Summary
Il non anestetizzato modello pecore fetale cronicamente strumentato viene utilizzato per studiare lo sviluppo del feto umano in salute e malattia, perché permette l'inserimento chirurgico e manutenzione di cateteri ed elettrodi, ripetitivo prelievi di sangue, iniezione di sostanze, registrazione dell'attività bioelettrica, e imaging in vivo. Si descrivono le procedure necessarie per stabilire questo modello.
Introduction
Una varietà di modelli animali esistono per lo studio di entrambe le gravidanze normali e compromessi, tra cui roditori da laboratorio, primati non umani e ruminanti domestici. 1,2,3,4,5 La pecora incinta cronicamente strumentato è stato ampiamente utilizzato per 50 anni come un modello di sviluppo del feto umano e le risposte agli stimoli fisiopatologici quali lipopolisaccaride (LPS). 6-10 Le lesioni a seguito di esposizione LPS imitare esattamente quello che si vede nei neonati pretermine con leucomalacia periventricolare, che è dovuto ad un profilo simile maturazione di entrambe le specie. 11, 12
Altre complicazioni della gravidanza sono stati studiati nei minimi dettagli, come la scoperta che i glucocorticoidi prenatali promuovere lo sviluppo del polmone 13-15 e comprendere l'impatto di ritardo di crescita intrauterino (IUGR) sul feto 16,17.
L'uso estensivo del modello pecore fetale è dovuto al unique amenability delle pecore fetale non anestetizzati per l'inserimento chirurgico e manutenzione di cateteri ed elettrodi, consentendo il prelievo di sangue ripetitivo, registrazione dell'attività bioelettrica, applicazione di stimolazione elettrica e in imaging cerebrale vivo. 18 telemetria è anche possibile, anche se utilizzato meno frequentemente tuttavia a causa della maggiore sofisticazione configurare come pure il costo iniziale e di mantenimento. 19
Inoltre, il modello di pecora fetale è molto versatile come molte variazioni di strumentazione sono possibili a seconda delle misure di interesse. Ad esempio, è possibile registrare più di giorni o settimane segnali multivariati in tempo reale, come i movimenti fetali di respirazione, l'attività elettrica del cervello, le risposte cardiovascolari, elettrocardiogramma, il flusso di sangue regionale per una serie di organi con sonde di flusso o microsfere, ecc Grazie a questa versatilità, una vasta gamma di studi sono stati condotti compreso lo sviluppo del cardiSistema ovascular 20,21, ipotalamo-ipofisi-surrene (HPA) 22, lo sviluppo del cervello e lo sviluppo di 23 stati di sonno, in particolare il 24, effetti dell'ipossia / asfissia 25, ipotermia terapeutica 26, infiammazione 6-11, combinazione di entrambi 27, glucocorticoidi 28,29, anti-depressivi 30, displasia broncopolmonare (BPD) 31,32, fetale programmazione 33,34,35,36,37,38,39 o lo sviluppo di nuove modalità di monitoraggio del feto prima e durante il travaglio, per citarne solo alcune aree di indagine. 40,41,42,43
L'obiettivo generale del metodo presentato è quello di mostrare implementazione di base di questo modello versatile. Permette di stabilire una vasta gamma di protocolli sperimentali acute e croniche che studiano la fisiologia e fisiopatologia fetale sul integrativo, organo, cellulari e livello molecolare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cura degli animali ha seguito le linee guida del Consiglio canadese sulla cura degli animali e l'approvazione da parte del Consiglio Université de Montréal il Animal Care (protocollo # 10-Rech-1560). Informazioni dettagliate sui materiali e metodi utilizzati è fornita nella Tabella 1.
1. Anestesia
- Inserire un catetere a lume singolo in una vena giugulare.
- Sedate pecora utilizzando acepromazina (Atravet 10 mg / mL) 2 mg per via endovenosa circa 30 minuti prima dell'induzione dell'anestesia per ridurre lo stress associato con la procedura che a sua volta riduce i livelli di cortisolo.
- Somministrare diazepam (Diazepam 5 mg / mL) 20 mg, ketamina (Ketalar 100 mg / ml) 4-5 mg / kg e propofol (propofol 10 mg / mL) da 0,5 a 1 mg / kg per via endovenosa per indurre anestesia generale.
- Inserire un catetere di scambio delle vie aeree in trachea con un laringoscopio a lama tipo Wisconsin (extra lunghi 350 mm mancina Blade) per aiutare con l'intubazione. Far scorrere il tubo endotracheale silicio (diametro 9 a 12 mm interno) dal catetere scambio vie aeree e nella trachea. Questa tecnica facilita il processo di intubazione. Gonfiare accuratamente la cuffia del tubo endotracheale per evitare ulcere indotte pressione della trachea e fissare il tubo di testa di pecora.
- Collegare il tubo endotracheale al circuito respiratorio della macchina anestetico e iniziare immediatamente la ventilazione meccanica. Regolare le impostazioni del ventilatore per mantenere una P a di CO 2 entro limiti normali di 35 a 45 mmHg.
- Inserire un catetere nell'arteria auricolare (22 a 20 G, 1 in [0,9 x 25 mm] a 1,16 in [1,1 x 30 mm]) e collegare a tubi non conforme per monitorare la pressione arteriosa diretta.
- Utilizzare un monitor fisiologica multiparametrico per registrare l'elettrocardiogramma, pressione arteriosa diretta, saturazione di ossigeno (SpO2), capnografia (P ET 2 CO), e la temperatura ogni 5 minuti. Trasferire tutto phdati ysiologic tramite un cavo seriale ad una fisiologica del computer di raccolta dati centrale. Mantenere la temperatura corporea normale usando una coperta acqua circolante.
- Fornire soluzione di poli-ionica equilibrata a 10 ml / kg per la prima ora di anestesia generale e quindi ridurre a 5 mL / kg / h.
- Amministrare trimetoprim-sulfadoxine 5 mg / kg IV della pecora appena prima l'incisione cutanea come profilassi antibiotica.
- Utilizzare tecniche standard di asepsi con tutte le manipolazioni chirurgiche della pecora e feto.
- Barriera infermiere le pecore in ogni momento. Questo include anche il personale non-chirurgici. Questo ridurrà la possibilità enzootica per esempio, Coxiella burnetii. Usare guanti e maschere (N-95 tipo) in ogni momento.
2. Panoramica della procedura chirurgica
- Fare un 20 centimetri incisione mediana attraverso la parete addominale inferiore immediatamente craniale alla mammella attraverso la linea alba per minimizzare i danni muscolo addominale.
- Retract grande omento craniale e le corna uterine sono palpate manualmente. Palpare ogni corno dal corpo dell'utero alla punta del corno notando il numero di feto e le loro dimensioni. Se vi è più di un feto, scegliere il feto grande valutando manualmente la dimensione della testa e la larghezza tra le orbite.
- Tenere la testa del feto scelte in modo definitivo attraverso l'utero parzialmente esteriorizzato. Eseguire un 10 centimetri isterotomia sulla grande curva con le forbici Metzenbaum. Mettere immediatamente sopra la testa di un non-lattice sterile guanto chirurgico riempito con soluzione salina sterile come se fosse una mano. In alternativa, utilizzare 4x4 inumiditi per mantenere la testa del feto umido. Fissare l'utero alla parete addominale.
