Abstract
أصبحت الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان المستمدة من الخلايا العضلية (hiPSC-CMS) مصدر خلية المهم معالجة نقص العضلية الأولية المتاحة للبحث ومتعدية التطبيقات الأساسية. التفريق hiPSCs إلى العضلية، تم وضع بروتوكولات مختلفة بما في ذلك الجسم مضغي الشكل (EB) التمايز المستندة إلى وعامل النمو الاستقراء. ومع ذلك، هذه البروتوكولات غير فعالة ومتغيرة بشكل كبير في قدرتها على توليد العضلية المنقى. مؤخرا، تبين وجود بروتوكول استخدام التشكيل القائم على جزيء صغير من WNT / β-كاتينين إشارات لتعزيز التمايز القلب مع كفاءة عالية. مع هذا البروتوكول، وكانت أكبر من 50٪ -60٪ من الخلايا التمييزية، لوحظت العضلية-تروبونين إيجابي القلب باستمرار. لزيادة cardiomyocyte النقاء، وتعرض خلايا متباينة إلى جلوكوز للقضاء على الجوع على وجه التحديد غير العضلية على أساس الفرق الأيضالصورة بين العضلية وغير العضلية. باستخدام هذه الاستراتيجية الاختيار، وحصلنا على الدوام زيادة أكبر من 30٪ في نسبة العضلية لغير العضلية في عدد سكانها خلايا متمايزة. وينبغي لهذه العضلية العالية النقاء تعزيز موثوقية النتائج من الإنسان المستندة إلى IPSC في دراسات النمذجة المرض في المختبر والمقايسات فحص المخدرات.
Introduction
العضلية الإنسان الأساسية ويصعب الحصول على بسبب اشتراط الخزعات القلب الغازية، وصعوبة في النأي إلى الخلايا واحدة، وبسبب بقاء الخلية الفقراء على المدى الطويل في الثقافة. ونظرا لهذا النقص في العضلية الإنسان الأساسية، من صنع الإنسان الجذعية المحفزة المشتقة من خلية cardiomyocyte المريض محددة وقد اعتبر (hiPSC-CM) التكنولوجيا كمصدر cardiomyocyte بديل قوي للبحوث الأساسية فضلا عن التطبيقات السريرية ومتعدية مثل النمذجة المرض والمخدرات اكتشاف 1. الجهود المبكرة في تمييز الخلايا الجذعية المحفزة إلى العضلية المستخدمة بروتوكولات التمايز باستخدام الهيئات مضغي الشكل (EBS)، ولكن هذه الطريقة غير فعالة في إنتاج العضلية لأنه في كثير من الأحيان أقل من 25٪ من الخلايا في EB والضرب العضلية 2،3. نسبيا، وبروتوكول التمايز القائم على أحادي الطبقة باستخدام السيتوكينات activin ألف وBMP4 عرض كفاءة أعلى من EBS، ولكنهذا البروتوكول لا يزال غير فعالة نسبيا، ويتطلب عوامل النمو مكلفة، والوظائف الوحيدة في عدد محدود من المحفزة الإنسان خطوط الخلايا الجذعية 4. مؤخرا، تم تطوير كفاءة عالية، ومقرها أحادي الطبقة-hiPSC بروتوكول cardiomyocyte التمايز عن طريق تحوير WNT / β-كاتينين يشير 5. هذه hiPSC للتدابير المضادة التعبير عن القلب تروبونين T وألفا actinin، اثنين من البروتينات الساركومير التي هي علامات قياسية من 6 العضلية. بروتوكول يصف هنا هو تطويع هذا صغير القائم على جزيء، تغذية خالية من الخلايا، أحادي الطبقة التمايز طريقة 5،7. ونحن قادرون على الحصول على الضرب العضلية من hiPSCs بعد 7-10 أيام (الشكل 1). ومع ذلك، بعد تمايز cardiomyocyte مما أسفر عن 50٪ تضرب الخلايا، المناعية باستمرار يدل على وجود سكان غير العضلية التي هي سلبية للعلامات cardiomyocyte محددة مثل القلب محددة تروبونين T وألفا actinin. لفوrther تنقية العضلية والقضاء غير العضلية، وتعرض السكان الخلية متباينة غير متجانسة إلى جلوكوز الجوع من خلال معاملتهم مع منخفضة للغاية مستنبت الجلوكوز لأيام متعددة (الشكل 2). هذا العلاج يزيل بشكل انتقائي غير العضلية، نظرا لقدرة العضلية، ولكن ليس غير العضلية، على استقلاب اللاكتات كمصدر أولي للطاقة من أجل البقاء على قيد الحياة في بيئة منخفضة الجلوكوز 8. بعد هذه الخطوة تنقية، لوحظ زيادة 40٪ في نسبة العضلية لغير العضلية، (الشكل 3، الشكل 4) وهذه الخلايا يمكن استخدامها لالمصب تحليل التعبير الجيني، والنمذجة المرض، والمقايسات فحص المخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم إدراج المعلومات البائع لجميع الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1 و قائمة المواد. ويجب على جميع الحلول والمعدات ملامسة خلايا تكون عقيمة، وينبغي استخدام تقنية العقيم وفقا لذلك. أداء جميع حضانات الثقافة في ترطيب 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 حاضنة ما لم ينص على خلاف ذلك. في هذا البروتوكول، ويتم تنفيذ جميع التفرقة في 6 لوحات جيدا، الذي hiPSCs هم المصنف. وبعد التمايز وتنقية، والخلايا يمكن فصلها وreplated للاستخدام المصب.
