה תלויה בגישת המכשור הכוללת שבתורו יהיה מוכתבת על ידי עיצוב המחקר. אנו ממליצים לצמצם את זמן העובר מבלה מחוץ לרחם ולמזער את המידה שבה העובר צריך להישאר מחוץ לרחם להיות instrumented. שיקולים אלה הובילו לבחירה של כלי instrumented ב" גישה המינימלית "שהוצגה. אנו ממליצים catheterizing עורקים בשני הצדדים כדי לאפשר לניטור תוך-עורקי לחץ דם ודגימת דם עורקים ללא התערבות הדדית בכל tהוא להתנסות. יתרון נוסף הוא היתירות-כשל גישה זו מציגה: במקרה עורק אחד אין לקבל חסם במהלך תקופת הניסוי, דגימה וניטור לחץ אפשרית מאותו הכלי עם החסרון של הפרעה לניטור כאשר דגימת דם נעשה.

    יש שלוש מגבלות, שמונעות הסתגלות רחבה יותר של מודל זה חי. ניתן לטפל מגבלות אלה על ידי כמה שינויים הציעו להלן. ראשית, הוא הדרישה לרמת בטיחות ביולוגית 2 לידות בתחומי שיפוט מסוימים. זאת בשל סיכון לזיהום burnetii Coxiella מכבשים בהריון בבני אדם עם מערכת חיסונית מוחלשת. 49,50 חיסון זמין עבור בעלי החיים ובני האדם שנחשפו לירידת סיכון זה יכול להיעשות 51,52 וPCR בדיקות כדי לוודא ששום בעלי חיים חיוביים מועברים למתקן המחקר מהחווה. פתרון יכול להיות לשלב חיסון חיה עם בדיקת PCR מרובהים במשק מהמשטח מהנרתיק בוצע לפני הרבייה מתחיל, לפני מסירה ולאחר מכן שוב ממי השפיר במהלך הניתוח. עם אמצעי זהירות כאלה, בתחומי שיפוט מסוימים השימוש בכבשים במחקר אינו מוגבל כפי שהוא באחרים. שנית, העלות לבעלי חיים היא בטווח של ארבע ספרות הנמוכה, דומה לכמה זני נוקאאוט עכברי. עם זה בחשבון עם זאת, רווח המידע מכל ניסוי כבשים עוברי משווה רק לפרימטים לא אנושיים כפי שהוא נוגע לכמות הנרחבת של נתונים שניתן לאסוף, השאלות שיכולים להישאל ואת הפוטנציאל של תרגום לאדם בשל לעיתוי הפיתוח של איברים בכבשים. שלישית, יש את הנושא של גידול וזמינות לבעלי חיים בתקופות מסוימות בשנה בלבד. אפילו עם טיפול הורמונלי, תוצאות של רבייה כבשים כגון שיעור הריונות וחיוניות של כבשים (עוברים) הם משביעי רצון כמה חודשים רק סביב עונות רבייה טבעיות. 53 מכאן, ניסויתזמון אל דורש תכנון זהיר עם השנים התפצלו לעונות סתיו והאביב. פתרון יכול להיות להקים ספטמבר-נובמבר ולעונות כבשים 'ניסיוניות אפריל-ליוני. בעיה זו היא גם כוח, שכן היא מאפשרת לזמן כדי לנתח את הנתונים רבים שנאספו במהלך כל עונה ניסיונית.

