Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

التصوير تستقيم من Published: March 13, 2015 doi: 10.3791/52636
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County

Introduction

وقد وفرت دراسة ذبابة الفاكهة البطن رؤى كبيرة في التنظيم الجيني للمجموعة واسعة من الظواهر. على وجه الخصوص، لم يكن هناك بحوث واسعة النطاق على التنمية البيض، لأن مراحل تكوين البويضات يوفر طريقة الانقياد للتحقيق في العديد من العمليات التنموية المختلفة، بما في ذلك الزخرفة الأنسجة، والتغيرات قطبية الخلية، دورة الخلية التبديل، وتنظيم متعدية 1،2،3،4. حدث واحد morphogenic المهم خلال مراحل تكوين البويضات هي مواصفات، اكتساب القدرة على الحركة، والهجرة من مجموعة من الخلايا تسمى خلايا الحدود (استعراضها في 5). منذ الهجرة الخلية هو سمة أساسية من سمات التشكل الحيوان، ولأن التنظيم الجيني لهذه العملية يتم حفظها جيدا، وآليات تحدد في الذباب من المحتمل أن تكون مهمة في سياقات أخرى. وبالتالي، نحن نحقق في السيطرة الجزيئية للهجرة الخلايا الحدود. لدراساتنا، قمنا بتطوير طريقة جديدة لمراقبة القطبين الأمامية تطوير البيض،حيث تنشأ خلايا الحدود، لدراسة كيفية تطوير بالتفصيل.

داخل المبيض، وتوجد غرف البيض في مراحل النمو المختلفة على امتداد سلاسل دعا ovarioles، والتي المغطى في غمد رقيقة (الشكل 1A). وسيكون لكل غرفة البيض على المضي قدما لتشكيل بيضة واحدة. خلال مراحل تكوين البويضات، يجب عدة أنواع مختلفة من الخلايا تتطور بطريقة منسقة. وD. وتتكون غرفة البطن البيض من 16 خلايا خط الجرثومية، بما في ذلك بويضة واحدة، وتحيط بها طبقة واحدة ظهارة مسامي 6. تنشأ هناك عدد صغير من الخلايا المتخصصة، تسمى خلايا القطبية، في الأمامي والخلفي أقطاب ظهارة. الخلايا الحدود 6-8 تنشأ في الظهارة الأمامية للغرفة البيض، والناجمة عن الخلايا القطبية 5،7. في منتصف مراحل تكوين البويضات (المرحلة 9)، والخلايا الحدود فصل من جيرانهم وتهاجر بين الخلايا الممرضة للوصول إلى البويضة في الخلفي من الغرفة البيض 5،7. يجب إنجاز هذه الحركةبينما تبقى الخلايا الحدود في كتلة المحيطة خليتين القطبية غير متحركة، مما يجعل هذا النوع من الهجرة الخلية الجماعية. الهجرة الناجحة من الكتلة خلية الحدود يضمن التنمية السليمة للبويب من قشرة البيضة، وهو أمر ضروري للإخصاب.

الخلايا القطبية الأمامية إرشاد مصير خلية الحدود من خلال تفعيل شلال نقل الإشارة. الخلية القطبية تفرز السيتوكينات، المفردة (UPD)، التي تربط لمستقبلات عبر الغشاء، Domeless (القبة)، وعلى خلايا بصيلات المجاورة خلال المرحلة 8 من تطوير بويضة 8،9. ربط UPD يسبب يانوس التيروزين كيناز (JAK) إلى الفوسفات ومحول الإشارات والمنشط من النسخ (STAT) 8،10،11. STAT ثم ينتقل إلى النواة لتفعيل النسخ. خلايا الحدود بطيئة (SLBO) هو عامل النسخ هذا هو الهدف النسخي المباشر للSTAT ومطلوب أيضا للهجرة الخلايا الحدود 12. إطلالة جانبية على غرف بيضة تشير روينظم قبعة النشاط STAT في التدرج عبر الظهارة الأمامية 8،11،13. خلايا بصيلات الأقرب إلى الخلايا القطبية وتحتوي على أعلى مستويات تنشيط STAT، وبالتالي فإنها تصبح خلايا الحدود وتغزو الأنسجة خط الجرثومية المجاورة.