1. إعداد المتوسطة
- على المدى المتوسط E8، وجعل حل الأسهم لكل مكون المتوسط (NaHCO 3، حمض الأسكوربيك L-2-الفوسفات، سيلينيت الصوديوم، ترانسفيرين، الانسولين، FGF2، TGFB1) وتخزين الحلول في -20 ° C. إضافة كمية مناسبة من الحلول الأسهم إلى زجاجة من DMEM / F12 وتصفية لتعقيم. وconcentr الحلأوجه والإعداد رد فعل لمكونات الأسهم وE8 المتوسطة يمكن العثور عليها في الجدول 1.
- من أجل حل المصفوفة خارج الخلية، ذوبان الجليد مصفوفة الغشاء القاعدي (مرفق عادة في 10 ملغ / مل) في 4 درجات CO / N. ويستخدم Matrigel عادة لزراعة الخلايا الجذعية المحفزة لأن الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان يمكن أن تنضم أيضا إلى هذه المواد باستخدام ألفا-6-بيتا-1 إنتغرين 9. إذابة مرة واحدة، وجعل 2.25 ملغ (250 ميكرولتر) مأخوذة على الجليد باستخدام الثلج نصائح الماصة الباردة والأنابيب وتخزين aliquots في -80 ° C.
- عندما precoating لوحات مع ECMS، ذوبان الجليد وقسامة الحل المصفوفة خارج الخلية (ECMS) على الجليد. خلط ECMS والجليد الباردة المتوسطة DMEM / F12 في نسبة 1: 200 على الجليد. تبقي باردة لمنع سابق لأوانه ECMS التصلب.
- لRPMI / B27 دون الانسولين المتوسطة، إضافة 10 مل من B27 الناقص الأنسولين إلى 500 مل من وسائل الاعلام RPMI.
- لRPMI / B27 (مع الأنسولين) المتوسطة، إضافة 10 مل من الملحق B27 (مع insuliن) و 5 مل من المضادات الحيوية القلم بكتيريا في 500 مل من وسائل الاعلام RPMI.
- على المدى المتوسط الجلوكوز منخفضة، إضافة 10 مل من الملحق B27 و 5 مل من المضادات الحيوية القلم بكتيريا في 500 مل من خالية من السكر في وسائل الإعلام RPMI.
- لتجميد / الحفظ بالتبريد المتوسطة، مزيج المصل البقري الجنين معا مع dimethylsulfoxide (DMSO) في 9: 1 نسبة. ويمكن تخزين المتوسطة تجميد ما يصل إلى 1 في الشهر في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يجب أن تتم تصفيته جميع وسائل الإعلام وتخزينها في 4 درجات مئوية، وتستخدم في حدود 2 أسابيع ما لم ينص على خلاف ذلك. والمقصود كافة وحدات التخزين كاشف / حل المستخدمة أدناه للحصول على بئر واحد في لوحة 6 جيدا، ما لم ينص على خلاف ذلك.
2. قبل طلاء لوحات 6 بشكل جيد مع ECMS
- جعل ECMS عن طريق خلط الطابق السفلي مصفوفة غشاء (على سبيل المثال، Matrigel) مع وسائل الاعلام DMEM / F12 الجليد الباردة في نسبة 1: 200، ثم تطبيق 2 مل من تقدم طازجة ECMS إلى كل بئر لوحة 6 جيدا. كل بئر في لوحة 6 جيدا سوف تتلقى ما يقرب من 90 ملغ ECMS.
- احتضان ECMS المغلفة لوحات لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. مباشرة قبل خلايا الطلاء، نضح DMEM / F12 حل من كل بئر. سوف يكون لوحات ثم على استعداد لاستقبال الخلايا.