- Esteriorizzare le destro e sinistro arti toracici e tirare il feto delicatamente dell'utero fino al processo xifoideo.
- Inserire polivinile cateteri nel giusto e brachiale sinistro vena e arterie con una tecnica cut-down standard. Inserire another polivinil catetere nella cavità amniotica da fissarsi sua 'fine allo sterno del feto.
- Utilizzare solo cateteri sterili. Si consiglia di sterilizzazione a gas nella vostra struttura standard. Attaccare ogni catetere ad un ago e l'ago doppio rubinetto per permettere la successiva prelievo di sangue o di monitoraggio della pressione.
- Suturare elettrodi in acciaio inox al manubrio, xifoide e ad ogni punto della spalla per monitorare l'elettrocardiogramma (ECG).
- Ritorna il feto in utero. Tutti i cateteri e gli elettrodi uscita attraverso una piccola incisione pugnalata fianco sinistro.
- Chiudere l'incisione laparotomica con una chiusura a tre strati. Sutura della parete addominale con una sutura sintetica assorbibile monofilamento USP 2 in un semplice modo continuo. Chiudere lo spazio sottocutaneo con una sutura sintetica assorbibile intrecciata USP 0 in un semplice modo continuo. Utilizzare graffette in acciaio inox chirurgici per chiudere l'incisione cutanea.
- Rimuovere la lana con la rasatura del processo xifoideo alla ghiandola mammaria e lungo la piega del fianco su entrambi i lati con una lama # 40. Pulire l'addome ventrale poi accuratamente con un clorexidina gluconato al 4% e una spazzola morbida per 3 min.
- Eseguire uno scrub sterile con clorexidina gluconato serie 4% a partire dal centro dell'addome e progredendo in modo centrifugo per 3 min. Versare salina sterile sull'addome per rimuovere il sapone disinfettante. Per la fase finale della preparazione chirurgica, eseguire tre passaggi alternati di soluzione di gluconato di clorexidina 2% e alcool isopropilico al 70%.
- Assicurarsi che la profondità dell'anestesia sia adeguata prima di incisione. Eseguire un'incisione laparotomia standard dal cordone ombelicale a solo cranica alla mammella attraverso la linea alba per minimizzare i danni muscolo addominale.
- Inserire una lunga pinza spugna nell'addome lungo la sinistra addominale muro sual sito di uscita prevista per cateteri nella regione paracostale.
- Spingere le punte della pinza contro il muro fino a quando un assistente in grado di individuare e confermare il sito appropriato. Aprire leggermente (1 cm) le ganasce della pinza e lasciare che l'assistente di fare 2 cm a tutto spessore un'incisione.
- Esteriorizzare le punte della pinza attraverso l'incisione, aprire di nuovo, e prenda delicatamente i cateteri con la pinza che è finalmente tirato fuori dell'addome attraverso l'incisione addominale ventrale. Da segnalare, alcuni gruppi impiantano i cateteri e poi li esteriorizzare. Questo ha lo svantaggio che intraoperatoria monitoraggio ECG fetale non è possibile.
- Palpare l'utero per determinare la posizione fetale e numeri. Determinare la più grande feto utilizzando la distanza tra gli sonora. Incidere la parete uterina sulla grande curvatura sul dorso della testa, evitando i cotiledoni.
- Inserire una cannula smussa-ended attraverso le membrane placentari per ottenere un amcampione di fluido niotic libero da emorragia. Incidere le membrane placentari con le forbici.
- Esteriorizzare la parte craniale del feto attraverso questa incisione. Posizionare un sterile, non in lattice guanti chirurgici riempito con soluzione salina sterile a 37 ° C sopra la testa del feto per aiutare a mantenere la normotermia.
- Durante la rimozione della parte superiore del corpo del feto dall'utero, hanno l'assistente reggere della Babcock per prevenire la perdita di liquido amniotico. Poi, sempre con pinze Babcock, serrare le membrane fetali e parete uterina per la pelle per evitare la contaminazione addominale con liquido amniotico.
- Esporre solo le parti del corpo fetale che devono essere strumentato e mantenere le restanti parti interne dell'utero o coperto da un panno sterile umida e calda (37 ° C), rispettivamente.
- Rapire entrambi gli arti toracici per facilitare l'esposizione alla vena brachiale e bilateralmente. Incidere lungo la faccia mediale di entrambi antebrachium e curasezionare completamente intorno all'arteria brachiale e vena.
- Inserire polivinile cateteri nel diritto e le arterie brachiale sinistro e il brachiale sinistro vena utilizzando una tecnica cut-down standard.
- Liberare la nave da cateterizzato da tessuti adiacenti oltre 1 cm. Legare la porzione distale del vaso con una sutura intrecciata sintetica assorbibile USP 2-0. Preposto una legatura all'aspetto prossimale del vaso ma tenerlo slegato.
- Utilizzando le forbici Castroviejo, tagliare trasversalmente la nave a circa il 30% del suo diametro. Arrestare il flusso di sangue parzialmente tirando la sutura prossimale. Inserire il catetere in direzione prossimale.
- Inserire il polivinile catetere fino a 8 cm prossimale o fino a quando la resistenza viene rilevato e poi tirare leggermente indietro. Temporaneamente garantire l'aspetto prossimale del catetere mediante un morsetto vascolare. Posizionare un altro sutura intorno sia prossimale e distale del catetere. Un assistente è continuamente aspirating lavaggio e il catetere per assicurare la pervietà del catetere.
- Chiudere la pelle del feto utilizzando un USP 2-0 intrecciata sutura assorbibile sintetico, con un modello di sutura continua.
- Liberare la nave da cateterizzato da tessuti adiacenti oltre 1 cm. Legare la porzione distale del vaso con una sutura intrecciata sintetica assorbibile USP 2-0. Preposto una legatura all'aspetto prossimale del vaso ma tenerlo slegato.
- A destra ea spalla sinistra, manubrio e il processo xifoideo, fissare un elettrodo in acciaio inox coibentato per facilitare il monitoraggio dell'ECG fetale.
- Suturare la pressione amniotico e il catetere di campionamento allo sterno. Questo catetere è fenestrata alla sua estremità.
- Fissare tutti i cateteri sul dorso del feto utilizzando un materiale di sutura assorbibile intrecciata sintetico USP 2-0.
- Prima della sostituzione del feto posteriore nell'utero, somministrare clenbuterolo 30 mg IV lentamente oltre 15 min per evitare l'ipotensione e fornire rilassamento uterino.
- Suturare le membrane fetali utilizzando USP 4-0 intrecciata materiale di sutura assorbibile sintetico con un modello continuo. Incorporare un solo catetere o elettrodo alla volta nelle closure per garantire una chiusura a tenuta. Utilizzare un doppio strato di Cushing modello rispetto dei principi Halsted per chiudere la strato muscolare dell'utero utilizzando un materiale di sutura assorbibile intrecciata sintetico USP 0. Bury attentamente i nodi chirurgici.
- Utilizzando una sutura a borsa di modello, fissare tutti i cateteri e cavi ECG che escono dalla incisione paracostale sinistra.