أن نفهم كيف يتم تحديد الخلايا الحدود داخل وفصل من ظهارة، نحن بحاجة لمراقبة كيفية تنظيم الأنسجة. وإذا نظرنا إلى غرف البيض من منظور الأمامي على ذلك، فإننا نتوقع التماثل شعاعي من النشاط STAT في خلايا بصيلات المحيطة الخلايا القطبية. ومن شأن نهاية على وجهة نظر أيضا تظهر بشكل أكثر دقة الاختلافات في بروتينات الغشاء واجهات خلية خلية قبل وأثناء مفرزة من مقارنة الخلايا في طائرات التنسيق المختلفة. لأن غرف البيض هي مستطيل وتعلق على بعضها البعض من خلال خلايا ساق، يحلون على الشرائح أفقيا، مما يجعل من الصعب مراقبة العمارة الأمامية. وبالتالي، الكثير من المعلومات عن الخلايا في القطبين من الغرفة بيضة لهاتم استنتاجها من وجهات نظر الاطراف. ورغم أن بعض المعلومات التي يمكن الحصول عليها من خلال حسابي اعادة البناء 3-D من المقاطع البصرية، تشتت الضوء، photobleaching من، وحدود الفقيرة القرار في محور Z جعل هذه المعلومات أقل تفصيلا ويمكن الاعتماد عليها في غياب تقنيات باهظة الثمن مثل فائقة قرار المجهري 14 . أنواع أخرى من التصوير القائم على القسم (على سبيل المثال، المجهر الإلكتروني أو مشراح باجتزاء) تتطلب التلاعب واسعة من الأنسجة، بما في ذلك الجفاف، مما يزيد من احتمال عن القطع الأثرية. وهكذا، قمنا بتطوير طريقة جديدة لصورة D. غرف البطن البيض في حين تستقيم. هذه الطريقة أثبتت بالفعل مفيدة في توضيح كيفية الحظ خلايا متحركة (انظر ممثل النتائج ومانينغ وآخرون، قيد الاستعراض)، ومن المرجح أن يكون أكثر قيمة على نطاق واسع في الدراسات لجوانب أخرى من مراحل تكوين البويضات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تشريح Ovarioles

  1. نقل حوالي خمسة عشر الذباب الإناث القديمة 2-4 يوما وعدد قليل من الذكور لذبابة القارورة الغذاء الطازج مع إضافة الخميرة الجافة النشطة. استخدام القطن باعتبارها المكونات لقارورة، وإضافة بضع قطرات من الماء إلى القطن للحفاظ على رطوبة عالية.
  2. مكان قارورة في C حاضنة 25 درجة ل14-16 ساعة لتحقيق أقصى قدر من عدد من المرحلة 8-10 غرف البيض.
    ملاحظة: فترة حضانة يختلف باختلاف درجة الحرارة والمرحلة المطلوبة.
  3. إعداد وسائل الاعلام تشريح، 0.1M KPO 4 و NP40 الحلول حسب الحاجة لليوم التالي (انظر المواد).
  4. تخدير الذباب باستخدام CO 2، ووضع تحت المجهر تشريح. الماصة عدة قطرات من وسائل الإعلام تشريح في كل تجويف في الشريحة الزجاجية الاكتئاب.
  5. عقد ملقط في كل يدوية على ما يقرب من 30 درجة زاوية إلى الأعلى الطاولة وتوجيه ذبابة واحدة أنثوية الأجنحة إلى أسفل. مع جهة غير المهيمنة الخاص بك، والتقاط الأنثى باستخدام ملقط، واستيعاب لها في لnterior من البطن، بالقرب من القفص الصدري، وغمر لها في وسائل الإعلام تشريح في الشريحة الاكتئاب (الشكل 1A الشكل).
  6. مع زوج آخر من ملقط، فهم الهيكل الخارجي في الخلفية البطنية من البطن ويخترق من خلال. الاستيلاء على المبايض في نهاية الخلفي، ثم سحب لهم للخروج من البطن ووضعه في وسائل الإعلام الطازجة على الجانب الآخر من الشريحة الاكتئاب. (الشكل 1A الشكل). تجنب سحب بعيدا القناة الهضمية. تجاهل الذبيحة.
  7. كرر مع غيرها من الذباب الإناث حتى يتم تشريح جميع المبايض. تجاهل الذكور.
  8. مع زوج واحد من ملقط، عقد المبيض في نهاية الخلفي (بالقرب من أكبر غرف البيض)، وباليد الأخرى استخدام زوج من ملقط لقرصة إحدى الغرف البيض الأكثر الأمامية (germarium). (الشكل 1A).
  9. ببطء ولكن بثبات، وسحب سلسلة ovariole من غمد المبيض. الاستمرار في تشريح خارج ovarioles بشكل فردي حتى كل غرف البيض المرجوة هي صemoved.
  10. كرر الخطوات من 1،7-1،8 لجميع المبيضين تشريح.
  11. مرة واحدة كاملة، ونقل ovarioles إلى أنبوب 0.6ml باستخدام ماصة نقل البلاستيكية.
  12. السماح ovarioles تستقر في قاع الأنبوب، ثم الانتقال إلى تحديد وتلطيخ الخطوات.