    יש מספר גורמים התורמים למשמעות ביחס לשיטות קיימות. נתונים morphometric, הלב וכלי הדם וגז הדם הוצגו היו בטווח למינים 54,55 ודומים לאלה של מין אנושי 56, יתרון גדול של מודל זה חי. חריג היחיד הוא השיעור גבוה יותר של הריונות מרובים בהשוואה לתאומות אדם. 57 אולם זה הוא גם כוחו של המודל, כמו לומד את ההשפעות של תאומות על התפתחות העובר הוא משימה חשובה ביו-רפואית. 55,58,59 רמות נמוכות מאוד של פוסט דלקת -operative כפי שנמדד על ידי IL-6 וELISAs TNF-αבשילוב עם התאוששות של מצב חומצה-בסיס מצביע על כך שהמכשור כירורגי עוברי נסבל היטב ותקופת ההחלמה שלאחר הניתוח של 72 שעות היא מספיק כדי להבטיח מצב בסיס יציב של הכבשים העובריים לפני תחילת ניסוי. אחוז הגבוה של היפוקסיה כרונית מתונה ספונטנית בכבשים עובריים לטווח קרוב הופך אותם מודל מעניין ללימוד ההשפעות כרוניות של היפוקסיה האנושית טרום-לידתי ודלקת בהתפתחות העובר וסביב לידה, כמו למשל, IUGR, ועלבונות סביב הלידה, כגון דלקת ו חנק חריף. 60,61,62 מודלים הכבשים IUGR כמה משמשים, כמה להסתמך על היפוקסיה ספונטנית, כמה גרימתו על ידי אמבוליזציה שליה, למשל. 16,63-66 מצד השני, היפוקסיה קשה לפני תחילת ניסוי רשאית גם להיות קריטריון הדרה במקרים שבם לדוגמא, מערכת עצבים לב וכלי דם או המרכזית שלמדה, כמו כאן התגובות של חוסר חמצן כרוני עובריםמחדש ידוע שונים מאלה שnormoxic. 60 יישום נוסף חשוב הוא המחקר של השפעת לחץ אימהית לפני לידה על התפתחות העובר ולאחר לידה. 5,67 לבסוף, כפי שניתן לראות בפרסומים המצוטטים הרבים במודל זה, יכול המכשור העוברי להתבצע לאורך טווח רחב של גילאי הריון בכל מקום מ~ 70-135 דג"א מתאים לאמצע הריון-- מחקרים לטווח קרוב של התפתחות העובר. עם גיל ההריון המתקדם, מכשור של אי הגדלת מורכבות הם אפשריים, אבל שיקולים של משך צורך מכשור כירורגי ללהישקל מול הצורך לקבל מספר ההקלטות משתנים מאותו העובר.

    מספר היישומים עתידיים מבטיחים מאוד של הטכניקה הציגה נגזר מהמספר הגדל והולך של חומרים כימיים ביולוגיה מולקולרית כבשים ספציפיים ורצף הגנום הכבשים האחרון. ההתפתחויות האחרונות אלה קידמו נוספים זה Animaמודל l להיות גישה מבטיחה מאוד וחזקה להבנת התפתחות העובר אדם בריאה ופתולוגיים בקני מידה שונות של ארגון, מהגנום (EPI) לפיזיולוגיה אינטגרטיבית. 68 69-74

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    ACE Light source Schott-Fostec A20500
    Dissecting scissors Fine Science Tools 14060 - 11
    Angled dissecting scissors Fine Science Tools 15006 - 09
    Scalpel handle Fine Science Tools 10003 - 12 alternating dissecting tool
    Curved scalpel blades #12 Fine Science Tools 10012 - 00 alternating dissecting tool
    Bone scissors Fine Science Tools 16044 - 10
    S & T suture tying forceps Fine Science Tools 00272 - 13
    Dumont SS forceps - angled Fine Science Tools 11203 - 25 
    Braided silk suture size 6-0 Teleflex Medical 07 - 30  - 10
    Medical Tape transpore 3M
    Ketamine hydrochloride 100 mg/ml Hospira NDC 0409 - 2051 - 05 Final Does is 80 mg/kg
    Tranqui Ved Injection (xylazine 100 mg/ml) Vecdo NDC 50989 - 234 - 11 Final Does is 10 mg/kg
    Reactive orange 14 Sigma - Aldrich R - 8254
    Ringers Solution Components Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% Co2, final pH 7.4