3. ذوبان في hiPSCs المجمدة
ملاحظة: نتابع عن كثب هذا الإجراء لأنه قد يؤدي إلى زراعة الأمثل والتمايز المصب من hiPSCs إلى hiPSC للتدابير المضادة بعد دورة تجميد / الذوبان.
- ذوبان الجليد قارورة واحدة من hiPSCs لكل بئر من لوحة 6 جيدا. إعداد 15 مل أنبوب مخروطي مع 9 مل من البرد المتوسطة E8 مع مثبط ROCK (10 ميكرومتر) لكل قنينة. ROCK المانع يحسن البقاء على قيد الحياة hiPSCs التالية الحفظ بالتبريد 10. حافظ على قارورة في 37 ° C حمام الماء لإذابة الخلايا حتى يتم تركت ما يقرب من 5 مم الكريستال الجليد.
- رش السطح الخارجي للقارورة مع 70٪ من الإيثانول. مسح قارورة مع المناديل الورقية قبل نقلها إلى الصفحي غطاء العقيمة.
- نقل الخلايا في أنبوب مخروطي استعداد. شطف رانه قارورة مرة واحدة مع 500 ميكرولتر من E8 المتوسطة ونقل متوسطة تحتوي على خلايا إذابة إلى نفس أنبوب مخروطي الشكل. الطرد المركزي في RT لمدة 4 دقائق في 200 × ز.
- نضح طاف بعد الطرد المركزي و resuspend بلطف بيليه الخلية مع 2 مل من E8 المتوسطة مع مثبط ROCK (10 ميكرومتر). نقل الخلايا معلق في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا قبل المغلفة مع ECMS.
- استبدال المتوسطة مع E8 وسيط وبدون ROCK المانع بعد 24 ساعة من زراعة. خلايا يجب انضمت قبل هذا الوقت.
4. الركض من hiPSCs
- عادة، hiPSCs مرور بعد أن بلغ 75٪ -80٪ confluency في لوحة 6 جيدا. نضح مستنبت. يغسل بسرعة الآبار مع 1 مل من عقيم، RT PBS. نضح PBS.
- إضافة 500 ميكرولتر من 0.5 ملي EDTA أو خلية 1X مفرزة الحل (على سبيل المثال، Accutase) واحتضان لمدة 1-7 دقيقة في RT. الوقت المناسب لEDTA الحضانة يختلف مع خط hiPSC. نتوقع أن نرى مرئية الشباك سص سماكة من المستعمرات حول حواف، كما سيؤدي ذلك إلى أن EDTA أو انفصال الخلايا الحل هو على استعداد لإزالتها.
- نضح EDTA أو الحل مفرزة الخلية. إضافة 1 مل من E8 المتوسطة تستكمل مع 10 ميكرومتر ROCK المانع. تهجير المستعمرات hiPSC في البئر من قبل pipetting مرارا صعودا وهبوطا والرش المستعمرات قبالة مع ماصة P1000. يجب كسر المستعمرات في 5-10 كتل الخلايا بعد الانتهاء.
- نقل المستعمرات التي علقت في 1 مل من E8 المتوسطة مع ROCK المانع إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- تعطيل كتل الخلايا الكبيرة إلى كتل صغيرة في الوسط E8. إضافة حجم مناسب من E8 وسائل الإعلام مع المانع لتعليق خلية لتمييع الخلايا. حجم وسائل الإعلام إضافة للتخفيف يعتمد على كثافة الخلية وعدد من الآبار ليكون المصنف. من الناحية المثالية، واحد، و 80٪ متموجة جيدا hiPSCs يجب تخفيفه 01:12.
- إضافة 11 مل E8 المتوسطة مع ROCK المانع للمل 1 الحالية للمالحل ليرة لبنانية في المذكور 15 مل أنبوب مخروطي للحصول على تخفيف 01:12.
- وعلاوة على ذلك يسحن كتل الخلايا إلى أجزاء زنزانة صغيرة (حوالي 50-200 الخلايا في كل جزء هو أفضل). تجنب الإفراط في الطحن لأن هذا يقلل من بقاء الخلية.
- نضح ECMS من لوحات المغلفة مسبقا وإضافة 2 مل من الخلايا معلق في كل بئر. ما يقرب من 100،000 الخلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا مثالية. تهدف إلى الاستغناء الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء البئر لتجنب تجميع الخلايا في وسط البئر.
