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Developmental Biology

छोटे अणु संग्राहक भेदभाव और इसके बाद ग्लूकोज भुखमरी का प्रयोग मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से उच्च शुद्ध cardiomyocytes की व्युत्पत्ति

Published: March 18, 2015 doi: 10.3791/52628
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1,2
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Institute of Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Cardiovascular Medicine Division, Department of Medicine, Child Health Research Institute, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Abstract

मानव प्रेरित स्टेम सेल व्युत्पन्न cardiomyocytes (hiPSC-सीएमएस) बुनियादी अनुसंधान और translational अनुप्रयोगों के लिए उपलब्ध प्राथमिक cardiomyocytes की कमी से निपटने के लिए एक महत्वपूर्ण सेल स्रोत बन गए हैं। Cardiomyocytes में hiPSCs अंतर करने के लिए, embryoid शरीर (ईबी) आधारित भेदभाव और विकास के कारक शामिल करने सहित विभिन्न प्रोटोकॉल विकसित किया गया है। हालांकि, इन प्रोटोकॉल अक्षम और शुद्ध cardiomyocytes उत्पन्न करने की क्षमता में अत्यधिक चर रहे हैं। हाल ही में, Wnt / β-catenin संकेतन का एक छोटा सा अणु आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग मॉडुलन उच्च दक्षता के साथ हृदय भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया था। इस प्रोटोकॉल के साथ, विभेदित कोशिकाओं का अधिक से अधिक से अधिक 50% -60% कार्डियक ट्रोपोनिन पॉजिटिव cardiomyocytes लगातार मनाया गया थे। आगे cardiomyocyte शुद्धता बढ़ाने के लिए, विभेदित कोशिकाओं को विशेष रूप से चयापचय अंतर के आधार पर गैर-cardiomyocytes को खत्म करने के लिए भुखमरी ग्लूकोज के अधीन थेcardiomyocytes और गैर cardiomyocytes के बीच है। इस चयन की रणनीति का उपयोग करना, हम लगातार विभेदित कोशिकाओं की आबादी में गैर cardiomyocytes को cardiomyocytes के अनुपात में अधिक से अधिक से अधिक 30% की वृद्धि प्राप्त की। ये अत्यधिक शुद्ध cardiomyocytes विट्रो रोग मॉडलिंग अध्ययन और दवा स्क्रीनिंग assays में मानव IPSC आधारित से परिणामों की विश्वसनीयता बढ़ाने चाहिए।

Introduction

प्राथमिक मानव cardiomyocytes क्योंकि इनवेसिव हृदय बायोप्सी, और क्योंकि संस्कृति में गरीब लंबी अवधि के सेल अस्तित्व के एकल कोशिकाओं को अलग कर में कठिनाई के लिए आवश्यकता के प्राप्त करने के लिए कठिन हैं। प्राथमिक मानव cardiomyocytes, रोगी विशेष मानव प्रेरित स्टेम सेल व्युत्पन्न cardiomyocyte की इस कमी को देखते हुए (hiPSC-मुख्यमंत्री) प्रौद्योगिकी एक बुनियादी अनुसंधान के लिए शक्तिशाली विकल्प cardiomyocyte स्रोत के रूप में अच्छी तरह के रूप में इस तरह के रोग मॉडलिंग और दवा के रूप में नैदानिक ​​और translational अनुप्रयोगों के रूप में माना गया है खोज 1। Cardiomyocytes में स्टेम सेल फर्क में शुरुआती प्रयासों embryoid निकायों (ईबीएस) का उपयोग भेदभाव प्रोटोकॉल कार्यरत हैं, लेकिन एक ईबी में कोशिकाओं की अक्सर कम 25% से अधिक cardiomyocytes 2,3 पिटाई कर रहे हैं क्योंकि इस विधि का उत्पादन cardiomyocytes में अक्षम है। तुलनात्मक रूप से, एक और BMP4 activin साइटोकिन्स का उपयोग कर एक monolayer आधारित भेदभाव प्रोटोकॉल ईबीएस तुलना में एक उच्च दक्षता प्रदर्शित, लेकिनइस प्रोटोकॉल, अभी भी अपेक्षाकृत अक्षम है मानव स्टेम सेल लाइनों 4 की एक सीमित संख्या में महंगा वृद्धि कारक है, और केवल कार्यों की आवश्यकता है। हाल ही में, एक अत्यंत कुशल, hiPSC monolayer आधारित cardiomyocyte भेदभाव प्रोटोकॉल Wnt / β-catenin 5 संकेत modulating द्वारा विकसित किया गया था। ये hiPSC, सीएमएस कार्डियक ट्रोपोनिन टी और अल्फा actinin, cardiomyocytes 6 की मानक मार्करों हैं कि दो sarcomeric प्रोटीन व्यक्त करते हैं। प्रोटोकॉल यहाँ का वर्णन इस छोटे अणु आधारित, फीडर सेल मुक्त, monolayer भेदभाव विधि 5,7 का रूपांतरण है। हम 7-10 दिन (चित्रा 1) के बाद hiPSCs से cardiomyocytes पिटाई प्राप्त करने में सक्षम हैं। हालांकि, 50% कोशिकाओं की धड़कन में जिसके परिणामस्वरूप एक cardiomyocyte भेदभाव के बाद, लगातार immunostaining इस तरह के हृदय-विशिष्ट ट्रोपोनिन टी और अल्फा-actinin के रूप में cardiomyocyte-विशिष्ट मार्करों के लिए नकारात्मक हैं कि गैर-cardiomyocytes की एक बड़ी आबादी के अस्तित्व को दर्शाता है। फू करने के लिएrther cardiomyocytes शुद्ध और गैर cardiomyocytes को खत्म करने, विषम विभेदित सेल आबादी कई दिनों के लिए एक अत्यंत कम ग्लूकोज मध्यम संस्कृति (चित्रा 2) के साथ उन्हें इलाज से भुखमरी ग्लूकोज के अधीन थे। इस इलाज के चुनिंदा एक कम ग्लूकोज पर्यावरण 8 में जीवित रहने के लिए प्राथमिक ऊर्जा स्रोत के रूप में लैक्टेट metabolize करने cardiomyocytes की क्षमता की वजह से गैर-cardiomyocytes, लेकिन नहीं गैर cardiomyocytes, समाप्त। इस शुद्धि कदम के बाद, गैर cardiomyocytes को cardiomyocytes के अनुपात में 40% की वृद्धि (चित्रा 3, चित्रा 4), मनाया जाता है और इन कोशिकाओं को नीचे की ओर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, रोग मॉडलिंग, और दवा स्क्रीनिंग assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सभी अभिकर्मकों के लिए विक्रेता जानकारी तालिका 1 में सूचीबद्ध किया गया है और माल की सूची। कोशिकाओं के संपर्क में आने वाले सभी समाधान और उपकरण बाँझ होना चाहिए, और सड़न रोकनेवाला तकनीक तदनुसार इस्तेमाल किया जाना चाहिए। जब तक अन्यथा निर्दिष्ट एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में सभी संस्कृति incubations के प्रदर्शन करना। इस प्रोटोकॉल में, सभी differentiations जिसमें hiPSCs वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, 6 अच्छी तरह प्लेटें में प्रदर्शन कर रहे हैं। भेदभाव और शुद्धि के बाद, कोशिकाओं अलग किया जा सकता है और नीचे की ओर उपयोग के लिए replated।