    Sodium chloride Sigma - Aldrich S7653 Final Concentration: 118 mM
    Potassium chloride Fisher Scientific P217 - 3 Final Concentration: 4.7 mM
    Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific C79 - 500 Final Concentration: 2.5 mM
    Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific P -285 Final Concentration: 1.2 mM
    Magnesium sulfate J.T. Baker Jan-00 Final Concentration: 0.57 mM
    4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Fisher Scientific BP 310 - 500 Final Concentration: 5.95 g/L
    Glucose Sigma - Aldrich G8270 Final Concentration: 5.5 mM
    LifeWindow Digicare Biomedical Technology
    CED bioamplifier and ADC units Cambridge Electronic Design Limited,
    Unit 4, Science Park,
    Milton Road,
    Cambridge CB4 0FE
    ENGLAND.    		 Bioamp: 1902; ADC: micro1401; Data acquisition software: Spike 2, V7.13
    Neurolog analog signal bioamplifier Digitimer Ltd
    37 Hydeway
    Welwyn Garden City
    Hertfordshire, AL7 3BE, England    		 NL108A
    ABL800Flex Radiometer Canada; 200 Aberdeen Dr, London, ON N5V 4N2
    Eppendorf 5804R Eppendorf Canada; 2810 Argentia Road, #2
    Mississauga, Ontario, L5N 8L2
    Arrow Jugular Catheterization Set Arrow International, Inc., 2400 Bernville Road, Reading, PA 19605 USA
    Atravet 10 mg/ml
    Diazepam 5 mg/ml
    Ketamine Ketalar 100 mg/ml
    Propofol 10 mg/ml
    SurgiVeT Endotracheal Tubes; Smiths Medical ASD, Inc. St. Paul, MN 55112, USA
    Cook Airway Exchange Catheter with RAPI-FIT Adapters Cook Critical Care 750, Bloomington IN 47402-0489 USA
    Dispomed Ventilator Dispomed Ltd., 745 Nazaire-Laurin, Joliette, Quebec J6E 0L6
    BD Insyte-W Becton Dickinson, Infusion Therapy Systems Inc., 9450 S State St, Sandy Utah 84070 USA 22 to 20 G; 1 in [0.9 x 25 mm] to 1.16 in [1.1 x 30 mm]
    Edwards Lifesciences Ref: PX272 Pressure monitoring kit with TruWave Disposable Pressure
    LifeWindow LW6000 Digicare Biomedical Technology 107 Commerce Road, Boynton Beach, FL 33426-9365 USA
    Gaymar
    Babcock
    Polyvinyl catheters SCI (Scientific Commodities Inc.) 2 meters
    2-0 Vicryl
    Castroviejo scissors
    electrocardiogram (ECG) LIFYY, Metrofunk Kabel-Union, Berlin, Germany four copper electrodes in single sheath, 2 meters
    2-O Vicryl
    3-0 Vicryl
    PDS II USP
    Trimethoprim sulfadoxine
    Ampicillin
    Stopcock Argon Medical, Cat 041220001A Double 4-way Stopcock with male luer lock
    Needles Tyco Healthcare 8881202389 Monoject aluminum hub blunt needles, 22Gx, 0.7mmx 38.1mm: for fetal arterial and venous catheters
    Needles Tyco Healthcare 8881202322 Monoject aluminum hub blunt needles, 16Gx, 1.6mmx38.1mm: for amniotic catheters

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Barry, J. S., Anthony, R. V. The pregnant sheep as a model for human pregnancy. Theriogenology. 69, 55-67 (2008).
    2. Morrison, J. L. Sheep models of intrauterine growth restriction: fetal adaptations and consequences. Clin Exp Pharmacol Physiol. 35, 730-743 (2008).