- بعد 24 ساعة من زراعة، استبدل المتوسطة مع E8 وسيط وبدون ROCK المانع. تغيير ثقافة المتوسط كل 24 ساعة حتى تصبح الخلايا 80٪ متموجة. ثم، فإن الخلايا جاهزة للمرور مرة أخرى. وعادة ما يستغرق 3-6 أيام بين الممرات لتصل إلى 80٪ confluency.
5. hiPSCs التجميد
ملاحظة: نتابع عن كثب هذا الإجراء لأنه قد يؤدي إلى زراعة الأمثل والتمايز المصب من الوركاللجان الدائمة في hiPSC للتدابير المضادة بعد دورة تجميد / الذوبان.
- تسمية أنابيب المبردة مع اسم خط الخلية، نوع من الخلايا، عدد مرور، وتاريخ التجميد. كمبدأ عام، استخدم قنينة واحدة لكل بئر من لوحة 6 جيدا. إعداد 15 مل أنبوب مخروطي الشكل مليئة 9 مل من E8 المتوسطة مع مثبط ROCK (10 ميكرومتر). إعداد تجميد المتوسطة مع 90٪ و 10٪ FBS DMSO، والحفاظ على المتوسط في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
- نضح في وسائل الإعلام والثقافة، وإضافة 500 ميكرولتر من 0.5 ملي EDTA أو 1X خلية حل مفرزة واحتضان لمدة 2-7 دقيقة في RT. مدة التعرض EDTA أو انفصال الخلايا الحل تختلف من خط الخلية إلى خلية خط.
- نضح EDTA أو حل مفرزة الخلية. إضافة 1 مل من E8 المتوسطة.
- تهجير المستعمرات hiPSC في البئر من قبل pipetting صعودا وهبوطا والرش المستعمرات قبالة مع ماصة P1000. يجب أن لا يمكن كسرها المستعمرات إلى أصغر من 100 كتل الخلية. نقل الخلايا مع وقف التنفيذ لأنبوب مخروطي الشكل تحتوي على استعداد E8. الطرد المركزي في RT لمدة 4 دقائق في 200 × ز.
- نضح طاف وإضافة 500 ميكرولتر من المتوسط تجميد الباردة لبيليه. Resuspend وبيليه بواسطة pipetting 1-2 مرات. تم تحسين بقاء الخلية عن طريق الحفاظ على الخلايا في كتل كبيرة.
- نقل الخلايا معلق في أنبوب المبردة المسمى. بسرعة نقل قوارير في وعاء يحتوي على تجميد الأيزوبروبانول، والتي سوف تسمح للتبريد تدريجي. إبقاء الحاويات مع الخلايا في -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، ثم نقل الخلايا إلى النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.
6. القلب تمايز IPSC الإنسان
ملاحظة: يجب أن تكون جميع وسائل الإعلام على الأقل في RT عندما المضافة.
- بعد تفكك مع حل مفرزة EDTA أو 1X الخلية، والبذور حوالي 100،000 iPSCs الإنسان على ECMS المغلفة لوحات ثقافة 6 جيدا للتمايز (نفس الخطوات إجراءات الركض الخلية). وعندما تصل خلايا 85٪ confluency، تغيير المتوسط إلى RPMI / B27 دون الانسولين المتوسطة مع 6ميكرومتر GSK3 بيتا المانع CHIR99021 (CHIR) والحفاظ على لمدة 48 ساعة.
- بعد 48 ساعة، استبدال مستنبت CHIR التي تحتوي على مع RPMI / B27 دون الانسولين المتوسطة وترك وحده لمدة 24 ساعة (حتى يوم 3).
- في يوم 3، وتغيير وسائل الإعلام لRPMI / B27 دون الأنسولين مع 5 ميكرومتر WNT المانع IWR1 والحفاظ لمدة 48 ساعة (حتى يوم 5).
ويمكن أيضا أن تكون محاولة WNT تثبيط باستخدام مركبات جزيء الصغيرة الأخرى، كما هو موضح في الدراسات السابقة 11: ملاحظة. وقد تم اختيار IWR1 على جزيء صغير مثبطات WNT أخرى نظرا لزيادة النطاق الذي فقد تبين أن تكون فعالة في تثبيط إشارات Wnt 11. - في يوم 5، وتغيير المتوسطة إلى RPMI / B27 دون الانسولين المتوسطة ويترك لمدة 48 ساعة (حتى يوم 7).
- في يوم 7، استبدل المتوسطة مع RPMI / B27 المتوسطة (مع الأنسولين) واستبدال المتوسط كل 3 أيام بعد ذلك مع نفس المتوسطة. ينبغي أن يكون الضرب العفوي العضلية أولا مرئية في ما يقرب من يوم 8 إلى يوم10.