1. मध्यम तैयारी

  1. E8 मध्यम के लिए, प्रत्येक मध्यम घटक के लिए एक शेयर समाधान (3 NaHCO, एल ascorbic एसिड 2-फास्फेट, सोडियम Selenite, transferrin, इंसुलिन, FGF2, TGFB1) बनाने के लिए और -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान। DMEM / F12 की बोतल के लिए स्टॉक समाधान का उचित मात्रा में जोड़ें और बाँझ फिल्टर। समाधान concentrशेयर घटकों और E8 माध्यम के लिए व्यावहारिक और प्रतिक्रिया सेटअप तालिका 1 में पाया जा सकता है।
  2. बाह्य मैट्रिक्स समाधान के लिए, 4 डिग्री सीओ / एन पर (आमतौर पर 10 मिलीग्राम / एमएल पर आपूर्ति) तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पिघलना। मानव स्टेम सेल अल्फा-6-बीटा-एक Integrin 9 का उपयोग कर इस सामग्री को अच्छी तरह से पालन कर सकते हैं क्योंकि Matrigel आमतौर पर स्टेम सेल संस्कृति के लिए प्रयोग किया जाता है। एक बार बर्फ का ठंडा pipet सुझावों और ट्यूब का उपयोग बर्फ पर 2.25 मिलीग्राम (250 μl) aliquots बनाने के लिए और -80 डिग्री सेल्सियस पर aliquots की दुकान, thawed।
    1. ECMS साथ प्लेटों precoating करते हैं, पिघलना और बर्फ पर बाह्य मैट्रिक्स समाधान (ECMS) विभाज्य। 1 के अनुपात में ECMS और ठंडा DMEM / F12 मध्यम मिक्स: 200 बर्फ पर। समय से पहले ECMS दृढ़ीभवन को रोकने के लिए शांत रखें।
  3. इंसुलिन मध्यम बिना RPMI / B27 के लिए, RPMI मीडिया की 500 मिलीलीटर में B27 माइनस इंसुलिन के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. मध्यम (इंसुलिन के साथ) RPMI / B27 के लिए, insuli साथ (B27 पूरक के 10 एमएल जोड़ेंएन) और RPMI मीडिया की 500 मिलीलीटर में पेन-स्ट्रेप एंटीबायोटिक के 5 मिलीलीटर।
  5. कम ग्लूकोज मध्यम के लिए, B27 पूरक के 10 एमएल और ग्लूकोज मुक्त RPMI मीडिया की 500 मिलीलीटर में पेन-स्ट्रेप एंटीबायोटिक के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. : 1 के अनुपात ठंड / cryopreservation मध्यम के लिए, एक 9 में dimethylsulfoxide (DMSO) के साथ मिलकर भ्रूण गोजातीय सीरम मिश्रण। ठंड मध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है।
    नोट: सभी मीडिया फ़िल्टर और संग्रहीत 4 डिग्री सेल्सियस में और जब तक अन्यथा निर्दिष्ट दो सप्ताह के भीतर किया जाना चाहिए। जब तक अन्यथा निर्दिष्ट नीचे इस्तेमाल सभी अभिकर्मक / समाधान की मात्रा, 6 अच्छी तरह से थाली में एक भी अच्छी तरह से करने के लिए इरादा कर रहे हैं।