- Utilizzando un monofilamenti sintetici materiale USP 2 sutura riassorbibile fissare la linea alba con un modello continuo. Chiudere i tessuti sottocutanei con USP 2-0 intrecciato materiale di sutura assorbibile sintetico con un modello continuo. Fissare lo strato di pelle con punti chirurgici.
- Somministrare 250 mg di ampicillina per via endovenosa e di nuovo attraverso il catetere amniotico nella cavità amniotica. Sostituire i liquidi persi amniotico con soluzione salina calda.
- Mettere tutti i cateteri esteriorizzato ed elettrodi ECG in un sacchetto posto per mantenere la sterilità. Posizionare una maglia intorno al torso di pecora per garantire tutto il un cateterid elettrodi al corpo della pecora.
- Smettere di anestesia generale, e estubare pecora una volta riflessi laringei sono tornati alla normalità.
- Riportare la pecora una gabbia metabolica, una volta lei è stabile dopo l'anestesia generale. La pecora risiederà nella gabbia metabolica per la durata dell'esperimento. La pecora deve essere in grado di stare in piedi, sdraiarsi e mangiare ad libitum durante il monitoraggio del feto non anestetizzato senza sedativo della madre.
- Per i tre giorni successivi, somministrare antibiotici come profilassi per la pecora (Trimetoprim sulfadoxine 5 mg / kg) e il feto (250 mg di ampicillina per via endovenosa e di nuovo attraverso il catetere amniotico).
- Valutare lo stato metabolico sia di pecora e feto utilizzando analisi del sangue gas.
- Lavare tutti i cateteri con il volume minimo di soluzione fisiologica eparinizzata possibile. Attenzione - non superare la dose giornaliera di eparina e fluidi ammissibile per il feto. È possibile fluido sovraccaricare il feto. Flush lentamente una voltaun giorno ~ 5 ml di NaCl per riga dopo profilassi antibiotica.
- Durante l'intervento, eventualmente registrare i tassi materni e fetali ECG e cuore, nonché materna pressione arteriosa e la pressione delle vie aeree (Paw) continuamente (Figura 1). Utilizzare la finestra di monitoraggio della durata di acquisire tutti i dati materni tranne ECG. Alimentare questi dati nel convertitore analogico-digitale con segnali ECG fetali e materni; passare ECG materno e fetale prima in 1.901 preamplificatore. Registrare e visualizzare tutti i dati nel software del produttore.
- Prelevare un campione arterioso 1 mL contemporaneamente dal pecora e feto per emogasanalisi, lattato, glucosio e basare determinazione eccesso (in plasma) al punto d'inizio della chirurgia fetale (immediatamente dopo aver inserito il primo catetere arterioso) e dopo la chiusura dell'utero .
- Durante il recupero post-operatorio, prendere un campione di sangue fetale 3 mL per misurare l'IL-6 e TNF-α inflammprofili Atory. Centrifugare il plasma a 4 ° C (4 min, 4.000 xg), decantare e conservare il plasma a -80 ° C per il successivo test ELISA.
Nota: Ai fini dei risultati rappresentativi riportati, sei giorni dopo l'intervento gli animali sono stati sacrificati mediante iniezione endovenosa di 20 ml sodio pentobarbital. Crescita fetale è stata valutata mediante il corpo, cervello, fegato e pesi materni. La durata del periodo sperimentale sarà ovviamente variano a seconda del disegno scelto per la particolare domanda di ricerca e può raggiungere ~ 6 settimane.
- Determinare le concentrazioni di citochine (IL-6, TNF-alfa) nel plasma usando un panino specifici ovine ELISA. Anticorpi anti-pecora monoclonali di topo Pre-coat (anticorpo di cattura IL-6) o topo anti-bovino anticorpo monoclonale (TNF-α) ad una concentrazione 4 ug / ml sulla piastra ELISA a 4 ° C per O / N, dopo 3 volte lavare con tampone di lavaggio (0,05% Tween 20 in PBS, PBST).
- Bloccare le piastre per 1 h con 1% BSA in PBST. Lavare le piastre con tampone di lavaggio per 3 volte.
- Utilizzare le proteine ricombinanti di pecora (IL-6, TNF-alfa) di serie ELISA, preparare una diluizioni seriali vanno da standard di 1 su 2.000 ng / ml a livello 7 di 31,25 pg / ml.
- Carico 50 ml di standard di proteine diluite seriali e campioni per pozzetto e incubare per 2 ore a temperatura ambiente, lavare i piatti per 3 volte. Eseguire tutti gli standard e campioni in duplicato.
- Applicare 50 ml di anticorpi policlonali anti-coniglio di pecora (anticorpo di rilevazione IL-6) o coniglio anticorpo policlonale anti-bovino (TNF-alfa) alla diluizione di 1: 250 in pozzetti e incubare per 30 minuti a RT. Lavare le piastre con tampone di lavaggio 5 volte.
- Aggiungere 50 ml di capra anti-IgG di coniglio HRP-coniugato (diluizione 1: 5.000) per 30 min.
- Incubare con 50 ml di soluzione di substrato TMB in ogni pozzetto.
- Arrestare la reazione di sviluppo colore al momento desiderato con 25 ml di acido solforico 2 N.
- Leggi l'plAtes sul lettore di piastra ELISA a 450 nm, con una correzione di lunghezza d'onda 570 nm.
Nota: Nei nostri saggi, la sensibilità di IL-6 era ELISA 16 pg / ml, la sensibilità di TNF-alfa ELISA era di 13,9 pg / ml, rispettivamente. Per tutte le analisi, i coefficienti intra-saggio e inter-saggio della varianza è stata <5% e <10%, rispettivamente.
Nota: I metodi statistici esatti dipenderanno dalla domanda di ricerca. Qui riportiamo i metodi utilizzati per verificare eventuali differenze significative nei gas ematici riportati in Tabella 2.
- Metti alla prova la distribuzione dei dati normale usando il test di Kolmogorov-Smirnov seguito da test parametrici o non parametrici con regolazione per confronti multipli, a seconda dei casi.
- Utilizzare K-means cluster analysis per individuare i feti nella coorte che erano spontaneamente ipossico e determinare le rispettive pO 2 e O 2 valori Sat (considerare pO 2 <20 mmHg o O 2 Sat <55% come fetal ipossia). 44-48
- Utilizzare un software statistico SPSS, come per le analisi.
- Presentare i dati come media ± SD con differenze statistiche a p <0.05 considerati significativi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
38 in gravidanza pecore in tempo datato stati strumentati a 128 ± 2 giorni di gestazione (DGA, ~ 0,88 gestazione, durata 145 DGA) con arterioso, venoso e cateteri amniotico ed elettrocardiogramma (ECG) elettrodi con tecnica sterile in anestesia generale (sia pecora e il feto ). In caso di gravidanza gemellare del feto più grande è stato scelto sulla base di palpazione e la stima del diametro intertemporale; in alternativa, il feto deve essere strumentato può essere selezionato in modo casuale al fine di evitare qualsiasi pregiudizio potenziale o entrambi i feti possono essere dotati di strumenti. La durata totale della procedura era di 124 ± 27 min. La parte del corpo superiore del feto da strumentazione è rimasto al di fuori dell'utero per 92 ± 19 min. La maggior parte delle pecore strumentato erano animali F2. Il loro diga era F1 (Border Leicester * Romanov), e il padre era un ariete Hampshire; sono stati incrociati come segue: Hampshire (50%) - Border Leicester (25%) - Romanov (25%) = HABLRV.