7. تنقية العضلية الإنسان من خلال التجويع الجلوكوز
- في يوم 10 بعد التمايز، تغيير المتوسطة في كل بئر من لوحة 6 جيدا إلى 2 مل المتوسطة انخفاض مستوى السكر والمحافظة على الخلايا في هذه الوسيلة لمدة 3 أيام (حتى يوم 13).
- في يوم 13، والعودة إلى خلايا RPMI / B27 المتوسطة (مع الأنسولين).
- اختياريا، replate العضلية قبل الجولة الثانية من المجاعة الجلوكوز للمساعدة في تخفيف غير العضلية-من لوحة الثقافة، والسماح لتفارق أسهل من غير العضلية أثناء المجاعة الجلوكوز.
- في يوم 13، نضح المتوسطة، ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، وفصل الخلايا إلى خلايا واحدة باستخدام 500 ميكرولتر من انزيم تفارق خلية لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. على وجه التحديد، وبعد 5 دقائق من العلاج الانزيم، واستخدام ماصة 1،000 ميكرولتر لفصل العضلية من لوحة 6 جيدا يدويا عن طريق سحب مرارا وتكرارا حتى انزيم تفارق الخلية والرش أنه ضد cardiomyocyte أحادي الطبقة. ما يصل إلى 30 التكرار pipetting لقد تكون هناك حاجة لفصل والعضلية في خلايا واحدة.
- بعد أن يتم فصل الخلايا وتكون في شكل وحيدة الخلية، وجمع كل الخلايا في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل مليئة 5 مل من RPMI / B27 المتوسطة مع الأنسولين لتخفيف من انزيم تفارق خلية وأجهزة الطرد المركزي لمدة 4 دقائق في 200 × ز. نضح وتجاهل طاف.
- اعادة تعليق الخلايا مع 2 مل RPMI / B27 المتوسطة وصفيحة على ECMS المغلفة لوحة 6 جيدا جديدة. عادة، confluency أعلى من العضلية يساعد على بقاء الخلايا خلال replating. تهدف إلى replate من 2 مليون خلية لكل جديد صحن 6 جيدا من أجل البقاء الأمثل خلال replating.
- في يوم 14، وتغيير المتوسطة إلى 2 مل من انخفاض الجلوكوز المتوسطة لدورة الحرمان الجلوكوز الثانية. ثقافة الخلايا في هذه الدولة الجلوكوز المنخفضة لمدة 3 أيام أخرى. ومعظم غير العضلية يموت في هذا الشرط الثقافة المنخفض الجلوكوز.
- في يوم 17، وتغيير المتوسطة إلى 2 مل من RPMI / B27 المتوسطة مع الأنسولين. الخلايا المتبقية ستكون العضلية العالية النقاء. هذه العضلية يمكن استخدامها لتحليل التعبير الجيني، وفحص المخدرات، وتحليل الأيض، ومختلف المقايسات المصب الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التغيرات المورفولوجية خلال hiPSC التمايز.
وhiPSC مثقف في لوحات خالية من تغذية نمت مسطحة كما، المستعمرات ثنائية الأبعاد. عند الوصول إلى نحو 85٪ confluency، تم علاج hiPSCs مع 6 ميكرومتر CHIR للتمايز (الشكل 1A). وقد لوحظت كميات كبيرة من موت الخلايا، وهي ظاهرة طبيعية ومشتركة، بعد 24 ساعة من العلاج CHIR. بعد يومين من العلاج CHIR، واصل hiPSCs للتمييز نحو مصير أرومية متوسطة. وبالمقارنة مع الخلايا في المستعمرات hiPSC، حجم الخلية لمدة 2 يوم خلايا هذه زيادة. زاد عدد الخلايا أيضا من خلال انقسام الخلية (الشكل 1B). في يوم 5، وجهت خلايا أرومية متوسطة باتجاه النسب القلب (الأديم المتوسط القلب). في هذا الوقت، تبدأ خلايا ائتلافه وتشكيل هياكل تشبه فرع مميزة (الشكل 1C). في يوم 10، وهياكل شبيهة فرع ضوحا للغاية، والعضلية نجومتيد الضرب بشكل عفوي (1D الشكل). سوف العضلية متباينة عضال، لا تتكاثر بعد هذه النقطة. ويرد الجدول الزمني للبروتوكول التمايز في الشكل 2.
تم تنقيته المناعية والتدفق الخلوي أظهرت النتائج العضلية مع المجاعة الجلوكوز.