2. مناعي (IF) تلون Ovarioles

  1. إزالة بعناية وسائل الإعلام من تشريح ovarioles مع ماصة. تأكد من عدم إزالة أي ovarioles أو غرف البيض. ترك ما يقرب من 50 ميكرولتر من ovarioles وسائل الإعلام تشريح.
  2. إضافة 50 ميكرولتر من 16٪ بارافورمالدهيد إلى 150 ميكرولتر من 0.1 M KPO 4 العازلة في أنبوب، وإضافة حل لغرف البيض لاصلاحها. احتضان بينما هزاز لمدة 10 دقيقة. تنبيه: بارافورمالدهيد هي سامة.
  3. إزالة تثبيتي، وشطف مرتين مع 0.5 مل غسل العازلة NP40.
  4. غسل مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما في RT.
  5. الرجوع إلى معيار IF بروتوكول 15 لخطوات لاحقة.
    1. لفترة وجيزة، وبعد التثبيت، إضافةالأجسام المضادة الأولية في التخفيفات المناسبة واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية. يغسل في NP40 عدة مرات، ثم يضاف الأجسام المضادة الثانوية (1: 200 التخفيفات).
    2. يغسل عدة مرات في NP40، ثم إضافة دابي (1: 1،000) لمدة 10 دقيقة، ثم كرر يغسل. مرة واحدة IF البروتوكول هو كاملة، إضافة 200 ميكرولتر من 50٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني لغرف البيض وترك الجلوس في RT لمدة 2 ساعة.
    3. إزالة حل، يحل محله مع 70٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني، وتغطي مع احباط. وضع العينة في 4 ᵒC حتى جاهزة للتركيب. وفي الوقت نفسه، تواصل مع الخطوة 3.

3. إعداد المسبق من الغليسرين جيلي الشرائح

  1. قياس لا يقل عن 4 مل من الجليسرين جيلي باستخدام ملعقة وملء أنبوب ثقافة الخلية الزجاج إلى علامة منتصف الطريق. تذوب الجلسرين جيلي في حمام مائي عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. صب قطرة صغيرة من الجلسرين، ما يقرب من 300 ميكرولتر من محلول المخزون على شريحتين المجهر. باستخدام الأنسجة، وتنتشر في الجلسرين رقيقة لاYER عبر كل الشرائح. هذا يوفر قاعدة ويسمح لسهولة إزالة من الجلسرين جيلي في خطوة 5.6.
  3. قطع رأس الخروج من تصفيتها 1،000 ميكرولتر ماصة. استخدام قطع ماصة لنقل 1،000-1،500 ميكرولتر باب الحارة جيلي الجلسرين ببطء إلى كل شريحة المجهر. احرص على منع الفقاعات.
  4. السماح الشرائح الجلسرين جيلي الجلوس لمدة 5 دقائق على RT لتعيين.
  5. وضع كل شريحة الجلسرين جيلي في 60 مم × 15 مم طبق بتري، وتغطي مع غلاف بلاستيكي. مكان في 4 درجات CO / N. اختياريا، متجر الجليسرين الشرائح جيلي لمدة تصل إلى 5 أيام في 4 درجات مئوية.

4. تصاعد غرف البيض

  1. باستخدام عينات من الخطوة 2.5، ماصة عدة قطرات 3 ميكرولتر من غرف البيض في 70٪ الجلسرين عبر الجلسرين واحد جيلي الشريحة. مواصلة pipetting ل3 قطرات ميكرولتر حتى كل غرف البيض هي على هذه الشريحة. تأكد من كل قطرة يحتوي على الأقل عشرة غرف البيض. وفي الوقت نفسه، حرارة أنبوب ثقافة الجلسرين جيلي في 55 ° C حمام الماء.
  2. ضع الشريحة الجلسرين جيلي مع الغرف البيض تحت المجهر تشريح. ضبط التكبير بحيث قطرة واحدة فقط من غرف البيض في مجال الرؤية (الشكل 1B).
  3. باستخدام إبرة قياس 30 كما ملعقة، والتقاط غرفة مرحلة البيض المطلوب. عند الضرورة، منفصلة غرف البيض المرجوة من سلسلة ovariole باستخدام إبرة بمثابة سكين.
  4. لتجنب الحطام التي قد تتداخل مع التصوير، ونقل غرفة البيض إلى الشريحة الثانية الجلسرين هلام، ومع الأمامية التي تواجه اليسار (الشكل 1E -1). كرر حتى هناك اصطف لا يقل عن سبعة غرف البيض يصل في عمود (الشكل 1C).
  5. تشكيل أعمدة جديدة من سبع حتى يتم نقل جميع غرف البيض المطلوب إلى الشريحة الثانية الجلسرين جيلي.
  6. تمزيق قطعة صغيرة من الأنسجة وتطور. استخدم هذا لامتصاص فائض PBS-الجلسرين من غرف البيض عن طريق لمس طفيفة كل واحد. الحرص على عدم إزالة غرف البيض.
  7. قطعغيض من تصفيتها 200 ميكرولتر ماصة. استخدم هذا لنقل 150 ميكرولتر من الجلسرين جيلي لتغطية كافة الأعمدة من غرف البيض.
    ملاحظة: ويستند كمية من الجلسرين جيلي اللازمة لتغطية الأعمدة على البيض مراحل الغرفة وعدد من الأعمدة. ويمكن تعديل المبلغ.
  8. السماح غرف البيض شنت الجلوس لمدة 5 دقائق على RT حتى الطبقة العليا من الجلسرين جيلي وطدت تماما (1D الشكل).
  9. مكان الشريحة من غرف البيض شنت في 60 مم × 15 مم طبق بتري، وتغطي مع غلاف بلاستيكي. تخزينها في 4 درجات CO / N للسماح للطبقات الجلسرين جيلي ليصلب معا (مكان في الظلام إذا كان هناك قلق حول photobleaching من).