2. ECMS साथ 6 अच्छी तरह प्लेटें पूर्व कोटिंग

  1. तो 6 अच्छी तरह से थाली के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए ताजा बना ECMS के 2 मिलीलीटर लागू होते हैं, 200: 1 के अनुपात में बहुत ठंडा DMEM / F12 मीडिया के साथ (जैसे, Matrigel) तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण से ECMS बनाओ। अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक लगभग 90 मिलीग्राम ECMS प्राप्त होगा।
  2. ईसीएम सेतेएस 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए प्लेटें लेपित। प्रत्येक अच्छी तरह से, महाप्राण DMEM / F12 समाधान चढ़ाना कोशिकाओं को तुरंत पहले। प्लेटें तो कोशिकाओं प्राप्त करने के लिए तैयार हो जाएगा।

3. विगलन जमे hiPSCs

नोट: यह इष्टतम संवर्धन और फ्रीज / पिघलना चक्र निम्नलिखित hiPSC-सेमी में hiPSCs के बहाव के भेदभाव को जन्म दे सकती निकट के रूप में इस प्रक्रिया का पालन करें।

  1. 6 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से hiPSCs की एक शीशी पिघलना। प्रत्येक शीशी के लिए रॉक अवरोध करनेवाला (10 माइक्रोन) के साथ ठंड E8 माध्यम के 9 मिलीलीटर के साथ एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब तैयार करें। रॉक अवरोध करनेवाला cryopreservation 10 निम्नलिखित hiPSCs अस्तित्व में सुधार। एक लगभग 5 मिमी व्यास बर्फ क्रिस्टल छोड़ दिया है जब तक कोशिकाओं पिघलना करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शीशियों रखें।
  2. 70% इथेनॉल के साथ शीशियों के बाहरी स्प्रे। बाँझ लामिना हुड के लिए उन्हें जाने से पहले टिशू पेपर के साथ शीशियों साफ कर लें।
  3. तैयार शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं स्थानांतरण। टी कुल्लावह E8 माध्यम के 500 μl के साथ एक बार शीशी और एक ही शंक्वाकार ट्यूब thawed कोशिकाओं से युक्त मध्यम हस्तांतरण। 200 x जी पर 4 मिनट के लिए आरटी पर अपकेंद्रित्र।
  4. Centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला Aspirate और धीरे रॉक अवरोध करनेवाला (10 माइक्रोन) के साथ E8 माध्यम से 2 मिलीलीटर के साथ सेल गोली resuspend। 6 अच्छी तरह से थाली ECMS साथ पूर्व लेपित की एक अच्छी तरह से करने के लिए resuspended कोशिकाओं स्थानांतरण।
  5. संवर्धन के 24 घंटे के बाद रॉक अवरोध करनेवाला के बिना E8 मध्यम के साथ मध्यम बदलें। कोशिकाओं को इस समय के द्वारा पालन किया जाना चाहिए।

HiPSCs 4. Passaging

  1. आमतौर पर, एक 6 अच्छी तरह से थाली में 75% -80% confluency तक पहुंचने के बाद पारित होने hiPSCs। संस्कृति के माध्यम aspirate। जल्दी से बाँझ के 1 मिलीलीटर, आरटी पीबीएस के साथ कुओं धो लें। महाप्राण पीबीएस।
    1. 500 0.5 मिमी EDTA के μl या 1x सेल टुकड़ी समाधान (जैसे, Accutase) जोड़ें और आरटी पर 1-7 मिनट के लिए सेते हैं। EDTA के ऊष्मायन के लिए उपयुक्त समय hiPSC लाइन के साथ बदलता रहता है। दिखाई दे कर्लिंग ओ देखने की उम्मीदकिनारों के आसपास कालोनियों के आर उमड़ना, यह है कि EDTA या सेल टुकड़ी समाधान का संकेत होगा के रूप में हटाया जा करने के लिए तैयार है।
  2. EDTA या सेल टुकड़ी समाधान aspirate। 10 माइक्रोन रॉक अवरोध करनेवाला के साथ पूरक E8 माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें। बार-बार ऊपर और नीचे pipetting और एक P1000 विंदुक के साथ कालोनियों बंद छिड़काव द्वारा कुएं में hiPSC कालोनियों विस्थापित। कालोनियों पूरा होने के बाद 5-10 सेल clumps में टूट जाना चाहिए।
  3. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में रॉक अवरोध करनेवाला के साथ E8 माध्यम से 1 मिलीलीटर में निलंबित कर रहे हैं कि कालोनियों स्थानांतरण।
  4. E8 माध्यम में छोटे गुच्छों में बड़े सेल clumps को बाधित। कोशिकाओं को कमजोर करने के लिए सेल निलंबन के लिए अवरोध करनेवाला के साथ E8 मीडिया का एक उचित मात्रा में जोड़ें। कमजोर पड़ने के लिए जोड़ने के लिए मीडिया मात्रा सेल घनत्व पर निर्भर करता है और कुओं की संख्या वरीयता प्राप्त किया जाना है। आदर्श रूप में, hiPSCs की एक एकल, 80% मिला हुआ अच्छी तरह से 1:12 पतला होना चाहिए।
    1. सीई की मौजूदा 1 मिलीलीटर रॉक अवरोध करनेवाला के साथ 11 मिलीलीटर E8 मध्यम जोड़ेंइस aforementioned 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में डालूँगा समाधान के लिए एक 1:12 कमजोर पड़ने प्राप्त करने के लिए।
  5. आगे (प्रत्येक खंड में 50-200 कोशिकाओं सबसे अच्छा है के आसपास) छोटे सेल टुकड़ों में सेल clumps triturate। इस सेल अस्तित्व कम कर देता है के रूप में करने से बचें ओवर-triturating।
  6. महाप्राण पूर्व लेपित प्लेटों से ECMS और प्रत्येक कुएं में resuspended कोशिकाओं के 2 मिलीलीटर जोड़ें। 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से लगभग 100,000 कोशिकाओं आदर्श है। अच्छी तरह के केंद्र में कोशिकाओं की क्लस्टरिंग से बचने के लिए अच्छी तरह से चारों ओर समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने के लिए निशाना लगाओ।
  7. संवर्धन के 24 घंटे के बाद, रॉक अवरोध करनेवाला के बिना E8 मध्यम के साथ मध्यम बदलें। कोशिकाओं 80% मिला हुआ हो जाते हैं जब तक संस्कृति के माध्यम से हर 24 घंटा बदलें। फिर, कोशिकाओं को फिर से पारित होने के लिए तैयार हैं। यह आमतौर पर 80% confluency तक पहुंचने के लिए मार्ग के बीच 3-6 दिन लगते हैं।