    3. Rees, S., Inder, T. Fetal and neonatal origins of altered brain development. Early Hum Dev. 81, 753-761 (2005).
    4. Rees, S., Harding, R., Walker, D. The biological basis of injury and neuroprotection in the fetal and neonatal brain. Int J Dev Neurosci. 29, 551-563 (2011).
    5. Moisiadis, V. G., Matthews, S. G. Glucocorticoids and fetal programming part 1: Outcomes. Nat rev Endocrinol. 10, 391-402 (2014).
    6. Wang, X., Rousset, C. I., Hagberg, H., Mallard, C. Lipopolysaccharide-induced inflammation and perinatal brain injury. Semin Fetal Neonatal Med. 11, 343-353 (2006).
    7. Gotsch, F., et al. The fetal inflammatory response syndrome. Clin Exp Obstet Gynecol. 50, 652-683 (2007).
    8. Svedin, P., Kjellmer, I., Welin, A. K., Blad, S., Mallard, C. Maturational effects of lipopolysaccharide on white-matter injury in fetal sheep. J child neurol. 20, 960-964 (2005).
    9. Nitsos, I., et al. Chronic exposure to intra-amniotic lipopolysaccharide affects the ovine fetal brain. J Soc Gynecol Investig. 13, 239-247 (2006).
    10. Yan, E., Castillo-Melendez, M., Nicholls, T., Hirst, J., Walker, D. Cerebrovascular responses in the fetal sheep brain to low-dose endotoxin. Pedia res. 55, 855-863 (2004).
    11. Dean, J. M., et al. Delayed cortical impairment following lipopolysaccharide exposure in preterm fetal sheep. Ann Neurol. 70, 846-856 (2011).
    12. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Hum Dev. 3 (1), 79-83 (1979).
    13. Liggins, G. C. Premature parturition after infusion of corticotrophin or cortisol into foetal lambs. J Endocrinol. 42, 323-329 (1968).
    14. Liggins, G. C. Premature delivery of foetal lambs infused with glucocorticoids. J Endocrinol. 45, 515-523 (1969).
    15. Liggins, G. C., Fairclough, R. J., Grieves, S. A., Kendall, J. Z., Knox, B. S. The mechanism of initiation of parturition in the ewe. Recent Prog Horm Res. 29, 111-159 (1973).
    16. Morrison, J. L. Sheep models of intrauterine growth restriction: fetal adaptations and consequences. Clin Exp Pharmacol Physiol. 35, 730-743 (2008).
    17. Robinson, J. S., Hart, I. C., Kingston, E. J., Jones, C. T., Thorburn, G. D. Studies on the growth of the fetal sheep. The effects of reduction of placental size on hormone concentration in fetal plasma. J Dev Physiol. 2, 239-248 (1980).
    18. Carmel, E., et al. Fetal brain MRI - experiences in the ovine model of cerebral inflammatory response. Repro sci. 19 (3), 347A-348A (2012).
    19. Samson, N., Dumont, S., Specq, M. L., Praud, J. P. Radio telemetry devices to monitor breathing in non-sedated animals. Respir Physiol Neurobiol. 179, 111-118 (2011).
    20. Thakor, A. S., Giussani, D. A. Effects of acute acidemia on the fetal cardiovascular defense to acute hypoxemia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 296, R90-R99 (2009).
    21. Green, L. R., Kawagoe, Y., Homan, J., White, S. E., Richardson, B. S. Adaptation of cardiovascular responses to repetitive umbilical cord occlusion in the late gestation ovine fetus. J Physiol. 535, 879-888 (2001).
    22. Unno, N., et al. Changes in adrenocorticotropin and cortisol responsiveness after repeated partial umbilical cord occlusions in the late gestation ovine fetus. Endocrinology. 138, 259-263 (1997).
    23. Muller, T., et al. Developmental changes in cerebral autoregulatory capacity in the fetal sheep parietal cortex. J Physiol. 539, 957-967 (2002).