Materna Rappresentante e fisiologico del fetocaratteristiche durante l'intervento chirurgico e la strumentazione sono mostrati in figura 1 ed erano nella norma fisiologica per l'età gestazionale del feto e comportamento materno durante l'anestesia.
Pesi materni in media 75 ± 11 kg e 21 su 38 gemelli trasportati (vale a dire, ad una velocità di 1,6 ± 0,5). Al momento della necropsia (134 ± 3 DGA), tra i feti single strumentate pesato 4.090 ± 800 g mentre il peso dei gemelli è stato inferiore a 3300 ± 740 g (p = 0,003). Il peso dei gemelli uninstrumented a 3300 ± 670 g era simile al peso dei gemelli strumentati (p = 0,78). 18 dei feti strumentati erano donne e 20 erano di sesso maschile.
La dinamica dei gas del sangue arterioso fetale, lo stato di glucosio e acido-base durante l'intervento chirurgico e il recupero post-operatorio sono riportati in Tabella 1. Abbiamo osservato un graduale recupero di acido-base fetale e un moderato peggioramento dell'ossigenazione con pochi cambiamenti in glucose ed elettroliti da giorni post-operatorio 1 a 3. In particolare, il giorno post-operatorio 3, 42% dei feti sono risultati spontaneamente ipossico con arteriosa pO2 11 mmHg e di O 2 Sat del 28%. Fetale pO del cluster normossiche 2 era centrata a 22 mmHg e O 2 Sat a 56%. Feti gemelli non erano più ipossico di feti singoli (p = 0,26).
Arterioso fetale IL-6 ELISA reso valori al di sotto della soglia di sensibilità di 16 pg / ml per tutto il periodo di recupero post-operatorio. Similmente, i livelli di TNF-α sono rimaste invariate e molto bassa a 29 pg / ml con ~ 30% degli animali mostrano anche valori inferiori alla soglia di sensibilità di 13,9 pg / ml durante il periodo di recupero post-operatorio.
Figura 1. intrachirurgica monitoraggio materna e fetale. FHR, cuore del feto tasso in battiti al minuto (bpm); FECG, elettrocardiogramma fetale (V); PAW, materna pressione positiva (mmHg); MABP, materna pressione arteriosa (mmHg); MHR, frequenza cardiaca materna (bpm); mECG, materna ECG (V). L'asse X è la scala temporale in hh: mm:. Ss Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. spontanea del feto ipossia e del peso corporeo. Nessuna relazione tra peso corporeo fetale e arteriose pO 2 al giorno post-operatorio 3 è stato rilevato (Spearman R = 0,326, p = 0,161). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .
| Fonte luminosa ACE | Schott-Fostec | ||
| Sezionare forbici | Strumenti Belle Scienza | 14060-11 | |
| Forbici dissezione angolari | Strumenti Belle Scienza | 15006-09 | |
| Maniglia Scalpel | Strumenti Belle Scienza | 10003-12 | strumento di dissezione alternativa |
| Lame di bisturi curve # 12 | Strumenti Belle Scienza | 10012-00 | strumento di dissezione alternativa |
| Forbici Bone | Strumenti Belle Scienza | 16044-10 | |
| S & T di sutura legatura forcipe | Strumenti Belle Scienza | 00272-13 | |
| Pinze Dumont SS - angolato | Strumenti Belle Scienza | 11203-25 | |
| Seta intrecciato formato sutura 6-0 | Teleflex Medical | 07 -30 - 10 | |
| Nastro medica | Transpore | 3M | |
| Ketamina cloridrato 100 mg / ml | Hospira | NDC 0409 - 2051 - 05 | Non finale è di 80 mg / kg |
| Tranqui Ved iniezione (xilazina 100 mg / ml) | Vecdo | NDC 50989 - 234 - 11 | Non ultimo è di 10 mg / kg |
| Arancione reattiva 14 | Sigma - Aldrich | R - 8254 | |
| Ringers Componenti della soluzione | Soluzione è il gas equilibrata con il 95% di O2 e 5% CO2, pH finale 7.4 | ||
| Cloruro di sodio | Sigma - Aldrich | S7653 | Concentrazione finale: 118 mm |
| Cloruro di potassio | Fisher Scientific | P217 - 3 | Concentrazione finale: 4,7 mm |
| Cloruro di calcio dihydrate | Fisher Scientific | C79 - 500 | Concentrazione finale: 2.5 mm |
| Potassio fosfato monobasico | Fisher Scientific | P -285 | Concentrazione finale: 1,2 mm |
| Solfato di magnesio | JT Baker | Jan-00 | Concentrazione finale: 0,57 mM |
| 4- (2-idrossietil) piperazina-1-acido etansolfonico (HEPES) | Fisher Scientific | BP 310-500 | Concentrazione finale: 5.95 g / L |
| Glucosio | Sigma - Aldrich | G8270 | Concentrazione finale: 5,5 mm |
| LifeWindow | Digicare Tecnologie Biomediche | ||
| CED bioamplifier e ADC unità | Cambridge Electronic Design Limited, Unità 4, Science Park, Milton Road, Cambridge CB4 0FE INGHILTERRA. | <td> BioAmp: 1902; ADC: micro1401; Software di acquisizione dati: Spike 2, V7.13 ||
| Neurolog bioamplifier segnale analogico | Digitimer Ltd 37 Hydeway Welwyn Garden City Hertfordshire, AL7 3BE, Inghilterra | NL108A | |
| ABL800Flex | Radiometer Canada; 200 Aberdeen Dr, London, ON N5V 4N2 | ||
| Eppendorf 5804R | Eppendorf Canada; 2810 Argentia Road, # 2 Mississauga, Ontario, L5N 8L2 | ||
| Arrow giugulare Cateterismo Set | Arrow International, Inc., 2400 Bernville Road, Reading, PA 19605 Stati Uniti d'America | ||
| Atravet | 10 mg / ml | ||
| Diazepam | 5mg / ml | ||
| Ketamina | Ketalar | <td> 100 mg / ml | |
| Propofol | 10 mg / ml | ||
| SurgiVeT | Tubi endotracheali; Smiths Medical ASD, Inc. St. Paul, MN 55112, Stati Uniti d'America | ||
| Cuocere Airway cambio catetere con adattatori RAPI-FIT | Cook Critical Care 750, Bloomington IN 47402-0489 Stati Uniti d'America | ||
| Dispomed Ventilatore | Dispomed Ltd., 745 Nazaire-Laurin, Joliette, Québec J6E 0L6 | ||
| BD Insyte-W | Becton Dickinson, terapia di infusione Systems Inc., 9450 S State St, Sandy Utah 84070 Stati Uniti d'America | 22 a 20 g; 1 in [0,9 x 25 mm] a 1,16 in [1,1 x 30 mm] | |
| Edwards Lifesciences Rif: kit di monitoraggio della pressione PX272 con TruWave pressione monouso | |||
| LifeWindow LW6000 | Digicare Biomedical Tecnologia 107 Commerce Road, Boynton Beach, FL 33426-9365 Stati Uniti d'America | ||
| Gaymar | |||
| Babcock | |||
| Cateteri polivinile | SCI (Scientific Commodities Inc.) | 2 metri | |
| 2-0 Vicryl | |||
| Forbici Castroviejo | |||
| elettrocardiogramma (ECG) | LIFYY, Metrofunk Kabel-Union, Berlino, Germania | quattro elettrodi di rame in un'unica guaina, 2 metri | |
| 2-O Vicryl | |||
| 3-0 Vicryl | |||
| PDS II USP | |||
| Sulfadoxine Trimetoprim | |||
| Ampicillin | |||
| Rubinetto di arresto | Argon Medical, Gatto 041220001A | Doppio Rubinetto a 4 vie con luer lock maschio | |
| Aghi | Tyco Healthcare 8881202389 | Mozzo in alluminio Monoject aghi smussati, 22Gx, 0.7mmx 38,1 mm: per arterioso fetale e cateteri venosi | |
| Aghi | Tyco Healthcare 8881202322 | Mozzo in alluminio Monoject aghi smussati, 16Gx, 1.6mmx38.1mm: per cateteri amniotico |
Tabella 1. Reagenti Specifici / attrezzature.