5. إعداد غرف البيض للتصوير

  1. ضع الشريحة من غرف البيض شنت تحت المجهر تشريح. ضبط التكبير بحيث عمود واحد فقط من غرف البيض في مجال الرؤية.
  2. باستخدام مشرط مصغرة بزاوية 45 درجة، وقطع straigخط حزب التحرير على طول الجانب الأيمن من العمود الأول من غرف البيض (وثيقة إلى الجانب الخلفي من غرف البيض). (الشكل 1D-E)
  3. المقبل، وقطع فوق أول غرفة البيض في أعلى وأسفل مشاركة الغرفة البيض في العمود. عند هذه النقطة يجب أن تقطع العمود الغرف البيض من ثلاث جهات.
  4. باستخدام microknife، شريحة على طول الجانب الأيسر من العمود، في أقرب وقت ممكن إلى الجانب الأمامي من غرف البيض (الشكل 1E -3).
  5. ماصة 100 ميكرولتر من البرد 1X PBT على عمود قطع.
  6. استخدام ملعقة فوز جولة لإزالة هلام الجلسرين الزائدة حول ثلاثة جوانب من العمود قطع من غرف البيض وتجاهل، وترك الباقي على الشريحة.
  7. تضاف ملعقة في خفض التي قدمت في الجانب الأمامي من غرف البيض وفصل عمود من كتلة الجلسرين جيلي الابتدائي.
  8. إعداد العينات إما مقلوب (5.8.1) أو تستقيم (5.8.2) المجهري.
    1. لمقلوب المجهر: نقل Tانه عمود من غرف البيض إلى ساترة مع الجانب الأمامي من غرف البيض أسفل. كرر الخطوات من 5،2-5،8 حتى يتم إزالة كافة الأعمدة من الجلسرين معقود الفواكه وتحميلها. إضافة بضع قطرات من 50٪ PBS-الجلسرين على كل كتلة من غرف البيض لمنعهم من الجفاف. غرف الصورة البيض مباشرة على ساترة.
    2. لالمجهر تستقيم: نقل عمود من غرف البيض إلى شريحة المجهر مع الجانب الأمامي مواجهة. كرر الخطوات من 5،2-5،9 حتى يتم إزالة كافة الأعمدة من الجلسرين معقود الفواكه والتي شنت على شرائح المجهر. إضافة بضع قطرات من 50٪ PBS-الجلسرين على كل كتلة من غرف البيض وكتل غطاء مع # 1 ½ ساترة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يسمح طريقة التصوير تستقيم لنا أن نرى بشكل مباشر على تنظيم الخلايا في ظهارة مسامي الأمامية في مرحلة 8. علامة العامة للمصير الخلايا المسام، وغابت عيون (EYA) بروتين، وكذلك DNA علامة النووية دابي، وأظهر حتى التعبير عبر هذا المجال من الخلايا، وأثبتت أن جميع الخلايا يمكن أن ينظر إليه مع شدة تلطيخ مماثلة (الشكل 2B "). البروتينات تنظم ردا على UPD خلوى، ومع ذلك، أظهر أنماط المتغيرة ومستويات التعبير. الخلية القطبية تطلق UPD apically قبل هذه المرحلة من تطور البويضة 16،17، لذلك نحن المتوقع STAT ليتم تفعيل شعاعيا حول الخلايا القطبية، كما كان الحال في بعض الأحيان. في كثير من الأحيان، رغم ذلك، لاحظنا أن أهداف المصب من STAT، بما في ذلك SLBO، كان أنماط التعبير أكثر تعقيدا. على سبيل المثال، مراسل GFP لSLBO التعبير ظهرت في معظم، ولكن ليس كل شيء، الخلايا التي تحيط الخلايا القطبية (الشكل 2B، ونرى مانجي آل قيد الاستعراض وآخرون). لاحظنا اختلافات طفيفة في E-كادهيرين التعبير / التعريب (الشكل 2B)، والتي قد تعكس التغيرات في التصاق، ولكن سوف تكون هناك حاجة إلى مزيد من العمل لتحديد وتفسير هذه النتيجة. وكانت هذه الدقيقة لا يمكن اكتشافها من خلال الجانبي إعادة البناء ثلاثي الأبعاد من غرف البيض نظموا (الشكل 2C-D). كما يمكن تمييز الاختلافات في المحور قمي-القاعدية للخلايا بصيلات باستخدام طريقة تستقيم. استخدمنا خط مراسل لقناة البروتين حلقة Visgun (VSG)، التي هي موجودة في المنطقة قمية أغشية البلازما 18 (الشكل 3A). تم الكشف عن تستقيم أكدت التصوير VSG التعبير في الجزء القمي من الخلايا المسام، بالقرب من أضيق جزء من الخلايا القطبية (الشكل 3B).