    24. Keen, A. E., Frasch, M. G., Sheehan, M. A., Matushewski, B., Richardson, B. S. Maturational changes and effects of chronic hypoxemia on electrocortical activity in the ovine fetus. Brain Res. 1402, 38-45 (2011).
    25. Ross, M. G., et al. Correlation of arterial fetal base deficit and lactate changes with severity of variable heart rate decelerations in the near-term ovine fetus. Am J Obstet Gynecol. 208, e281-e286 (2013).
    26. Gunn, A. J., Gunn, T. R., de Haan, H. H., Williams, C. E., Gluckman, P. D. Dramatic neuronal rescue with prolonged selective head cooling after ischemia in fetal lambs. J Clin Invest. 99, 248-256 (1997).
    27. Xu, A., Piorkowska, K., Matushewski, B., Hammond, R., Richardson, B. S. Adaptive Brain Shut-Down Counteracts Neuroinflammation in the Near-Term Ovine Fetus. 60th Meeting of the Society for Gynecologic Investigation, 20 (3), Reproductive Sci. 222A (2013).
    28. Derks, J. B., et al. A comparative study of cardiovascular, endocrine and behavioural effects of betamethasone and dexamethasone administration to fetal sheep. J Physiol Lond. 499, 217-226 (1997).
    29. Lohle, M., et al. Betamethasone effects on fetal sheep cerebral blood flow are not dependent on maturation of cerebrovascular system and pituitary-adrenal axis. J Physiol. 564, 575-588 (2005).
    30. Morrison, J. L., et al. Maternal fluoxetine infusion does not alter fetal endocrine and biophysical circadian rhythms in pregnant sheep. J Soc Gynecol Investig. 12, 356-364 (2005).
    31. Allison, B. J., et al. Ventilation of the very immature lung in utero induces injury and BPD-like changes in lung structure in fetal sheep. Pediatr Res. 64, 387-392 (2008).
    32. Rozance, P. J., et al. Intrauterine growth restriction decreases pulmonary alveolar and vessel growth and causes pulmonary artery endothelial cell dysfunction in vitro in fetal sheep. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301, L860-L871 (2011).
    33. Fowden, A. L., Giussani, D. A., Forhead, A. J. Endocrine and metabolic programming during intrauterine development. Early hum dev. 81, 723-734 (2005).
    34. Nathanielsz, P. W., Hanson, M. A. The fetal dilemma: spare the brain and spoil the liver. J Physiol. 548, 333 (2003).
    35. Manikkam, M., et al. Fetal programming: prenatal testosterone excess leads to fetal growth retardation and postnatal catch-up growth in sheep. Endocrinology. 145, 790-798 (2004).
    36. Savabieasfahani, M., et al. Fetal programming: testosterone exposure of the female sheep during midgestation disrupts the dynamics of its adult gonadotropin secretion during the periovulatory period. Biol Reprod. 72, 221-229 (2005).
    37. Bergen, N. H., et al. Fetal programming alters reactive oxygen species production in sheep cardiac mitochondria. Clin Sci (Lond). 116, 659-668 (2009).
    38. Cox, L. A., et al. A genome resource to address mechanisms of developmental programming: determination of the fetal sheep heart transcriptome. J Physiol. 590, 2873-2884 (2012).
    39. Mahoney, M. M., Padmanabhan, V. Developmental programming: impact of fetal exposure to endocrine-disrupting chemicals on gonadotropin-releasing hormone and estrogen receptor mRNA in sheep hypothalamus. Toxicol Appl Pharmacol. 247, 98-104 (2010).
    40. Blad, S., Welin, A. K., Kjellmer, I., Rosen, K. G., Mallard, C. ECG and Heart Rate Variability Changes in Preterm and Near-Term Fetal Lamb Following LPS Exposure. Reprod Sci. 15, 572-583 (2008).
    41. Frasch, M. G., et al. Heart rate variability analysis allows early asphyxia detection in ovine fetus. Reprod Sci. 16, 509-517 (2009).