بعد 10 يوما من التمايز، وأكثر من 50٪ من المناطق خلية والضرب. ومع ذلك، وصحائف خلية الضرب أحيانا تختلط أيضا مع غير العضلية. لدراسة cardiomyocyte النقاء، أهم ما يميز الخلايا المناعية ضد cardiomyocyte مع علامة القلب تروبونين-T (cTnT) لتجد أن معظم الخلايا كانت cTnT إيجابية. ومع ذلك، في السكان غير منقى من خلايا متباينة، كما يفتقر إلى عدد الخلايا التعبير عن cTnT، مما يشير إلى وجود غير العضلية في هذه الفئة من السكان متباينة في يوم 13 (الشكل 3A). ومع ذلك، مع المجاعة الجلوكوز،كانت الخلايا المتبقية تقريبا جميع cTnT الإيجابية في يوم 13 (الشكل 3B)، مما يدل على تنقية الناجحة للالعضلية التالية المجاعة الجلوكوز. وقد عززت هذه البيانات باستخدام مزيد من تحليل التدفق الخلوي. عدد سكانها خلايا متباينة في يوم 13 بعد التمايز يتضمن ما يقرب من 50٪ TNNT2 + الخلايا عندما لا الجلوكوز جوعا (الشكل 4A). وأجريت المفاضلة مواز أيضا ولكن مع الحرمان الجلوكوز لمدة 3 أيام ابتداء من يوم 10 بعد التمايز. في المقابل لتمايز unstarved، أدى الحرمان الجلوكوز إلى السكان النقى تحتوي على 90٪ TNNT2 + الخلايا في يوم 13 (الشكل 4B).
الشكل 1. التغيرات المورفولوجية متتابعة خلال hiPSC التمايز نحو النسب القلب. (A) hiPSCs مشوهفي اليوم 0 معرض مستعمرة نموذجية مورفولوجيا وصلت إلى نحو 85٪ confluency. (B) في يوم 2، والخلايا بعد العلاج مع CHIR لمدة يومين وصل إلى 100٪ confluency ودخل نسب أرومية متوسطة. (C) في يوم 5، والخلايا بعد العلاج مع IWR1 لمدة 2 أيام دخلت مرحلة الأديم المتوسط القلب. بدأت بعض الخلايا لصهر وتشكيل الأشكال التضاريسية مثل فرع المميزة (المشار إليها السهام). (D) في يوم 7-10، هياكل شبيهة فرع واضحة للغاية، والعضلية يبدأ الضرب من تلقاء أنفسهم. شريط = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الجدول الزمني للبروتوكول hiPSC-CM التمايز واللاحقة عملية التجويع الجلوكوز. الضرب العضلية ل إعادة عادة وحظ لأول مرة في حوالي 7-10 أيام. سوف جولتين من المجاعة الجلوكوز يؤدي إلى السكان المنقى من العضلية بعد يوم 17. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. المناعي يكشف تنقية العضلية التالية المجاعة الجلوكوز. (A) خلايا غير منقى بعد كانت ملطخة 13 يوما من التمايز مع القلب تروبونين T (cTnT). قد تختلف معظم الخلايا العضلية وكان في cTnT إيجابية، ولكن عددا من الخلايا غير القلب،-cTnT سلبي موجودة أيضا. (B) في المقابل، بعد المجاعة الجلوكوز لمدة 3 أيام ابتداء من يوم 10، وكلها تقريبا من الخلايا على قيد الحياة كانت cTnT إيجابية بعد يوم 13. مقياس شريط = 200 ميكرون.المرجع = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52628/52628fig3large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. تدفق يكشف الخلوي تنقية العضلية التالية المجاعة الجلوكوز. (A) بعد 13 يوما من التمايز في القلب بدون جوع الجلوكوز، يبلغ عدد سكانها خلايا عرضت نحو 50٪ TNNT2 + العضلية. يشير الأحمر السكان خلية متمايزة والأزرق يشير hiPSCs غير متمايزة كعنصر تحكم السلبية. (B) بعد 10 أيام من التمايز القلب وتليها 3 أيام من الموت جوعا الجلوكوز، تم تنقيته يبلغ عدد سكانها خلايا من نفس دفعة من التفرقة لاحتواء 90٪ TNNT2 + العضلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| التراكيب لE8 المتوسطة | |||
| E8 | حجم: 1 L | شركة | رقم الكتالوج |
| DMEM / F12 مع الجلوتامين وHEPES | 1،000 مل | إينفيتروجن | 11330-032 |
| NaHCO 3 (7.5٪، و 75 ملغ / مل) | 7.24 مل | إينفيتروجن | 25080-094 |
| حمض الأسكوربيك L-2-الفوسفات (64 ملغ / مل) | 1 مل | سيغما | A8960 |
| سيلينيت الصوديوم (70 ميكروغرام / مل) | 200 ميكرولتر | سيغما | S5261 |