5. बर्फ़ीली hiPSCs

नोट: यह इष्टतम संवर्धन और कूल्हे के बहाव के भेदभाव को जन्म दे सकती निकट के रूप में इस प्रक्रिया का पालनHiPSC-सेमी में अनुसूचित जातियों / फ्रीज पिघलना चक्र के बाद।

  1. सेल लाइन का नाम, सेल प्रकार, बीतने संख्या, और ठंड की तारीख के साथ क्रायोजेनिक ट्यूबों लेबल। एक सामान्य दिशानिर्देश के रूप में, एक 6 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से एक शीशी का उपयोग करें। रॉक अवरोध करनेवाला (10 माइक्रोन) के साथ E8 माध्यम के 9 मिलीलीटर से भरा एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब तैयार करें। 90% FBS और 10% DMSO के साथ मध्यम ठंड तैयार करें, और उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम रहते हैं।
  2. , संस्कृति मीडिया aspirate 500 0.5 मिमी EDTA के μl या 1x सेल टुकड़ी समाधान जोड़ने और आरटी पर 2-7 मिनट के लिए सेते हैं। EDTA या सेल टुकड़ी समाधान जोखिम की अवधि सेल लाइन के लिए सेल लाइन से भिन्न होता है।
  3. महाप्राण EDTA या सेल टुकड़ी समाधान। E8 माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. ऊपर और नीचे pipetting और एक P1000 विंदुक के साथ कालोनियों बंद छिड़काव द्वारा कुएं में hiPSC कालोनियों विस्थापित। कालोनियों छोटे से 100 सेल clumps में टूट नहीं किया जाना चाहिए। E8 युक्त तैयार शंक्वाकार ट्यूब के लिए निलंबित कर दिया कोशिकाओं स्थानांतरण। आर पर अपकेंद्रित्रटी 200 x जी पर 4 मिनट के लिए।
  5. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और गोली को ठंड ठंड मध्यम के 500 μl जोड़ें। 1-2 बार pipetting द्वारा गोली Resuspend। सेल अस्तित्व बड़े clumps में कोशिकाओं को रखने से सुधार हुआ है।
  6. एक लेबल क्रायोजेनिक ट्यूब में resuspended कोशिकाओं स्थानांतरण। जल्दी से क्रमिक ठंडा करने के लिए अनुमति देगा जो एक ठंड कंटेनर युक्त isopropanol, में शीशियों चाल है। फिर लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन कोशिकाओं हस्तांतरण, 24 घंटा के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं के साथ कंटेनर में रखें।

मानव IPSC 6. कार्डिएक भेदभाव

नोट: जोड़ा जब सभी मीडिया आरटी पर कम से कम होना चाहिए।

  1. EDTA या 1x सेल टुकड़ी समाधान के साथ हदबंदी के बाद, लगभग 100,000 भेदभाव के लिए ECMS लेपित 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों पर मानव IPSCs (सेल passaging के प्रक्रियाओं के रूप में एक ही कदम) बीज। कोशिकाओं 85 confluency% तक पहुँचने, 6 के साथ इंसुलिन मध्यम बिना RPMI / B27 के लिए मध्यम बदलनेमाइक्रोन GSK3-बीटा अवरोध करनेवाला CHIR99021 (चीड़) और 48 घंटे के लिए बनाए रखें।
  2. 48 घंटे के बाद, इंसुलिन मध्यम बिना RPMI / B27 के साथ चीड़-युक्त मध्यम संस्कृति की जगह है और (3 दिन तक) 24 घंटा के लिए अकेला छोड़ दो।
  3. 3 दिन में, 5 माइक्रोन Wnt अवरोध करनेवाला IWR1 साथ इंसुलिन के बिना RPMI / B27 के लिए मीडिया को बदलने के लिए और (5 दिन तक) 48 घंटा के लिए बनाए रखें।
    नोट: पहले के अध्ययनों में 11 में वर्णित के रूप में Wnt निषेध इसके अलावा, अन्य छोटे अणु यौगिकों का उपयोग करने का प्रयास किया जा सकता है। IWR1 कारण यह Wnt 11 संकेत बाधा में प्रभावी होना दिखाया गया है, जिसमें वृद्धि की श्रृंखला के लिए अन्य छोटे अणु Wnt अवरोधकों से अधिक का चयन किया गया।
  4. 5 दिन में, इंसुलिन मध्यम बिना वापस RPMI / B27 के लिए मध्यम बदलने के लिए और (7 दिन तक) 48 घंटे के लिए छोड़ दें।
  5. 7 दिन में, (इंसुलिन के साथ) RPMI / B27 मध्यम के साथ मध्यम जगह और एक ही माध्यम के साथ हर 3 दिन उसके बाद मध्यम बदलें। Cardiomyocytes की स्वतःस्फूर्त पिटाई पहले दिन लगभग 8 दिन में दिखाई जानी चाहिए10।

ग्लूकोज भुखमरी के माध्यम से मानव cardiomyocytes 7. शुद्धीकरण

  1. 10 दिन के बाद भेदभाव पर, 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए 2 मिलीलीटर कम ग्लूकोज माध्यम के प्रत्येक कुएं में मध्यम बदलने के लिए और (13 दिन तक) 3 दिनों के लिए इस माध्यम में कोशिकाओं को बनाए रखें।
  2. 13 दिन में, (इंसुलिन के साथ) RPMI / B27 मध्यम कोशिकाओं लौटें।
  3. वैकल्पिक रूप से, ग्लूकोज भुखमरी के दौरान गैर-cardiomyocytes की आसान हदबंदी के लिए अनुमति देता है, संस्कृति की थाली से गैर cardiomyocytes ढीला मदद करने के लिए ग्लूकोज भुखमरी के दूसरे दौर के लिए पहले cardiomyocytes replate।
    1. 13 दिन, महाप्राण मध्यम पर, पीबीएस के साथ एक बार धोने, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेल विसंघटन एंजाइम के 500 μl का उपयोग कर एकल कक्षों में कोशिकाओं को अलग कर देना। विशेष रूप से, एंजाइम उपचार के 5 मिनट के बाद, मैन्युअल बार बार सेल विसंघटन एंजाइम ऊपर खींच रहा है और cardiomyo के खिलाफ यह छिड़काव द्वारा 6 अच्छी तरह से थाली से cardiomyocytes अलग कर देना करने के लिए एक 1000 μl पिपेट का उपयोगcyte monolayer। 30 pipetting के repetitions के लिए ऊपर एकल कक्षों में cardiomyocytes अलग कर देना आवश्यक हो सकता है।
    2. कोशिकाओं अलग और एकल कोशिका रूप में कर रहे हैं, के बाद x जी 200 पर 4 मिनट के लिए सेल विसंघटन एंजाइम और सेंट्रीफ्यूज बाहर पतला करने के लिए इंसुलिन साथ RPMI / B27 के माध्यम के 5 मिलीलीटर से भरा एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सभी कोशिकाओं को इकट्ठा। महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    3. एक नए ECMS लेपित 6 अच्छी तरह से थाली पर 2 एमएल RPMI / B27 मध्यम और थाली के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित। आमतौर पर, cardiomyocytes की उच्च confluency replating दौरान सेल अस्तित्व के साथ मदद करता है। Replating दौरान इष्टतम अस्तित्व के लिए नई 6 अच्छी तरह से पकवान प्रति 2 मिलियन कोशिकाओं replate करने के लिए निशाना लगाओ।
  4. 14 दिन में, एक दूसरे ग्लूकोज अभाव चक्र के लिए वापस कम ग्लूकोज मध्यम 2 मिलीलीटर मध्यम बदल जाते हैं। संस्कृति 3 अधिक दिनों के लिए यह कम ग्लूकोज राज्य में कोशिकाओं। गैर cardiomyocytes के अधिकांश इस कम ग्लूकोज संस्कृति हालत में मर जाएगा।
  5. दिन में 17 से कम, आर के मध्यम करने के लिए 2 मिलीलीटर बदलनेइंसुलिन के साथ पीएमआई / B27 के माध्यम। शेष कोशिकाओं उच्च शुद्ध cardiomyocytes किया जाएगा। ये cardiomyocytes जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, दवा स्क्रीनिंग, चयापचय विश्लेषण, और विभिन्न अन्य डाउनस्ट्रीम assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Representative Results

hiPSC भेदभाव के दौरान morphological परिवर्तन।

फीडर से मुक्त प्लेटों में सुसंस्कृत hiPSC के रूप में फ्लैट, दो आयामी कालोनियों बढ़ी। लगभग 85% confluency तक पहुँचने पर, hiPSCs भेदभाव (चित्रा 1 ए) के लिए 6 माइक्रोन चीड़ के साथ इलाज किया गया। कोशिका मृत्यु, एक सामान्य और आम घटना है, की पर्याप्त मात्रा में चीड़ के इलाज के 24 घंटे के बाद मनाया गया। चीड़ उपचार के दो दिनों के बाद, hiPSCs एक mesodermal भाग्य की दिशा में अंतर करने के लिए जारी रखा। HiPSC कालोनियों में कोशिकाओं की तुलना में, इन दिन दो कोशिकाओं के लिए सेल के आकार में वृद्धि हुई। सेल नंबर भी कोशिका विभाजन (चित्रा 1 बी) के माध्यम से वृद्धि हुई है। 5 दिन में, mesodermal कोशिकाओं हृदय वंश (हृदय mesoderm) की ओर निर्देशित कर रहे थे। इस समय, कोशिकाओं coalescing और विशेषता है, शाखा संरचनाओं की तरह (चित्रा 1C) के गठन शुरू करते हैं। 10 दिन में, शाखा संरचनाओं की तरह अत्यधिक सुनाया, और cardiomyocytes स्टार गयाटेड अनायास (चित्रा -1) की धड़कन। टर्मिनली-विभेदित cardiomyocytes इस बात से परे पैदा नहीं होगा। भेदभाव प्रोटोकॉल का एक समय चित्रा 2 में दिखाया गया है।

पता चला है Immunostaining और परिणाम प्रवाह cytometry cardiomyocytes ग्लूकोज भुखमरी से शुद्ध किया गया।