    42. Frasch, M. G., Keen, A. E., Gagnon, R., Ross, M. G., Richardson, B. S. Monitoring fetal electrocortical activity during labour for predicting worsening acidemia: a prospective study in the ovine fetus near term. PLoS One. 6, e22100 (2011).
    43. Durosier, L. D., et al. Sampling rate of heart rate variability impacts the ability to detect acidemia in ovine fetuses near-term. Front pedia. 2, 38 (2014).
    44. Danielson, L., McMillen, I. C., Dyer, J. L., Morrison, J. L. Restriction of placental growth results in greater hypotensive response to alpha-adrenergic blockade in fetal sheep during late gestation. J Physiol. 563, 611-620 (2005).
    45. Edwards, L. J., Simonetta, G., Owens, J. A., Robinson, J. S., McMillen, I. C. Restriction of placental and fetal growth in sheep alters fetal blood pressure responses to angiotensin II and captopril. J Physiol. 515 (Pt 3), 897-904 (1999).
    46. Xu, A., et al. Adaptive brain shut-down counteracts neuroinflammation in the near-term ovine fetus. Front neurol. 5, 110 (2014).
    47. Xu, A., et al. The Ovine Fetal and Placental Inflammatory Response to Umbilical Cord Occlusions With Worsening Acidosis. Reprod Sci. 22 (11), (2015).
    48. Wang, X., Durosier, L. D., Ross, M. G., Richardson, B. S., Frasch, M. G. Online detection of fetal acidemia during labour by testing synchronization of EEG and heart rate: a prospective study in fetal sheep. PLoS One. 9, e108119 (2014).
    49. Reid, A., Malone, J. Q fever in Ireland A seroprevalence study of exposure to Coxiella burnettii among Department of Agriculture workers. Occ med. 54, 544-547 (2004).
    50. Roest, H. I., Bossers, A., van Zijderveld, F. G., Rebel, J. M. Clinical microbiology of Coxiella burnetii and relevant aspects for the diagnosis and control of the zoonotic disease Q fever. Vet quart. 33, 148-160 (2013).
    51. Neill, T. J., Sargeant, J. M., Poljak, Z. The effectiveness of Coxiella burnetii vaccines in occupationally exposed populations: a systematic review and meta-analysis. Zoonoses and public health. 61, 81-96 (2014).
    52. Roest, H. I., Bossers, A., Rebel, J. M. Q fever diagnosis and control in domestic ruminants. Dev biol. 135, 183-189 (2013).
    53. Frasch, M. G., et al. Fetal body weight and the development of the control of the cardiovascular system in fetal sheep. J physilo. 579, 893-907 (2007).
    54. Rurak, D., Bessette, N. W. Changes in fetal lamb arterial blood gas and acid-base status with advancing gestation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 304, R908-R916 (2013).
    55. Frasch, M. G., et al. Fetal body weight and the development of the control of the cardiovascular system in fetal sheep. J physiol. 579, 893-907 (2007).
    56. Frasch, M. G., et al. Measures of acidosis with repetitive umbilical cord occlusions leading to fetal asphyxia in the near-term ovine fetus. Am J Obstet Gynecol. 200, 200.e1-207.e1 (2009).
    57. The ESHRE Capri Workshop Group. Multiple gestation pregnancy. Hum reprod. 15, 1856-1864 (2000).
    58. Frasch, M. G. Re The perinatal development of arterial pressure in sheep: effects of low birth weight due to twinning. Reproductive sciences (Thousand Oaks, Calif.). 15, 863-865 (2008).
    59. Hancock, S. N., Oliver, M. H., McLean, C., Jaquiery, A. L., Bloomfield, F. H. Size at birth and adult fat mass in twin sheep are determined in early gestation. J Physiol. 590, 1273-1285 (2012).