Si prega di cliccare luinuovamente per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 2. panoramica completa dei fetali nel sangue gas, metaboliti ed elettroliti durante l'intervento chirurgico e il recupero post-operatorio. Fetale sangue arterioso pH, PCO 2 (mmHg), pO 2 (mmHg), saturazione di ossigeno (O 2 sab%), glicemia (mg / dL), lattato (mmol / L) e l'eccesso di base (mmol / L) in vari momenti dei periodi strumentazione e di recupero: inizio della chirurgia fetale subito dopo l'installazione del primo catetere arterioso fetale (utero aperto), fine di chirurgia fetale (utero giorni chiuso), post-operatoria da 1 a 3. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'anestetico e le procedure chirurgiche sono presentati che sono necessari per la creazione di un modello animale per lo studio della fisiologia e fisiopatologia fetale: la pecora feto non anestetizzato cronicamente strumentato.
Quattro passi critici all'interno del protocollo devono essere sottolineati. Innanzitutto, passando i cateteri e elettrodi attraverso il fianco materno: è importante che venga effettuata una volta per evitare eventuali lesioni di organi interni. In secondo luogo, in sicurezza del sito operativo uterotomy prima esteriorizzante feto: questo è fondamentale per evitare o minimizzare la perdita di liquido amniotico e successiva sutura della membrana amniotica prima della chiusura uterina. In terzo luogo, il cateterismo arterioso: arterie pecore fetali sono circa 1-2 mm di diametro, e quindi non è difficile cateterizzare per un chirurgo esperto; un gruppo di due chirurghi esegue migliore e più veloce in questo compito che consente di risparmiare tempo per minimizzare l'ingombro della procedura. In quarto luogo, attento securante e organizzazione di tutti i cateteri ed elettrodi nella cavità amniotica prima di restituire il feto nel sacco amniotico e chiudendo l'utero: questo aiuta a evitare di tirare accidentale dei cateteri o strappo degli elettrodi ECG a causa di movimenti materne o fetali dopo l'intervento chirurgico.
Invece di un approccio qui presentato per cateterizzare vasi brachiale, carotideo o vasi femorali può anche essere usato. La scelta dipende l'approccio globale strumentazione che a sua volta sarà dettato dal disegno dello studio. Si consiglia di ridurre al minimo il tempo feto trascorre fuori dell'utero e minimizzare la misura in cui il feto deve rimanere fuori dell'utero essere strumentato. Queste considerazioni hanno portato alla scelta dei vasi strumentato nel "approccio minimale" presentato. Si consiglia di CATETERISMO arterie su entrambi i lati per consentire il monitoraggio della pressione sanguigna intra-arteriosa e arteriosa prelievi di sangue senza interferenze reciproche in tutta tegli esperimento. Un ulteriore vantaggio è la ridondanza fail-safe questo approccio introduce: nel caso in cui un'arteria venga bloccato durante il periodo di sperimentazione, di campionamento e monitoraggio della pressione sono possibili dallo stesso recipiente con l'inconveniente di interrompere il monitoraggio durante il prelievo di sangue è fatto.
Ci sono tre limiti, che precludono un adattamento più ampia di questo modello animale. Queste limitazioni possono essere affrontati da alcune modifiche suggerite qui di seguito. In primo luogo, è il requisito per livello di biosicurezza 2 confini in alcune giurisdizioni. Ciò è dovuto a un rischio di infezione da Coxiella burnetii da pecore gravide negli esseri umani con un sistema immunitario indebolito. 49,50 La vaccinazione è disponibile per gli animali e gli esseri umani esposti a ridurre questo rischio 51,52 e PCR test può essere fatto per garantire che non animali positivi sono consegnati al centro di ricerca dalla fattoria. Una soluzione può essere quella di combinare la vaccinazione animale con prova multipla PCRs in azienda dai tamponi vaginali eseguiti prima allevamento iniziare, prima della consegna e poi di nuovo dal fluido amniotico durante l'intervento chirurgico. Con queste precauzioni, in alcune giurisdizioni l'uso di pecore nella ricerca non è limitata in quanto è in altri. In secondo luogo, il costo per animale è nell'intervallo quattro cifre inferiore, paragonabile ad alcuni ceppi murini knockout. Con questo in mente, tuttavia, il guadagno informazioni da ogni esperimento pecore fetale confronta solo per i primati non umani in quanto riguarda la vasta quantità di dati che possono essere raccolti, le domande che possono essere poste e il potenziale della traduzione alla causa umana per i tempi di sviluppo di organi in pecore. In terzo luogo, c'è la questione di allevamento e la disponibilità degli animali durante alcuni periodi in solo l'anno. Anche con il trattamento ormonale, risultati di riproduzione pecore, come tasso di gravidanza e la vitalità di agnelli (feti) sono soddisfacenti solo pochi mesi in tutto stagioni di allevamento naturali. 53 Quindi, esperimentoAl programmazione richiede un'attenta pianificazione con gli anni divisi in un autunno e la primavera le stagioni. Una soluzione può essere quella di stabilire un Aprile-to-giugno sperimentali "stagioni pecore 'settembre a novembre e. Questo problema è anche una virtù, in quanto consente di tempo per analizzare i molti dati raccolti durante ogni stagione sperimentale.
Vi è un certo numero di fattori che contribuiscono al significato rispetto ai metodi esistenti. I dati morfometrici, cardiovascolari e gas ematici sono stati presentati all'interno della gamma per la specie 54,55 e simili a quelli della specie umana 56, uno dei principali vantaggi di questo modello animale. Un'eccezione è il più alto tasso di gravidanze multiple rispetto ai gemellaggi umano. 57 Questo però è anche una virtù del modello, a studiare gli effetti dei gemellaggi sullo sviluppo del feto è un compito importante biomedico. 55,58,59 livelli molto bassi di posta Valida infiammazione come misurato da IL-6 e TNF-alfa ELISAcombinato con recupero di acido-base indicano che la strumentazione chirurgica fetale è ben tollerato e il periodo di recupero post-operatorio di 72 ore è sufficiente per garantire una condizione linea di base stabile della pecora fetale prima di iniziare un esperimento. Alta percentuale di spontanea moderata ipossia cronica nelle pecore fetale breve termine le rende un modello interessante per studiare gli effetti cronici della ipossia prenatale umano e infiammazione sullo sviluppo fetale e perinatale, come ad esempio, IUGR, e insulti perinatali, come l'infiammazione e asfissia acuta. 60,61,62 diversi modelli ovini IUGR sono utilizzati, basandosi su qualche ipossia spontanea, alcuni inducendo dal embolizzazione placentare, per esempio. 16,63-66 D'altra parte, grave ipossia prima dell'inizio di un esperimento può anche essere un criterio di esclusione nei casi in cui ad esempio, sistema nervoso cardiovascolare o centrali sono da studiare, come in questo caso le risposte di ipossico cronicamente feti unri noto differire da quelli che sono normossia. 60 Un'altra applicazione importante è lo studio di impatto prenatale stress materno sullo sviluppo fetale e postnatale. 5,67 Infine, come si può vedere nelle numerose pubblicazioni citate con questo modello, la strumentazione fetale può essere fatta nel corso di una vasta gamma di età gestazionale ovunque da ~ 70-135 DGA corrispondente a metà della gestazione - studi a breve termine dello sviluppo fetale. Con l'età gestazionale avanza, strumentazione di crescente complessità sono possibili, ma le considerazioni della durata della strumentazione chirurgica necessità da pesare contro la necessità di ottenere un numero di registrazioni multivariati dallo stesso feto.
Un certo numero di applicazioni future molto promettenti della tecnica presentata deriva dal numero sempre crescente di reagenti di biologia molecolare specifico per pecora e recente sequenziamento del genoma pecore. Questi recenti sviluppi hanno ulteriormente promosso questa animal modello sia un approccio molto promettente e potente per comprendere lo sviluppo del feto umano sano e patologico a varie scale di organizzazione, da (epi) genoma di fisiologia integrativa. 68 69-74
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACE Light source | Schott-Fostec | A20500 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14060 - 11 | |
| Angled dissecting scissors | Fine Science Tools | 15006 - 09 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003 - 12 | alternating dissecting tool |
| Curved scalpel blades #12 | Fine Science Tools | 10012 - 00 | alternating dissecting tool |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044 - 10 | |
| S & T suture tying forceps | Fine Science Tools | 00272 - 13 | |
| Dumont SS forceps - angled | Fine Science Tools | 11203 - 25 | |
| Braided silk suture size 6-0 | Teleflex Medical | 07 - 30 - 10 | |
| Medical Tape | transpore | 3M | |
| Ketamine hydrochloride 100 mg/ml | Hospira | NDC 0409 - 2051 - 05 | Final Does is 80 mg/kg |
| Tranqui Ved Injection (xylazine 100 mg/ml) | Vecdo | NDC 50989 - 234 - 11 | Final Does is 10 mg/kg |
| Reactive orange 14 | Sigma - Aldrich | R - 8254 | |
| Ringers Solution Components | Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% Co2, final pH 7.4 | ||
| Sodium chloride | Sigma - Aldrich | S7653 | Final Concentration: 118 mM |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 - 3 | Final Concentration: 4.7 mM |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79 - 500 | Final Concentration: 2.5 mM |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P -285 | Final Concentration: 1.2 mM |
| Magnesium sulfate | J.T. Baker | Jan-00 | Final Concentration: 0.57 mM |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BP 310 - 500 | Final Concentration: 5.95 g/L |
| Glucose | Sigma - Aldrich | G8270 | Final Concentration: 5.5 mM |
| LifeWindow | Digicare Biomedical Technology | ||
| CED bioamplifier and ADC units | Cambridge Electronic Design Limited, Unit 4, Science Park, Milton Road, Cambridge CB4 0FE ENGLAND. |
Bioamp: 1902; ADC: micro1401; Data acquisition software: Spike 2, V7.13 | |
| Neurolog analog signal bioamplifier | Digitimer Ltd 37 Hydeway Welwyn Garden City Hertfordshire, AL7 3BE, England |
NL108A | |
| ABL800Flex | Radiometer Canada; 200 Aberdeen Dr, London, ON N5V 4N2 | ||
| Eppendorf 5804R | Eppendorf Canada; 2810 Argentia Road, #2 Mississauga, Ontario, L5N 8L2 |
||
| Arrow Jugular Catheterization Set | Arrow International, Inc., 2400 Bernville Road, Reading, PA 19605 USA | ||
| Atravet | 10 mg/ml | ||
| Diazepam | 5 mg/ml | ||
| Ketamine | Ketalar | 100 mg/ml | |
| Propofol | 10 mg/ml | ||
| SurgiVeT | Endotracheal Tubes; Smiths Medical ASD, Inc. St. Paul, MN 55112, USA | ||
| Cook Airway Exchange Catheter with RAPI-FIT Adapters | Cook Critical Care 750, Bloomington IN 47402-0489 USA | ||
| Dispomed Ventilator | Dispomed Ltd., 745 Nazaire-Laurin, Joliette, Quebec J6E 0L6 | ||
| BD Insyte-W | Becton Dickinson, Infusion Therapy Systems Inc., 9450 S State St, Sandy Utah 84070 USA | 22 to 20 G; 1 in [0.9 x 25 mm] to 1.16 in [1.1 x 30 mm] | |
| Edwards Lifesciences Ref: PX272 Pressure monitoring kit with TruWave Disposable Pressure | |||
| LifeWindow LW6000 | Digicare Biomedical Technology 107 Commerce Road, Boynton Beach, FL 33426-9365 USA | ||
| Gaymar | |||
| Babcock | |||
| Polyvinyl catheters | SCI (Scientific Commodities Inc.) | 2 meters | |
| 2-0 Vicryl | |||
| Castroviejo scissors | |||
| electrocardiogram (ECG) | LIFYY, Metrofunk Kabel-Union, Berlin, Germany | four copper electrodes in single sheath, 2 meters | |
| 2-O Vicryl | |||
| 3-0 Vicryl | |||
| PDS II USP | |||
| Trimethoprim sulfadoxine | |||
| Ampicillin | |||
| Stopcock | Argon Medical, Cat 041220001A | Double 4-way Stopcock with male luer lock | |
| Needles | Tyco Healthcare 8881202389 | Monoject aluminum hub blunt needles, 22Gx, 0.7mmx 38.1mm: for fetal arterial and venous catheters | |
| Needles | Tyco Healthcare 8881202322 | Monoject aluminum hub blunt needles, 16Gx, 1.6mmx38.1mm: for amniotic catheters |
References
- Barry, J. S., Anthony, R. V. The pregnant sheep as a model for human pregnancy. Theriogenology. 69, 55-67 (2008).
- Morrison, J. L. Sheep models of intrauterine growth restriction: fetal adaptations and consequences. Clin Exp Pharmacol Physiol. 35, 730-743 (2008).