لقد وجدنا أيضا أن طريقة التصوير تستقيم يعمل بشكل جيد لعرض الظهارة الأمامية في مرحلة 9 غرف البيض. في هذه جمعةمرحلة opmental، والخلايا الحدود تلتحم معا حول الخلايا القطبية (الشكل 4A). يمكن أن نلاحظ هذه المجموعات ضغط باستخدام نهاية يوم التصوير (الشكل 4B-C). كما هو الحال في المرحلة 8، وجدنا مستويات مماثلة من EYA التعبير في جميع الخلايا الظهارية (لا يظهر)، في حين slbo -GFP وكذلك تفعيلها، STAT النووي تميز الخلايا الحدود متحركة (الشكل 4B و 4C). توطين البروتين FAS3 أشار القطبية واجهة خلية خلية القطبية (الشكل 4B). وبالإضافة إلى ذلك، في كل المراحل 8 و 9 يمكننا أن نرى الخلايا ممرضة كبيرة، كما يتبين من دابي أو phalloidin تلطيخ الأكتين القشرية (لا يظهر)، مما يشير إلى أن هذا الأسلوب أيضا أن تكون مفيدة في دراسة الخلايا الجرثومية أو خط الخلية الجرثومية التفاعلات الخلية -follicle.

الشكل (1)
الشكل 1. تصاعد تستقيم من ذبابة الفاكهة غرفة البيضالصورة. (A) ذبابة الفاكهة المبيض تشير إلى غرفة البيض، غمد، وovariole. ويوضح تصوير الموقف من الملقط لسحب ovariole ببطء من غمد المبيض. معارض أقحم المواقع من الطيران للتشريح. الجانب البطني من ذبابة أنثى يواجه التصاعدي. A-الأمامي، P-الخلفي. (BD) الإجراءات من تصاعد غرف البيض. (B) قطرة صغيرة من غرف البيض في 70٪ الجلسرين-PBS، ينظر تحت stereomicroscope تشريح. السهم الأصفر يشير إلى سلسلة ovariole. رأس السهم الأصفر يشير إلى الغرفة بيضة على حدة. السهم الأحمر يشير إلى حافة الهبوط الجلسرين-PBS. (C) أعمدة غرف البيض رتبت على طبقة رقيقة من طدت جيلي الجليسرين. رأس السهم الأصفر يشير إلى الغرفة بيضة على حدة. (D) وهناك طبقة رقيقة الثانية من ذاب جيلي الجلسرين تغطي أعمدة غرفة البيض تضمينها. خط منقط الأصفر يشير إلى حيث يجب أن تكون تخفيضات بعد O / N الحضانة في 4ᵒC. السهم الأحمر يشير إلىحافة الطبقة الثانية من الجلسرين جيلي. الأرقام الحمراء تشير ترتيب قطع الأعمدة غرفة البيض (لا تظهر أعلى الأفقي وتخفيضات أسفل). الأمامي هو إلى اليسار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. التصوير من الظهارة الأمامية من أوائل مرحلة 8 الغرفة البيض. (A) نظرا الجانبي لمرحلة 8 خلايا الحدود بطيئة (slbo) مراسل الجين غرفة البيض (النمط الجيني: slbo -Gal4، UAS-mCD8-GFP) 19،20، ملطخة دابي والأجسام المضادة الأولية كما هو مبين أو slbo> GFP. أرماديلو (ARM) هو homolog ذبابة من β-كاتينين. الأمامي (A) هو إلى اليسار، والخلفي (P) إلى اليمين. (BB ") نهاية لعلى وجهات نظر من تشا البيضmber. ثلاثة إعادة الإعمار الأبعاد من الصور Z-كومة من مرحلة 8 slbo- مراسل الجين غرفة البيض شنت تستقيم، ملطخة الأجسام المضادة الأولية كما هو مبين. النجمة أرجواني تشير الخلايا القطبية. يصادف دابي النوى. (B ') slbo> يتم التعبير عن GFP فقط في الخلايا الحدود الظني (SLBO). E-كادهيرين (E-CAD) هو جزيء التصاق مترجمة إلى الغشاء والمخصب في الخلايا الحدود. (ب '') عيون غياب (EYA) تم العثور أعرب بالتساوي في نوى كل الخلايا المسام باستثناء خلايا القطبية. (C) عرض قياسي الجانبي لslbo -reporter مرحلة 8 الغرفة البيض الملون مع دابي (الأزرق) والأجسام المضادة ضد GFP (SLBO والأخضر)، ARM (الحمراء)، وFAS3 (أبيض). أقحم يظهر محاور: المحور X هو أسفل (السهم الأخضر)، Y-محور هو نحو اليسار (السهم الأحمر)، وZ-محور هو نحو المشاهد (الأزرق) (D) وعلى سبيل المقارنة إلى تقنية جديدة. ، وتظهر هذه اللوحة وهو بجمعية العقارات النهاية على رأيتيد قبل إعادة البناء ثلاثي الأبعاد، وتجهيزها مع برنامج Volocity، وذلك باستخدام Z-كومة من الصور الجانبية للغرفة البيض هو مبين في C. أقحم يظهر المحاور تحولت: المحور X هو أسفل (السهم الأخضر)، Z-المحور الآن نحو اليسار (السهم الأزرق)، والمحور Y هو نحو المشاهد (الأحمر). هي واضحة الخلايا الفردية نظرا لدقة منخفضة في Z-محور. وبالتالي، فإن النهج الجديد هو مبين في B يمثل تحسنا كبيرا التصوير. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. مقارنة البروتين التعبير في المجالات الجانبية والأمامية من ظهارة مسامي من غرفة البيض مرحلة 8. (A) التعمير وجهة نظر الجانبي للمرحلة 8 الغرفة البيض من visgun (VSG) -GFP مراسل <سوب> 21-23، ملطخة عن الأجسام المضادة الموجهة ضد GFP أو ARM (أبيض). يصادف دابي النوى باللون الأزرق، ونوى الخلايا ممرضة كبيرة واضحة. VSG يموضع إلى القنوات حلقة من خلايا بصيلات (الخضراء). (BB ') النهائي على آراء وchamber.Three الأبعاد إعادة الإعمار البيض من Z-كومة من الصور لمرحلة 8 VSG-GFP غرفة مراسل البيض، ملطخة الأجسام المضادة الأولية كما هو مبين. تم الكشف عن بروتين SLBO (الحمراء) في كل من نوى الخلايا القطبية والحدود. يصادف ARM أغشية الخلايا المسام وإثراء في الخلايا الحدود؛ دابي تسميات نوى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4. التصوير في وقت مبكر من مرحلة 9 غرف البيض. (A) جهة النظر الجانبي من أوائل مرحلة 9 SLبو -reporter البيض الغرفة. وقد تتجمع الخلايا الحدود (الخضراء) داخل الظهارة الأمامية (السهم الأبيض). قبل الميلاد) نهاية لعلى آراء الدوائر البيض. ثلاثة الأبعاد إعادة الإعمار من Z-كومة من الصور من مرحلة مبكرة 9 الجين slbo- غرفة مراسل البيض، ملطخة باستخدام الأجسام المضادة الأولية موجهة ضد بروتينات كما هو مبين أو GFP. (B) slbo> يتم التعبير عن GFP في الخلايا الحدود (الأخضر) ، في حين Fasciclin 3 (FAS3، أبيض) يموضع للغاية لالغشاء بين اثنين من الخلايا القطبية. دابي يمثل نواة (الأزرق). النجمة أرجواني تشير الخلايا القطبية. (C) كلا النووية (تفعيل) STAT وslbo> تم العثور على GFP التعبير فقط في الخلايا الحدود، في حين E-كادهيرين (E-CAD) يصادف أغشية الخلايا المسام، ودابي يشير إلى نوى. النجمة أرجواني تشير الخلايا القطبية. وتظهر نتائج تلطيخ بشكل فردي لslbo> GFP (C ') وSTAT (C' ') الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نحن هنا تصف طريقة لتركيب وصورة صغيرة، وتطوير غرف البيض من منظور نهاية جرا. يتم تحسين أساليب مشتركة لغرف البيض التصوير وجهات النظر الجانبية وتسمح في المقام الأول التصور الدقيق للخلايا بصيلات ميديو الاطراف عندما ملطخة الأجسام المضادة الفلورسنت. استخدام Z-مداخن أو 3-D إعادة البناء يساعد في عرض طائرات التنسيق متعددة، ولكن لا يزال غير كاف لقرار الفرعية الخلوي للأقطاب الدوائر البيض بيضاوي الشكل (الشكل 2D). في حين أن هذا يمكن التغلب عليها جزئيا مع أحدث تقنيات الفحص المجهري مثل فائقة الدقة والتصوير، وهذه الطرق مكلفة وغير متوفرة دائما. تكيفنا بروتوكولات التصوير تستقيم لذبابة الفاكهة الأجنة 24،25 لاستخدامها في غرف البيض أصغر من ذلك بكثير. هناك العديد من التعديلات الرئيسية في طريقة لحساب حجم أصغر بكثير من غرف البيض مقارنة مع الأجنة. ومن المكونات الرئيسية للتقنية وصفها هو separ الماديأوجه الغرف الفردية، التي لا يشترط للأجنة. تغيير آخر هو استخدام الشريحة الثانية الجلسرين جيلي خلال تركيب (4.4). حجم غرف البيض والتعلق من خلال خلايا ساق لغرف بيضة أخرى يتطلب التلاعب مع الإبرة ويؤدي إلى تدمير الجلسرين جيلي. ولذلك، يجب نقل غرف البيض مع إبرة لشريحة جيلي الغليسرين جديدة لتركيب (4.5). التصوير تستقيم يسمح لرؤية المناطق واضحة من جانب جهات النظر الجانبي أو أفقية، وكشف عن معلومات جديدة حول تنظيم الأنسجة أثناء نمو البويضات. وأدى ذلك إلى رؤى جديدة حول الأحداث الزخرفة، ونقترح أن هذه الطريقة يمكن أن تستخدم لاستكشاف جوانب إضافية من مراحل تكوين البويضات.