भेदभाव के 10 दिनों के बाद, सेल क्षेत्रों में से 50% से अधिक की धड़कन हैं। हालांकि, पिटाई सेल चादरें कभी कभी भी गैर-cardiomyocytes के साथ intermingled रहे हैं। Cardiomyocyte शुद्धता की जांच करने के लिए, cardiomyocyte मार्कर कार्डियक ट्रोपोनिन टी (cTnT) के खिलाफ immunostaining के साथ कोशिकाओं सबसे कोशिकाओं cTnT सकारात्मक थे कि खोजने के लिए विशेषता थे। हालांकि, विभेदित कोशिकाओं का एक unpurified आबादी में, कोशिकाओं की संख्या भी 13 दिन (चित्रा 3 ए) में इस विभेदित आबादी में गैर cardiomyocytes की उपस्थिति, सुझाव cTnT की अभिव्यक्ति का अभाव है। हालांकि, ग्लूकोज भुखमरी के साथ,लगभग सभी शेष कोशिकाओं में ग्लूकोज भुखमरी निम्नलिखित cardiomyocytes की सफल शुद्धि का संकेत है, दिन 13 (3B चित्रा) में cTnT सकारात्मक थे। इन आंकड़ों से आगे के विश्लेषण के प्रवाह cytometry का उपयोग कर पुष्टि कर रहे थे। 13 दिन के बाद भेदभाव पर विभेदित कोशिकाओं की आबादी भूखे (चित्रा -4 ए) ग्लूकोज नहीं, जब लगभग 50% TNNT2 + कोशिकाओं निहित। एक समानांतर भेदभाव भी आयोजित किया लेकिन एक दिन में 3 ग्लूकोज के अभाव के साथ भेदभाव करने के बाद 10 दिन में शुरू किया गया था। Unstarved भेदभाव के विपरीत, ग्लूकोज अभाव दिन 13 (चित्रा 4 बी) में 90% TNNT2 + कोशिकाओं से युक्त एक शुद्ध आबादी का नेतृत्व किया।

चित्र 1
चित्रा 1. हृदय वंश की ओर hiPSC भेदभाव के दौरान अनुक्रमिक morphological परिवर्तन। (ए) Undifferentiated hiPSCs0 दिन प्रदर्शनी ठेठ कॉलोनी आकृति विज्ञान में और 85% confluency के आसपास पहुंच गया। 2 दिन में (बी), चीड़ के साथ उपचार के बाद कोशिकाओं को दो दिनों के लिए 100 confluency% पर पहुंच गया और mesodermal वंश में प्रवेश किया। 5 दिन में (सी), कोशिकाओं IWR1 के साथ उपचार के बाद दो दिनों हृदय मेसोडर्म चरण में प्रवेश के लिए। कुछ कोशिकाओं फ्यूज और (तीर द्वारा संकेत) विशेषता शाखा की तरह morphologies फार्म शुरू किया। दिन में 7-10 से कम (डी), शाखा संरचनाओं की तरह अत्यधिक स्पष्ट कर रहे हैं, और cardiomyocytes अनायास पिटाई शुरू करते हैं। बार = 200 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
HiPSC-मुख्यमंत्री भेदभाव प्रोटोकॉल और बाद में ग्लूकोज भुखमरी प्रक्रिया चित्रा 2. इस समय। Cardiomyocytes पिटाई फिर से आम तौर पर पहले लगभग दिनों 7-10 में मनाया। ग्लूकोज भुखमरी के दो दौर दिन 17 से cardiomyocytes की एक शुद्ध आबादी में परिणाम होगा। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस ग्लूकोज भुखमरी निम्नलिखित cardiomyocytes की शुद्धि का पता चलता है। (ए) भेदभाव के 13 दिनों के कार्डियक ट्रोपोनिन टी (cTnT) के साथ दाग रहे थे के बाद unpurified कोशिकाओं। सबसे कोशिकाओं cardiomyocytes में भेदभाव और सकारात्मक cTnT थे, लेकिन गैर हृदय, cTnT नकारात्मक कोशिकाओं के एक नंबर भी मौजूद हैं। इसके विपरीत (बी), 10 दिन में शुरुआत एक दिन में 3 ग्लूकोज भुखमरी के बाद, लगभग सभी जीवित कोशिकाओं के cTnT दिन 13. स्केल बार = 200 माइक्रोन से सकारात्मक थे।रेफरी = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52628/52628fig3large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. फ्लो ग्लूकोज भुखमरी निम्नलिखित cardiomyocytes की शुद्धि का पता चलता है। (ए) ग्लूकोज भुखमरी के बिना हृदय भेदभाव के 13 दिनों के बाद, कोशिकाओं की आबादी लगभग 50% TNNT2 + cardiomyocytes प्रदर्शन किया। लाल विभेदित सेल की आबादी को इंगित करता है और नीले रंग की एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में समान hiPSCs इंगित करता है। हृदय भेदभाव के 10 दिनों के बाद (बी) और ग्लूकोज भुखमरी के तीन दिनों के बाद, differentiations के एक ही बैच से कोशिकाओं की आबादी 90% TNNT2 + cardiomyocytes को रोकने के लिए शुद्ध किया गया था। के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