    60. Wassink, G., Bennet, L., Davidson, J. O., Westgate, J. A., Gunn, A. J. Pre-existing hypoxia is associated with greater EEG suppression and early onset of evolving seizure activity during brief repeated asphyxia in near-term fetal sheep. PLoS One. 8, e73895 (2013).
    61. Mathai, S., et al. Acute on chronic exposure to endotoxin in preterm fetal sheep. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 304, R189-R197 (2013).
    62. Heuij, L. G., et al. Synergistic white matter protection with acute-on-chronic endotoxin and subsequent asphyxia in preterm fetal sheep. J neuroinflam. 11, 89 (2014).
    63. Gagnon, R., Challis, J., Johnston, L., Fraher, L. Fetal endocrine responses to chronic placental embolization in the late-gestation ovine fetus. Am J Obstet Gynecol. 170, 929-938 (1994).
    64. Miller, S. L., Supramaniam, V. G., Jenkin, G., Walker, D. W., Wallace, E. M. Cardiovascular responses to maternal betamethasone administration in the intrauterine growth-restricted ovine fetus. Am J Obstet Gynecol. 201, 613.e1-613.e8 (2009).
    65. Regnault, T. R., et al. The relationship between transplacental O2 diffusion and placental expression of PlGF, VEGF and their receptors in a placental insufficiency model of fetal growth restriction. J Physiol. 550, 641-656 (2003).
    66. Wallace, J. M., Aitken, R. P., Cheyne, M. A. Nutrient partitioning and fetal growth in rapidly growing adolescent ewes. J reprod and fertil. 107, 183-190 (1996).
    67. Rakers, F., et al. Effects of early- and late-gestational maternal stress and synthetic glucocorticoid on development of the fetal hypothalamus-pituitary-adrenal axis in sheep. Stress. 16, 122-129 (2013).
    68. Jiang, Y., et al. The sheep genome illuminates biology of the rumen and lipid metabolism. Science. 344, 1168-1173 (2014).
    69. Begum, G., et al. Epigenetic changes in fetal hypothalamic energy regulating pathways are associated with maternal undernutrition and twinning. FASEB J. 26, 1694-1703 (2012).
    70. Byrne, K., et al. Genomic architecture of histone 3 lysine 27 trimethylation during late ovine skeletal muscle development. Anim Genet. 45, 427-438 (2014).
    71. Lie, S., et al. Impact of embryo number and maternal undernutrition around the time of conception on insulin signaling and gluconeogenic factors and microRNAs in the liver of fetal sheep. Am J physiol Endocrinol. 306, E1013-E1024 (2014).
    72. Nicholas, L. M., et al. Differential effects of maternal obesity and weight loss in the periconceptional period on the epigenetic regulation of hepatic insulin-signaling pathways in the offspring. FASEB J. 27, 3786-3796 (2013).
    73. Wang, K. C., et al. Low birth weight activates the renin-angiotensin system, but limits cardiac angiogenesis in early postnatal life. Physiol rep. 3, (2015).
    74. Zhang, S., et al. Periconceptional undernutrition in normal and overweight ewes leads to increased adrenal growth and epigenetic changes in adrenal IGF2/H19 gene in offspring. FASEB J. 24, 2772-2782 (2010).

    Tags

    ביולוגיה התפתחותית גיליון 104 מודל בעלי חיים פיזיולוגיה התפתחות הרדמה ניתוח א.ק.ג. ניסויים כרוניים רכישת נתונים רב-משתנית דלקת מדעי מוח
    מכשור של כבשים עוברי לטווח הקרוב להקלטות ללא הרדמה כרוניות רבות-משתנים
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Burns, P., Liu, H. L., Kuthiala, S., … More

    Burns, P., Liu, H. L., Kuthiala, S., Fecteau, G., Desrochers, A., Durosier, L. D., Cao, M., Frasch, M. G. Instrumentation of Near-term Fetal Sheep for Multivariate Chronic Non-anesthetized Recordings. J. Vis. Exp. (104), e52581, doi:10.3791/52581 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter