Électrofilées nanofibres échafaudages avec des gradations dans l'organisation fibre

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour fabriquer des échafaudages électrofilé de nanofibres avec l'organisation graduée de fibres et d'explorer leurs applications dans la régulation de la morphologie des cellules / orientation. Dégradés en ce qui concerne les propriétés physiques et chimiques des échafaudages de nanofibres offrent une grande variété d'applications dans le domaine biomédical.

Résumé

L’objectif de ce protocole est de rapporter une méthode simple pour générer des échafaudages de nanofibres avec des gradations dans l’organisation des fibres et de tester leurs applications possibles dans le contrôle de la morphologie/orientation cellulaire. L’organisation des nanofibres est contrôlée à l’aide d’un nouvel appareil de fabrication qui permet de diminuer progressivement l’organisation des fibres dans un échafaudage. La modification de l’alignement des fibres est obtenue en diminuant le temps de dépôt de fibres électrofilées aléatoires sur un tapis de fibres aligné unilatéralement. En recouvrant le collecteur d’une barrière/masque mobile, le long du même axe que le dépôt de fibres, la structure organisationnelle est facilement contrôlée. À des fins d’ingénierie tissulaire, des cellules souches dérivées du tissu adipeux peuvent être ensemencées dans ces échafaudages. Les cellules souches subissent des changements morphologiques en raison de leur position sur la structure organisationnelle variée et peuvent potentiellement se différencier en différents types de cellules en fonction de leur emplacement. De plus, l’organisation graduée des fibres améliore le biomimétisme des échafaudages en nanofibres afin qu’ils ressemblent davantage aux orientations naturelles des nanofibres de collagène au site d’insertion tendon-os par rapport aux échafaudages traditionnels. Grâce à la nanoencapsulation, les fibres graduées offrent également la possibilité de construire des gradients chimiques dans des échafaudages de fibres, et renforcent ainsi davantage leurs applications potentielles dans le criblage rapide de l’interaction cellule-matériaux et la régénération des tissus interfaciaux. Cette technique permet de produire des échafaudages à gradient continu, mais elle peut également potentiellement produire des fibres en étapes discrètes en contrôlant le mouvement de la barrière/du masque en mouvement de manière discrète.

Introduction

Les nanofibres sont un utilitaire populaire pour l'ingénierie tissulaire en raison de leur capacité à imiter la matrice extracellulaire dans sa structure et ^une taille relative. Cependant, certaines interfaces tissulaires natives, telles que le site d'insertion du tendon-os, contiennent des fibres de collagène, qui présentent une structure organisationnelle variable qui augmente en direction de l'alignement des tendons et diminue au niveau du site de l'os ^2-5. Ainsi, pour la régénération tissulaire effective, il est nécessaire de fabriquer un échafaudage qui pourrait effectivement mimer la structure de ce gradient.

Auparavant, il a été effectué des recherches sur des changements graduels dans la composition des fibres, en particulier, la teneur en minéraux ^6. Cependant, recréant la composante structurelle des tissus conjonctifs reste largement inexploré. Une étude antérieure a examiné gradients morphologiques en étudiant l'effet de la densité des particules de silice de surface sur la prolifération des ostéoblastes de la voûte crânienne du rat et ont trouvé une inverSE relation entre la densité de particules de silice et la prolifération des cellules ^7. Mais les changements morphologiques médiation prolifération cellulaire dans des travaux antérieurs étaient principalement liés à la rugosité de surface manque la capacité en imitant fibres changements organisationnels ^7,8. Une étude récente a tenté de fabriquer un échafaudage qui imitait les orientations uniques de fibres de collagène en utilisant un roman collecteur pour électrofilage ^neuf. Bien que cette étude a réussi à produire un échafaudage avec des fibres à la fois alignés et aléatoires, il n'a pas réussi à imiter les changements graduels exposées dans les tissus natifs. Aussi, dans la production de composants séparés, avec un changement immédiat de alignée sur l'orientation aléatoire, les propriétés biomécaniques de cette échafaudage diminué de manière significative. Aucun travail précédente a été en mesure de produire des échafaudages de nanofibres applicables avec des gradations continus dans des orientations de fibres de alignés et aléatoire. Notre étude récente a montré loisirs succès des échafaudages de nanofibresavec des gradations dans l'organisation de fibres qui peuvent potentiellement imiter l'organisation de collagène natif au tendon-os insertion ^10. Ce travail vise à présenter les protocoles utilisés pour la production d'échafaudages de nanofibres avec une structure qui ressemble étroitement à celui de l'organisation de la fibre dans l'interface native tendon-os tissus.

Structures de nanofibres gradient ont potentiellement des applications dans une variété de domaines de grande envergure. Nous nous sommes concentrés sur les applications à l'ingénierie tissulaire du site d'insertion du tendon-os en combinant nos échafaudages avec des cellules souches du tissu adipeux (ADSCs) qui sont déjà utilisés pour la régénération tissulaire sur divers substrats ^11-14. En outre, ADSCs sont très similaires dans la nature à des cellules souches de moelle osseuse en termes de ressources et de leur multipotence est abondante qui peut être récolté en utilisant un simple ^15,16 procédure de liposuccion. Ensemencement ces cellules aux échafaudages de nanofibres dégradés améliore encore leur tispoursuivre applications d'ingénierie en permettant la distribution contrôlée des cellules qui peuvent potentiellement se différencier en divers tissus. En plus de l'ensemencement des cellules souches, des nanofibres peuvent être encapsulés avec des molécules de signalisation pour la régulation de la réponse cellulaire. Couplage nanoencapsulation avec le gradient d'organisation de ces échafaudages permet l'étude du comportement cellulaire ou dessins et revêtements implants possibles. L'encapsulation des molécules fonctionnelles telles que la protéine morphogénétique osseuse 2 (BMP2), qui a été montré pour induire la différenciation ostéoblastique ^15,16, permettrait d'améliorer encore les applications d'ingénierie tissulaire de ces échafaudages ^10.

Protocole

1. Préparation de la solution

1. Préparer une solution de poly (ε-caprolactone) (PCL) _(Mw = 80 000 g / mol) à une concentration approximative de 100 mg / ml. Dissoudre PCL dans un mélange de dichlorométhane (DCM) et de N, N-dimethlyformamide (DMF) dans un rapport de 4: 1 (v / v) à une concentration de 10% (p / v).
2. Placer la solution dans un tube en verre de 20 ml pour le mélange. Placez le tube de verre dans nettoyeur à ultrasons pendant 30 minutes, ou jusqu'à ce que la solution est translucide.

2. Appareil Préparation

1. Ajouter la solution PCL préparé dans une seringue de 5 ml avec une aiguille émoussée de calibre 21 fixée.
2. Passer pompe de seringue dans une position verticale d'électrofilage, selon la figure 1.
3. Utilisez un collecteur en acier inoxydable avec espace un espace ouvert de 2 cm x 5 cm pour le substrat de fibres alignées. Placez le collecteur 12 cm de la pointe de l'aiguille.
4. Branchez le courant continu (CC) haute tension alimentation duaiguille et la terre le collecteur. Assurez-vous que le collecteur est relié à la terre individuellement avec aucun contact à l'autre équipement de laboratoire.

3. Électrofilage

1. Set pompe seringue à 1,50 ml / h, jusqu'à ce que les gouttelettes formant à la pointe de l'aiguille sont immédiatement remplacés lorsqu'ils sont retirés. Ensuite, définissez le débit à 0,50 ml / h.
2. Tourner l'opérateur de tension à 12 kV.
3. Electrospin jusqu'à ce que les fibres uniaxialement alignés couvrir complètement le fossé sur le collecteur.
4. Appliquer la colle sur les bords d'une plaquette de verre et transférer les fibres à partir du collecteur de l'écart de la plaque de verre. Placer la plaque de verre sur le dessus d'un morceau de feuille d'aluminium qui a la même taille que la plaque de verre et est mis à la terre.
5. Placer le second capteur de seringue selon la figure 3.
6. Fixez le masque en plastique à la deuxième pompe de la seringue et le positionner 2 mm au-dessus du collecteur.
7. Ajouter Coumarine 6 à 1% (p / p) à la solution PCL-si nanoencapsulation est desired- et mélanger jusqu'à ce que la solution est translucide.
8. Chargez le PCL ou PCL / coumarine 6 solution dans une aiguille de 5 ml avec une aiguille de calibre 21 émoussée. Réglez pompe verticale à 0,50 ml / h et horizontale pour tirer à 9 ml / h ou à une vitesse approximative de 1 mm / min.
9. Electrospin jusqu'à ce que le masque est déplacé presque complètement hors du collecteur, mais avec la zone de bordure encore sous le masque.

4. Caractérisation de la fibre

1. Placer les échantillons avec du ruban adhésif double-face conductrice à la tige métallique et couche de platine pendant 40 secondes en utilisant une coucheuse par pulvérisation à 40 mA.
   1. Examiner les fibres à travers un microscope électronique à balayage (MEB) après nos études antérieures ^17,18.
   2. Recueillir des images à une tension d'accélération de 15 kV.
2. Effectuer transformée de Fourier (FFT) une analyse rapide sur un échantillon de fibre distincte pour mesurer l'alignement des fibres. Les informations détaillées sur l'alignement des fibres de mesure par FFT peut se référer to études antérieures ^19,20.

5. Les cellules souches semis.

1. Stériliser les échantillons de fibres par immersion dans une solution d'éthanol à 70% pendant 2 heures. Puis laver les fibres avec de l'eau distillée pour enlever les contaminants.
2. Obtenir ADSCs humaines et des cellules en culture dans un ² flacon de 25 cm à 37 ° C dans une atmosphère de 95% d'air / 5% de CO _2. Changer le milieu de culture de cellules tous les deux jours ^10.
3. Trypsiniser les cellules et de compter le nombre de cellules. Plus précisément, enlever tout milieu de culture à partir de la fiole de culture de cellules et laver les cellules avec une solution saline tamponnée phosphate (PBS) deux fois. Ensuite, ajouter 1 m ^l d'une solution à 0,25% de trypsine-EDTA (pré-chaud dans un bain d'eau à 37 ° C) pour couvrir la monocouche cellulaire et on incube le flacon dans l'incubateur de culture cellulaire pendant 2-3 minutes. Ajouter 4 ml de milieu de culture et laver toutes les cellules de la surface par pipetage du milieu sur toute la surface. E Centrifuger la suspension cellulaire et re-disperséee culot cellulaire dans le milieu de culture. Compter les cellules via hématimètre. Seed environ 1 × 10 ⁴ cellules à l'échafaud de nanofibres placé dans une boîte de -culture 35 mm et incuber pendant 3 et 7 jours.
4. cellules tache en utilisant diacétate de fluorescéine (5 mg / ml dans l'acétone) (FDA), puis l'image les échantillons en utilisant un microscope à fluorescence. Plus précisément, ajouter 100 ul de solution de la FDA pour la boîte de culture et incuber pendant 30 min. Laver les cellules avec PBS trois fois avant de l'imagerie de fluorescence. Analyser l'orientation de la cellule par un programme mat-lab personnalisée basée sur nos études précédentes ^10.

Résultats

En utilisant ce protocole, un tapis de fibre à gradient d'organisation a été formé. La figure 3 montre les images MEB prises à divers endroits sur l'échafaud de nanofibres. Sur le plan qualitatif, on peut déterminer qu'il existe une progression des fibres alignées de manière uniaxiale à 0 mm (figure 3A) à un assortiment aléatoire des fibres à 6 mm (figure 3D). La FFT donne une valeur quantitative à l'alignement des fibres, des détails sur les processus q...

Discussion

La partie la plus critique du protocole est la génération de l’échafaudage de gradient. Il est impératif que le masque recouvrant le collecteur se déplace à une vitesse constante afin qu’il y ait un changement progressif à l’intérieur de l’échafaudage de fibres. La préparation correcte de la solution PCL est également importante pour assurer le succès de l’électrofilage. Il est recommandé de vérifier la morphologie de la fibre avant l’électrofilage, en particulier après l’encapsulation de la coumarine-6, qui peut nécessi...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Diméthlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichlorométhane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarine 6	Sigma-Aldrich	546283
Cellules souches dérivées du tissu adipeux	Technologies d’ingénierie cellulaire	HMSC. AD-100
Fetal Bovine	Serum Life Technologies	26140-111
Diacétate de fluorescéine	Sigma-Aldrich	F7378
Éthanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsine-EDTA	Invitrogen	25300-054
&alpha ;-Medium modifié Eagle’s Medium	Invitrogen	A10490-01
Acétone	Fisher Scientific	s25120a
Tamponné au phosphate Saline	Invitrogen	10010023
Lames de verre	VWR international, LLC	101412-842
Pousse-seringue	Fisher Scientific	14-831-200	Seringue unique
Nettoyeur à ultrasons	Branson	1510
Alimentation	CC haute tensionGamma High Voltage Research	Microscope électronique à balayage ES30
	FEI	Nova 2300
	Zeiss	Axio Imager 2

Microscope à fluorescence