E8 माध्यम के लिए रचनाएं
E8 मात्रा: 1 एल कंपनी सूची की संख्या
Glutamine और HEPES के साथ DMEM / F12 1000 मिलीलीटर Invitrogen 11330-032
3 NaHCO (7.5%, 75 मिलीग्राम / एमएल) 7.24 मिलीग्राम Invitrogen 25080-094
एल Ascorbic एसिड 2-फॉस्फेट (64 मिलीग्राम / एमएल) 1 मिलीलीटर सिग्मा A8960
सोडियम Selenite (70 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) 200 μl सिग्मा S5261
transferrin (50 मिलीग्राम / एमएल) 214 μl सिग्मा T3705
इंसुलिन (4 मिलीग्राम / एमएल) 5 मिलीलीटर Invitrogen 12585-014
FGF2 (200 एनजी / μl) 500 μl Peprotech 100-18B
TGFB1 (100 एनजी / μl) 20 μl Peprotech 100-21
E8 रचनाओं के लिए स्टॉक समाधान
एल Ascorbic एसिड-2-फॉस्फेट (64 मिलीग्राम / एमएल) 50 मिलीलीटर ultrapure पानी में 3.2 ग्राम, दुकान 500 μl aliquots -20 डिग्री सेल्सियस पर
Transferrin (50 मिलीग्राम / एमएल) -20 डिग्री सेल्सियस पर ultrapure पानी, दुकान 107 μl aliquots की 10 एमएल में 500 मिलीग्राम
सोडियम Selenite (70 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) -20 डिग्री सेल्सियस पर 500 मिलीलीटर ultrapure पानी, दुकान 100 μl aliquots में 35 मिलीग्राम सोडियम Selenite
FGF2 (200 एनजी / μl) 5 मिलीलीटर ठंड डी में 1 मिलीग्रामपीबीएस, दुकान 250 μl aliquots -20 डिग्री सेल्सियस पर
TGFB1 (100 एनजी / μl) -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर ठंड 10 मिमी साइट्रिक एसिड, पीएच 3, स्टोर 10 μl aliquots में 100 माइक्रोग्राम प्रति

E8 मध्यम की तालिका 1. संरचना।

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Discussion

उच्च शुद्ध hiPSC व्युत्पन्न cardiomyocytes की एक बड़ी राशि प्राप्त करने के बुनियादी हृदय अनुसंधान के रूप में अच्छी तरह से नैदानिक ​​और translational अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है। कार्डिएक भेदभाव प्रोटोकॉल छोटे अणु-संग्राहक और monolayer आधारित विधियों से 5 अंत में हृदयजनित विकास के उपयोग embryoid शरीर आधारित विधियों से संक्रमण, हाल के वर्षों में जबरदस्त सुधार आया सैंडविच विधियों 12 मैट्रिक्स के लिए, दो कारक है, और है। इस aforementioned प्रोटोकॉल की, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल उच्चतम और छोटे अणुओं चीड़ और IWR 5,7 का उपयोग कर Wnt / β-catenin संकेतन modulating द्वारा विभिन्न hiPSC सेल लाइनों के लिए सबसे प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हृदय भेदभाव दक्षता का प्रदर्शन किया। विशेष रूप से, समान hiPSCs Wnt संकेतन अवरोध करनेवाला IWR1 साथ GSK3-बीटा अवरोध करनेवाला चीड़ और बाद में हृदय भेदभाव साथ mesodermal भेदभाव से गुजरना करने के लिए प्रेरित किया गया। के इन अनुक्रमिक चरणोंWNT सिगनल मॉडुलन, हृदय वंश शामिल चरण के दौरान इंसुलिन कमी के द्वारा सहायता प्राप्त, अत्यधिक कुशल हृदय भेदभाव का नेतृत्व किया। चीड़ mesodermal प्रेरण के लिए इस्तेमाल एक आम छोटे अणु GSK3-बीटा अवरोध करनेवाला है, लेकिन GSK3-बीटा निषेध के लिए अन्य छोटे अणुओं cardiomyocyte भेदभाव प्रोटोकॉल 11 में परीक्षण किया गया है। एकाधिक विकल्प भी बाद में छोटे अणु Wnt अवरोध करनेवाला के लिए उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, हाल ही में एक प्रकाशन cardiomyocytes के लिए स्टेम सेल की रासायनिक परिभाषित भेदभाव पर ध्यान केंद्रित प्रभावी Wnt निषेध और हृदय मेसोडर्म प्रेरण 11 के लिए 2 माइक्रोन Wnt-C59 उपयोग करता है।

इसके अलावा, एक ग्लूकोज भुखमरी विधि के साथ भेदभाव cardiomyocytes cardiomyocytes और गैर cardiomyocytes 8 के बीच मौजूदा प्रवाह अलग ग्लूकोज चयापचय का लाभ लेता है, जो आगे शुद्ध थे। यह ग्लूकोज भुखमरी विधि की प्रभावशीलता घ है कि नोट करने के लिए आवश्यक हैensity निर्भर (यानी, cardiomyocytes के उच्च प्रतिशत झुकेंगे कि differentiations अधिक से अधिक cardiomyocyte अस्तित्व को प्राप्त करने की संभावना है)। बहरहाल, कम ग्लूकोज मध्यम करने के लिए संक्रमण भी cardiomyocytes के लिए एक तनावपूर्ण स्थिति है। यह ग्लूकोज भुखमरी के तीन दिनों के बाद वापस इंसुलिन माध्यम के साथ नियमित रूप से RPMI / B27 के लिए कोशिकाओं को बदलने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में, एक फीडर से मुक्त विकास प्रणाली में जो स्टेम कोशिकाओं फीडर माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts पर हो नहीं कर रहे थे, उपयोग किया गया था। हालांकि, पहले हृदय भेदभाव प्रोटोकॉल स्टेम सेल 5 से cardiomyocytes निर्माण करने के लिए फीडर आधारित प्रणाली का उपयोग किया है। इसी तरह, पूर्व प्रोटोकॉल भी स्टेम सेल रखरखाव के लिए mTeSR1 मध्यम का इस्तेमाल किया है, लेकिन यहाँ का उपयोग किया E8 मीडिया और फीडर से मुक्त प्रणाली की वजह से अपनी सादगी और ऐसे गोजातीय सीरम albumin और माउस भ्रूण fibroblasts के रूप में अतिरिक्त xenogeneic घटकों की कमी से बेहतर है।