- Rees, S., Inder, T. Fetal and neonatal origins of altered brain development. Early Hum Dev. 81, 753-761 (2005).
- Rees, S., Harding, R., Walker, D. The biological basis of injury and neuroprotection in the fetal and neonatal brain. Int J Dev Neurosci. 29, 551-563 (2011).
- Moisiadis, V. G., Matthews, S. G. Glucocorticoids and fetal programming part 1: Outcomes. Nat rev Endocrinol. 10, 391-402 (2014).
- Wang, X., Rousset, C. I., Hagberg, H., Mallard, C. Lipopolysaccharide-induced inflammation and perinatal brain injury. Semin Fetal Neonatal Med. 11, 343-353 (2006).
- Gotsch, F., et al. The fetal inflammatory response syndrome. Clin Exp Obstet Gynecol. 50, 652-683 (2007).
- Svedin, P., Kjellmer, I., Welin, A. K., Blad, S., Mallard, C. Maturational effects of lipopolysaccharide on white-matter injury in fetal sheep. J child neurol. 20, 960-964 (2005).
- Nitsos, I., et al. Chronic exposure to intra-amniotic lipopolysaccharide affects the ovine fetal brain. J Soc Gynecol Investig. 13, 239-247 (2006).
- Yan, E., Castillo-Melendez, M., Nicholls, T., Hirst, J., Walker, D. Cerebrovascular responses in the fetal sheep brain to low-dose endotoxin. Pedia res. 55, 855-863 (2004).
- Dean, J. M., et al. Delayed cortical impairment following lipopolysaccharide exposure in preterm fetal sheep. Ann Neurol. 70, 846-856 (2011).
- Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Hum Dev. 3 (1), 79-83 (1979).
- Liggins, G. C. Premature parturition after infusion of corticotrophin or cortisol into foetal lambs. J Endocrinol. 42, 323-329 (1968).
- Liggins, G. C. Premature delivery of foetal lambs infused with glucocorticoids. J Endocrinol. 45, 515-523 (1969).
- Liggins, G. C., Fairclough, R. J., Grieves, S. A., Kendall, J. Z., Knox, B. S. The mechanism of initiation of parturition in the ewe. Recent Prog Horm Res. 29, 111-159 (1973).
- Morrison, J. L. Sheep models of intrauterine growth restriction: fetal adaptations and consequences. Clin Exp Pharmacol Physiol. 35, 730-743 (2008).
- Robinson, J. S., Hart, I. C., Kingston, E. J., Jones, C. T., Thorburn, G. D. Studies on the growth of the fetal sheep. The effects of reduction of placental size on hormone concentration in fetal plasma. J Dev Physiol. 2, 239-248 (1980).
- Carmel, E., et al. Fetal brain MRI - experiences in the ovine model of cerebral inflammatory response. Repro sci. 19 (3), 347A-348A (2012).
- Samson, N., Dumont, S., Specq, M. L., Praud, J. P. Radio telemetry devices to monitor breathing in non-sedated animals. Respir Physiol Neurobiol. 179, 111-118 (2011).
- Thakor, A. S., Giussani, D. A. Effects of acute acidemia on the fetal cardiovascular defense to acute hypoxemia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 296, R90-R99 (2009).
- Green, L. R., Kawagoe, Y., Homan, J., White, S. E., Richardson, B. S. Adaptation of cardiovascular responses to repetitive umbilical cord occlusion in the late gestation ovine fetus. J Physiol. 535, 879-888 (2001).
- Unno, N., et al. Changes in adrenocorticotropin and cortisol responsiveness after repeated partial umbilical cord occlusions in the late gestation ovine fetus. Endocrinology. 138, 259-263 (1997).
- Muller, T., et al. Developmental changes in cerebral autoregulatory capacity in the fetal sheep parietal cortex. J Physiol. 539, 957-967 (2002).
- Keen, A. E., Frasch, M. G., Sheehan, M. A., Matushewski, B., Richardson, B. S. Maturational changes and effects of chronic hypoxemia on electrocortical activity in the ovine fetus. Brain Res. 1402, 38-45 (2011).
- Ross, M. G., et al. Correlation of arterial fetal base deficit and lactate changes with severity of variable heart rate decelerations in the near-term ovine fetus. Am J Obstet Gynecol. 208, e281-e286 (2013).
- Gunn, A. J., Gunn, T. R., de Haan, H. H., Williams, C. E., Gluckman, P. D. Dramatic neuronal rescue with prolonged selective head cooling after ischemia in fetal lambs. J Clin Invest. 99, 248-256 (1997).
- Xu, A., Piorkowska, K., Matushewski, B., Hammond, R., Richardson, B. S. Adaptive Brain Shut-Down Counteracts Neuroinflammation in the Near-Term Ovine Fetus. 60th Meeting of the Society for Gynecologic Investigation, 20 (3), Reproductive Sci. 222A (2013).
- Derks, J. B., et al. A comparative study of cardiovascular, endocrine and behavioural effects of betamethasone and dexamethasone administration to fetal sheep. J Physiol Lond. 499, 217-226 (1997).
- Lohle, M., et al. Betamethasone effects on fetal sheep cerebral blood flow are not dependent on maturation of cerebrovascular system and pituitary-adrenal axis. J Physiol. 564, 575-588 (2005).
- Morrison, J. L., et al. Maternal fluoxetine infusion does not alter fetal endocrine and biophysical circadian rhythms in pregnant sheep. J Soc Gynecol Investig. 12, 356-364 (2005).
- Allison, B. J., et al. Ventilation of the very immature lung in utero induces injury and BPD-like changes in lung structure in fetal sheep. Pediatr Res. 64, 387-392 (2008).
- Rozance, P. J., et al. Intrauterine growth restriction decreases pulmonary alveolar and vessel growth and causes pulmonary artery endothelial cell dysfunction in vitro in fetal sheep. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301, L860-L871 (2011).
- Fowden, A. L., Giussani, D. A., Forhead, A. J. Endocrine and metabolic programming during intrauterine development. Early hum dev. 81, 723-734 (2005).
- Nathanielsz, P. W., Hanson, M. A. The fetal dilemma: spare the brain and spoil the liver. J Physiol. 548, 333 (2003).
- Manikkam, M., et al. Fetal programming: prenatal testosterone excess leads to fetal growth retardation and postnatal catch-up growth in sheep. Endocrinology. 145, 790-798 (2004).
- Savabieasfahani, M., et al. Fetal programming: testosterone exposure of the female sheep during midgestation disrupts the dynamics of its adult gonadotropin secretion during the periovulatory period. Biol Reprod. 72, 221-229 (2005).
- Bergen, N. H., et al. Fetal programming alters reactive oxygen species production in sheep cardiac mitochondria. Clin Sci (Lond). 116, 659-668 (2009).
- Cox, L. A., et al. A genome resource to address mechanisms of developmental programming: determination of the fetal sheep heart transcriptome. J Physiol. 590, 2873-2884 (2012).
- Mahoney, M. M., Padmanabhan, V. Developmental programming: impact of fetal exposure to endocrine-disrupting chemicals on gonadotropin-releasing hormone and estrogen receptor mRNA in sheep hypothalamus. Toxicol Appl Pharmacol. 247, 98-104 (2010).