لقد حددت عدة خطوات حاسمة في نجاح تصاعد تستقيم. وجدنا أن من الضروري أن إزالة السلاسل ovariole تماما من غمد أثناء تشريح، ويجب قطع غرف البيض المطلوب من ovariolسلسلة الإلكترونية. الفشل في غرف بيضة خالية من ovariole يجعل من الصعب التقاط الصحيحة غرفة مرحلة البيض (الخطوة 4.3). ونحن نوصي العمل مع كميات صغيرة من الجلسرين جيلي في وقت كتبها aliquoting ذلك في أنابيب. لا تسخن الجليسرين أكثر من الهلام مرتين بسبب التدفئة المتكررة تتغير اتساقه ويمنعها من ترسيخ بشكل صحيح (3.1). استخدام النصائح فلتر لمنع الشفط جيلي في pipettors. السماح الجلسرين جيلي ليصلب على شريحة المجهر لا يقل عن 8 ساعة على 4 درجات مئوية. تقصير هذه الخطوة يجعل تصاعد غرف البيض صعبة (3.6). من المهم للتأكد من استيعاب جميع PBS-الجلسرين من غرف البيض شنت (4.6). إذا الكثير من السائل هو الحاضر، ويمنع الطبقة العليا من الجلسرين جيلي من الانضمام إلى أسفل. في هذه الحالة، قد غرف البيض تطفو وتغيير الموقف. للحصول على أفضل نتائج التصوير، والغليسرين بنات جيلي يجب أن تقطع أقرب إلى الجانب الأمامي من غرف البيض ممكن جسديا (5.4). الكثير من جيلي الجلسرين على هذاانخفاض الجانب جودة الصورة نظرا لزيادة المسافة بين العينة وساترة.

هناك بعض المحاذير من تصاعد عينات في الجليسرين جيلي. لأحد، لأنه يزيد من المسافة بين العينة والهدف. هذه المسافة في تضخم عالية، وخاصة أثناء استخدام الهدف النفط، يمكن أن تخلق صعوبة التركيز على العينة، والذي يمكن أن يؤدي إلى سوء جودة الصورة. ونظرا لهذا، من المهم جدا لاقامة الجليسرين بنات جيلي قريبة جدا من غرف البيض. على الرغم من أن الهلام الجلسرين واضح بصريا، فإنه لا defract بعض الضوء. الحد آخر هو أن إشارة الأجسام المضادة قد يتم تخفيض نتيجة لمزيج من العمل عن بعد للهدف وسمك من الجلسرين جيلي. زيادة لتركيز كل من الأجسام المضادة الابتدائية و / أو الثانوية يمكن أن تساعد أحيانا في الحد من هذه المشكلة. على الرغم من أنه يختلف حسب الأجسام المضادة، ونحن عادة المكتسبة أفضل الصور باستخدام ضعف تركيز النمل الثانويibody في التصوير تستقيم مقارنة مع الكمية المستخدمة في التصوير الجانبي القياسي. نحن نعرف من أي بدائل الجليسرين الهلام لتركيب غرف البيض في وضع مستقيم. وحوكم مواد أخرى مثل الاغاروز وبولي أكريلاميد ولكن كل defracted ضوء أشد، مما تسبب في فقدان الوضوح بينما التصوير. وهكذا، هذه التقنية المتزايدة هي أفضل ما هو متاح حاليا للاستخدام مع المجهر القياسية.