वर्तमान में,cardiomyocyte प्रजातियों की दिशा में स्टेम सेल भेदभाव मोटे तौर पर मजबूत है, लेकिन अभी भी यह दक्षता के मामले में hiPSC लाइन से लाइन परिवर्तनशीलता से ग्रस्त है। यह हृदय भेदभाव के क्षेत्र में एक प्रमुख मुद्दा बना हुआ है और आगे के अध्ययन की आवश्यकता होगी। भेदभाव दक्षता hiPSC लाइनों के उचित रखरखाव से सुधार हुआ है, और विशेष रूप से, hiPSC रखरखाव के दौरान overconfluency रोक रहा है। HiPSCs का एक समान रूप से वरीयता प्राप्त monolayer सबसे अच्छा समग्र differentiations को जन्म दे जाता है के रूप में अतिरिक्त परिवर्तनशीलता, passaging प्रक्रिया के दौरान सेल बोने से उठता है। इधर, सेल संस्कृति के दौरान सेल बोने के लिए एक माउस व्युत्पन्न, Matrigel आधारित ECMS सफलतापूर्वक उपयोग किया गया था, लेकिन एक संभावित संक्रमण Xeno से मुक्त करने के लिए substrates के लिए सिफारिश की है। ECMS पर सेल बोने के संबंध में, असमान बोने अक्सर एक विशेष अच्छी तरह से भीतर cardiomyocytes के असमान वितरण में यह परिणाम है। HiPSCs असमान वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, तो उदाहरण के लिए, एक छह अच्छी तरह से थाली में एक अच्छी तरह के किनारों hig को जन्म दे सकता हैअच्छी तरह के केंद्र से cardiomyocytes की उसकी संख्या। ये असमान बोने शर्तों कम क्षमता differentiations के लिए वृद्धि और गैर cardiomyocyte की एक बड़ी संख्या है, ऐसे fibroblasts और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के रूप में mesodermal डेरिवेटिव दे सकता है। हम भी कम दक्षता differentiations (50% नीचे) और अधिक कठिन यहाँ उल्लेख ग्लूकोज अभाव प्रक्रिया का उपयोग कर शुद्ध करने के लिए कर रहे हैं कि मनाया है। लंबी अवधि के ग्लूकोज भुखमरी का एक अन्य पक्ष प्रभाव cardiomyocyte व्यवहार्यता में एक संभावित नुकसान हुआ है। Cardiomyocytes ग्लूकोज के अभाव में लैक्टेट metabolize करने में सक्षम रहे हैं, हम एक कम ग्लूकोज पर्यावरण के लिए इस स्विच कोशिकाओं के लिए तनावपूर्ण है कि लगता है। प्रकोष्ठों की धड़कन अनायास बंद कर सकता है, और ग्लूकोज भुखमरी की सिफारिश की समय से परे लंबे समय तक है अगर कुछ सेल नुकसान देखा जा सकता है। ग्लूकोज के अभाव के इस बढ़ाकर संवेदनशीलता स्टेम सेल व्युत्पन्न cardiomyocy की अच्छी तरह से स्थापित, विकास कार्य, और electrophysiological अपरिपक्वता का परिचायक हो सकता हैTES सच वयस्क की तुलना में 13 cardiomyocytes।

सारांश में, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक cardiomyocyte-सफ़ाई ग्लूकोज भुखमरी विधि के साथ छोटे अणु आधारित, hiPSC monolayer के हृदय भेदभाव विधि को जोड़ती है। इस प्रोटोकॉल अत्यधिक शुद्ध cardiomyocytes की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीढ़ी के लिए अनुमति देता है और हृदय रोग मॉडलिंग और दवा स्क्रीनिंग के लिए प्रासंगिक बहाव के विभिन्न assays के सुविधा चाहिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Matrigel (9-12 mg/ml) BD Biosciences 354277
RPMI media Invitrogen 11835055
Glucose free RPMI media Invitrogen 11879-020
B27 Minus Insulin Invitrogen A1895601
B27 Supplement (w/ insulin) Invitrogen 17504-044
Pen-strep antibiotic Invitrogen 15140122
Fetal bovine serum BenchMark 100-106
DMSO Sigma D-2650
ROCK inhibitor Y-27632 EMD Millipore 688000
CHIR99021 Thermo Fisher 508306
IWR1 Sigma I0161
EDTA Invitrogen 15575-020
Accutase Millipore SCR005
Cell lifter Fisher 08-100-240
Cryovial Fisher (NUNC tubes) 375418
TrypLE Select Enzyme Invitrogen 12563-011

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 97 मानव स्टेम सेल हृदय भेदभाव छोटे अणु यौगिकों cardiomyocytes ग्लूकोज भुखमरी प्रेरित
छोटे अणु संग्राहक भेदभाव और इसके बाद ग्लूकोज भुखमरी का प्रयोग मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से उच्च शुद्ध cardiomyocytes की व्युत्पत्ति
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Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K.,… More

Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).

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