| ترانسفيرين (50 ملغ / مل) | 214 ميكرولتر | سيغما | T3705 |
| الأنسولين (4 ملغ / مل) 5 مل | إينفيتروجن | 12585-014 | |
| FGF2 (200 نانوغرام / ميكرولتر) | 500 ميكرولتر | Peprotech | 100-18B |
| TGFB1 (100 نانوغرام / ميكرولتر) | 20 ميكرولتر | Peprotech | 100-21 |
| الحلول الأسهم للتركيبات E8 | |
| L-حمض الاسكوربيك-2-الفوسفات (64 ملغ / مل) | 3.2 غرام في 50 مل النقاوة المياه وتخزين 500 مكل في -20 ° C |
| ترانسفيرين (50 ملغ / مل) | 500 ملغ في 10 مل من الماء عالى النقاء وتخزين 107 مكل في -20 ° C |
| سيلينيت الصوديوم (70 ميكروغرام / مل) | 35 ملغ زيلونيت الصوديوم في 500 مل ماء عالى النقاء وتخزين 100 مكل في -20 ° C |
| FGF2 (200 نانوغرام / ميكرولتر) | 1 ملغ في 5 مل D- البردPBS، مخزن 250 مكل في -20 ° C |
| TGFB1 (100 نانوغرام / ميكرولتر) | 100 ميكروغرام في 1 مل الباردة 10 ملم حمض الستريك، ودرجة الحموضة 3، مخزن 10 مكل في -20 ° C |
الجدول 1. تكوين E8 متوسط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الحصول على كمية كبيرة من العضلية المستمدة hiPSC العالية النقاء أمر بالغ الأهمية للأبحاث القلب الأساسية فضلا عن التطبيقات السريرية ومتعدية. خضعت بروتوكولات التمايز القلب تحسينات هائلة في السنوات الأخيرة، والانتقال من الأساليب القائمة على الجسم مضغي الشكل باستخدام نمو قلبية عوامل 2، إلى matrix طرق شطيرة 12، وأخيرا إلى طرق صغيرة مقرها أحادي الطبقة-التضمين جزيء و5. من البروتوكولات المذكورة آنفا، وبروتوكول الموصوفة هنا عرض أعلى وأكثر استنساخه كفاءة التفريق القلب لمختلف خطوط الخلايا hiPSC عن طريق تحوير WNT / β-كاتينين الإشارات باستخدام جزيئات صغيرة CHIR وIWR 5،7. على وجه التحديد، وقد حثت لhiPSCs غير متمايز للخضوع أرومية متوسطة التمايز مع GSK3 بيتا المانع CHIR والتمايز القلب لاحق مع إشارات Wnt المانع IWR1. هذه خطوات متعاقبة منWNT إشارات التشكيل، وساعد على استنزاف الأنسولين خلال المرحلة النسب تحريض القلب، وأدى إلى تمايز القلب كفاءة عالية. CHIR هو شائع صغير مثبط جزيء GSK3 بيتا المستخدمة في أرومية متوسطة الاستقراء، ولكن تم اختبار جزيئات صغيرة أخرى لGSK3 بيتا تثبيط في بروتوكولات cardiomyocyte التمايز 11. وتستخدم أيضا خيارات متعددة لاحق جزيء صغير WNT المانع. على سبيل المثال، نشر مؤخرا تركز على التمايز محددة كيميائيا من الخلايا الجذعية المحفزة لالعضلية يستخدم 2 ميكرومتر WNT-C59 لفعالية تثبيط WNT والأديم المتوسط القلب تحريض 11.
وبالإضافة إلى ذلك، كانت العضلية متباينة مع طريقة التجويع الجلوكوز مزيد من النقاء، والذي يستفيد من الأيضية الجلوكوز متميزة تدفق القائمة بين العضلية وغير العضلية-8. ومن الضروري أن نلاحظ أن فعالية طريقة التجويع الجلوكوز هو Dتعتمد على ensity (أي التفرقة التي أسفرت عن نسب أعلى من العضلية هي أكثر احتمالا لتحقيق قدر أكبر من البقاء على قيد الحياة cardiomyocyte). ومع ذلك، فإن الانتقال إلى متوسطة منخفضة الغلوكوز هو أيضا حالة ضاغطة لالعضلية. من المهم تغيير الخلايا الى منتظم RPMI / B27 مع الانسولين المتوسطة بعد 3 أيام من الموت جوعا الجلوكوز. في هذا البروتوكول، تم استخدام نظام النمو خالية من وحدة التغذية، والتي الخلايا الجذعية المحفزة لم نمت على تغذية الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS). ومع ذلك، بروتوكولات التمايز القلب السابقة واستخدمت النظم القائمة على تغذية لإنتاج العضلية من الخلايا الجذعية المحفزة 5. وبالمثل، استخدمت البروتوكولات السابقة أيضا mTeSR1 المتوسطة للصيانة الخلايا الجذعية، لكن وسائل الإعلام وخالية من تغذية نظام E8 المستخدمة هنا هو الافضل نظرا لبساطته وعدم وجود مكونات xenogeneic الزائدة مثل ألبومين المصل البقري والخلايا الليفية الماوس الجنينية.