- Blad, S., Welin, A. K., Kjellmer, I., Rosen, K. G., Mallard, C. ECG and Heart Rate Variability Changes in Preterm and Near-Term Fetal Lamb Following LPS Exposure. Reprod Sci. 15, 572-583 (2008).
- Frasch, M. G., et al. Heart rate variability analysis allows early asphyxia detection in ovine fetus. Reprod Sci. 16, 509-517 (2009).
- Frasch, M. G., Keen, A. E., Gagnon, R., Ross, M. G., Richardson, B. S. Monitoring fetal electrocortical activity during labour for predicting worsening acidemia: a prospective study in the ovine fetus near term. PLoS One. 6, e22100 (2011).
- Durosier, L. D., et al. Sampling rate of heart rate variability impacts the ability to detect acidemia in ovine fetuses near-term. Front pedia. 2, 38 (2014).
- Danielson, L., McMillen, I. C., Dyer, J. L., Morrison, J. L. Restriction of placental growth results in greater hypotensive response to alpha-adrenergic blockade in fetal sheep during late gestation. J Physiol. 563, 611-620 (2005).
- Edwards, L. J., Simonetta, G., Owens, J. A., Robinson, J. S., McMillen, I. C. Restriction of placental and fetal growth in sheep alters fetal blood pressure responses to angiotensin II and captopril. J Physiol. 515 (Pt 3), 897-904 (1999).
- Xu, A., et al. Adaptive brain shut-down counteracts neuroinflammation in the near-term ovine fetus. Front neurol. 5, 110 (2014).
- Xu, A., et al. The Ovine Fetal and Placental Inflammatory Response to Umbilical Cord Occlusions With Worsening Acidosis. Reprod Sci. 22 (11), (2015).
- Wang, X., Durosier, L. D., Ross, M. G., Richardson, B. S., Frasch, M. G. Online detection of fetal acidemia during labour by testing synchronization of EEG and heart rate: a prospective study in fetal sheep. PLoS One. 9, e108119 (2014).
- Reid, A., Malone, J. Q fever in Ireland A seroprevalence study of exposure to Coxiella burnettii among Department of Agriculture workers. Occ med. 54, 544-547 (2004).
- Roest, H. I., Bossers, A., van Zijderveld, F. G., Rebel, J. M. Clinical microbiology of Coxiella burnetii and relevant aspects for the diagnosis and control of the zoonotic disease Q fever. Vet quart. 33, 148-160 (2013).
- Neill, T. J., Sargeant, J. M., Poljak, Z. The effectiveness of Coxiella burnetii vaccines in occupationally exposed populations: a systematic review and meta-analysis. Zoonoses and public health. 61, 81-96 (2014).
- Roest, H. I., Bossers, A., Rebel, J. M. Q fever diagnosis and control in domestic ruminants. Dev biol. 135, 183-189 (2013).
- Frasch, M. G., et al. Fetal body weight and the development of the control of the cardiovascular system in fetal sheep. J physilo. 579, 893-907 (2007).
- Rurak, D., Bessette, N. W. Changes in fetal lamb arterial blood gas and acid-base status with advancing gestation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 304, R908-R916 (2013).
- Frasch, M. G., et al. Fetal body weight and the development of the control of the cardiovascular system in fetal sheep. J physiol. 579, 893-907 (2007).
- Frasch, M. G., et al. Measures of acidosis with repetitive umbilical cord occlusions leading to fetal asphyxia in the near-term ovine fetus. Am J Obstet Gynecol. 200, 200.e1-207.e1 (2009).
- The ESHRE Capri Workshop Group. Multiple gestation pregnancy. Hum reprod. 15, 1856-1864 (2000).
- Frasch, M. G. Re The perinatal development of arterial pressure in sheep: effects of low birth weight due to twinning. Reproductive sciences (Thousand Oaks, Calif.). 15, 863-865 (2008).
- Hancock, S. N., Oliver, M. H., McLean, C., Jaquiery, A. L., Bloomfield, F. H. Size at birth and adult fat mass in twin sheep are determined in early gestation. J Physiol. 590, 1273-1285 (2012).
- Wassink, G., Bennet, L., Davidson, J. O., Westgate, J. A., Gunn, A. J. Pre-existing hypoxia is associated with greater EEG suppression and early onset of evolving seizure activity during brief repeated asphyxia in near-term fetal sheep. PLoS One. 8, e73895 (2013).
- Mathai, S., et al. Acute on chronic exposure to endotoxin in preterm fetal sheep. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 304, R189-R197 (2013).
- Heuij, L. G., et al. Synergistic white matter protection with acute-on-chronic endotoxin and subsequent asphyxia in preterm fetal sheep. J neuroinflam. 11, 89 (2014).
- Gagnon, R., Challis, J., Johnston, L., Fraher, L. Fetal endocrine responses to chronic placental embolization in the late-gestation ovine fetus. Am J Obstet Gynecol. 170, 929-938 (1994).
- Miller, S. L., Supramaniam, V. G., Jenkin, G., Walker, D. W., Wallace, E. M. Cardiovascular responses to maternal betamethasone administration in the intrauterine growth-restricted ovine fetus. Am J Obstet Gynecol. 201, 613.e1-613.e8 (2009).
- Regnault, T. R., et al. The relationship between transplacental O2 diffusion and placental expression of PlGF, VEGF and their receptors in a placental insufficiency model of fetal growth restriction. J Physiol. 550, 641-656 (2003).
- Wallace, J. M., Aitken, R. P., Cheyne, M. A. Nutrient partitioning and fetal growth in rapidly growing adolescent ewes. J reprod and fertil. 107, 183-190 (1996).
- Rakers, F., et al. Effects of early- and late-gestational maternal stress and synthetic glucocorticoid on development of the fetal hypothalamus-pituitary-adrenal axis in sheep. Stress. 16, 122-129 (2013).
- Jiang, Y., et al. The sheep genome illuminates biology of the rumen and lipid metabolism. Science. 344, 1168-1173 (2014).
- Begum, G., et al. Epigenetic changes in fetal hypothalamic energy regulating pathways are associated with maternal undernutrition and twinning. FASEB J. 26, 1694-1703 (2012).
- Byrne, K., et al. Genomic architecture of histone 3 lysine 27 trimethylation during late ovine skeletal muscle development. Anim Genet. 45, 427-438 (2014).
- Lie, S., et al. Impact of embryo number and maternal undernutrition around the time of conception on insulin signaling and gluconeogenic factors and microRNAs in the liver of fetal sheep. Am J physiol Endocrinol. 306, E1013-E1024 (2014).
- Nicholas, L. M., et al. Differential effects of maternal obesity and weight loss in the periconceptional period on the epigenetic regulation of hepatic insulin-signaling pathways in the offspring. FASEB J. 27, 3786-3796 (2013).
- Wang, K. C., et al. Low birth weight activates the renin-angiotensin system, but limits cardiac angiogenesis in early postnatal life. Physiol rep. 3, (2015).
- Zhang, S., et al. Periconceptional undernutrition in normal and overweight ewes leads to increased adrenal growth and epigenetic changes in adrenal IGF2/H19 gene in offspring. FASEB J. 24, 2772-2782 (2010).