حاليا،المحفزة تمايز الخلايا الجذعية نحو الأنساب cardiomyocyte قوي إلى حد كبير، ولكن لا يزال يعاني من hiPSC تقلب الخط لخط من حيث الكفاءة. هذا لا يزال قضية رئيسية في مجال التمايز القلب، وسوف تحتاج إلى مزيد من الدراسة. تم تحسين كفاءة التفريق التي كتبها الصيانة السليمة للخطوط hiPSC، وعلى وجه الخصوص، ومنع overconfluency أثناء الصيانة hiPSC. ينشأ التغير إضافي من البذر الخلية خلال عملية الركض، باعتباره أحادي الطبقة المصنف بالتساوي من hiPSCs تميل إلى أن تؤدي إلى أفضل التفرقة الشاملة. هنا، واستخدم بنجاح المستمدة من الماوس، ECMS مقرها Matrigel لبذر خلية خلال زراعة الخلايا، ولكن في نهاية المطاف الانتقال إلى كره حرة ركائز يوصى. في ما يخص البذر الخلية على ECMS، بذر متفاوتة غالبا ما يؤدي إلى التوزيع غير المتكافئ للالعضلية داخل بئر معين. على سبيل المثال، إذا تم المصنف hiPSCs بشكل غير متساو، حواف بئر في لوحة ستة جيدا قد يؤدي إلى HIGأرقام لها من العضلية من مركز البئر. هذه الشروط البذر متفاوتة قد يؤدي إلى التفرقة منخفضة الكفاءة وعدد أكبر من غير cardiomyocyte، المشتقات أرومية متوسطة مثل الخلايا الليفية وخلايا العضلات الملساء. وقد لاحظنا أيضا أن التفرقة الكفاءة المنخفضة (أقل من 50٪) هي أكثر صعوبة لتنقية باستخدام عملية الحرمان الجلوكوز المذكورة هنا. آخر الآثار الجانبية المجاعة الجلوكوز على المدى الطويل هو خسارة محتملة في جدوى cardiomyocyte. على الرغم من أن العضلية قادرة على استقلاب اللاكتات في غياب الجلوكوز، نجد أن هذا التحول في بيئة منخفضة الجلوكوز هو مرهقة للخلايا. خلايا قد يتوقف من تلقاء أنفسهم الضرب، ويمكن ملاحظة بعض فقدان الخلية إذا طالت المجاعة الجلوكوز بعد الوقت الموصى بها. هذه الحساسية المحسنة للحرمان الجلوكوز قد يكون تعبيرا عن عدم النضج التنموي، وظيفية، والكهربية راسخة من الجذعية المشتقة من خلية cardiomyocyقسم التدريب والامتحانات بالمقارنة مع البالغين صحيح العضلية 13.
وباختصار، فإن بروتوكول الموصوفة هنا يجمع بين القائمة على الجزيء، hiPSC أحادي الطبقة طريقة التمايز القلب صغير مع cardiomyocyte تنقية طريقة التجويع الجلوكوز. هذا البروتوكول يسمح للجيل استنساخه من العضلية تنقية للغاية وينبغي أن تيسر مختلف المقايسات المصب ذات الصلة إلى النمذجة أمراض القلب والشرايين وفحص المخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel (9-12 mg/ml) | BD Biosciences | 354277 | |
| RPMI media | Invitrogen | 11835055 | |
| Glucose free RPMI media | Invitrogen | 11879-020 | |
| B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 | |
| B27 Supplement (w/ insulin) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Pen-strep antibiotic | Invitrogen | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | BenchMark | 100-106 | |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | EMD Millipore | 688000 | |
| CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 | |
| IWR1 | Sigma | I0161 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Cell lifter | Fisher | 08-100-240 | |
| Cryovial | Fisher (NUNC tubes) | 375418 | |
| TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |
References
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150 (2013).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).
- Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation. Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