في حين ركزنا على مراحل مواصفات الخلية الحدود والشروع في الحركة، يمكن أن تستخدم غرف البيض من مراحل مختلفة في هذا البروتوكول فقط مع بعض التعديلات الطفيفة. الأهم من ذلك، وهو المقياس من الإبرة يمكن تغيير للتلاعب غرف البيض من أحجام مختلفة ومراحل النمو. لمراحل 7-10، تعمل إبرة 30 G بشكل جيد لغرف البيض تناسب بسهولة في شطبة. لفي وقت سابق غرف مرحلة بيضة أكبر إبرة مقياس (أصغر شطبة) وينبغي أن تستخدم وبالمثل مقياس أصغر (شطبة أكبر) يجب أن تستخدم لاحقا الحاديغرف البيض الذين تتراوح أعمارهم بين. أن أي شيء في مرحلة تنموية القديمة تكون كبيرة جدا لهذا قياس (4.3). أيضا أي جانب من الغرفة البيض ولا يمكن تصوير باستخدام هذه التقنية عن طريق ترتيب كتلة الجلسرين جيلي من غرف البيض مع مجال الاهتمام نحو الهدف.

تصاعد عينات صغيرة معتمدة في الجلسرين جيلي لديه القدرة على أن تكون مفيدة في سياقات متعددة. ويمكن استخدام هذه الاستراتيجية إلى تصور أنواع مختلفة من والأنسجة الصغيرة الثابتة من الكائنات الحية الأخرى، وخصوصا عندما تكون كافية لفحص عينات من وجهة نظر واحدة فقط. بمجرد يتقن هذه التقنية، يمكن استخدامه لمشاهدة غرف البيض في أي زاوية المطلوب، اعتمادا على كيفية يتم وضع البيض في غرف هلام. هذا الأسلوب يسمح للجهات النظر فريدة خلق فهم ثلاثي الأبعاد أفضل بكثير من التنظيم الخلوية. التصوير تستقيم من غرف البيض بالتزامن مع مناعي تلوين الأجسام المضادة يسمح للكشف الدقيق للبروتينالصورة وخلية خلية الاتصالات التي لن يكون ممكنا في ظل ظروف قياسية متزايدة. ونحن نخطط لاستخدام هذا الأسلوب في رسم التفاعلات خلية خلية التي تسمح التحام ومفرزة من الكتلة خلية الحدود من ظهارة. في هذا الوقت، وتقنية التصوير تستقيم لا يمكن أن تستخدم مع عينات حية، ولكن نحن نعمل أيضا للتغلب على هذه العقبة. نتوقع أن يكون هذا الأسلوب ينطبق أيضا على دراسة لجوانب أخرى من ذبابة الفاكهة مراحل تكوين البويضات، أو يمكن أن تتكيف مع صورة الأنسجة الصغيرة الأخرى في زوايا جديدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4°C.
16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 15710 methanol-free to preserve GFP fluorescence
30G x 1/2 inch needle  VWR BD305106 Regular bevel
Active Dry Yeast Genesee Scientific 62-103 To fatten female flies
Bovine Serum Albumin PAA-cell culture company A15-701 Used in NP40 Wash Buffer
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11295-10 Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma Aldrich D9542 5 mg/ml stock solution  
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16140-071 Added to supplement dissection medium (10%) 
Glass culture tube VWR 47729-576 14 ml
Glass Depression Slides VWR 470019-020 1.2 mm Thick, Double Cavity
Glycerin Jelly  Electron Microsocpy Sciences 17998-10 Mounting media
Glycerol IBI Scientific IB15760 70% in PBS
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I3021-500ML (interchangable for Nonidet P-40)  Used in NP40 Wash Buffer 
Leica Fluorescent Stereoscope  Leica Microsystems
Leica SP5 Confocal Microscope Leica Microsystems 40x/0.55NA dry objective 
Micro spatula  VWR 82027-518 Stainless steel
Microscope Slide VWR 16004-368 75x25x1 mm
NP40 Wash Buffer 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide
Penicillin-Streptomycin-Glutamine Life Technologies 10378-016 Added to supplement dissection medium (0.6X)
Petridish- Polysterine, sterile VWR 82050-548 60 W x 15 H mm
Phosphate Buffer Saline Sigma Aldrich P3813-10PAK 10 packs of Powder
Potassium phosphate dibasic Sigma Aldrich P3786-500G Used in 0.1 M KPO4 Buffer 
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P9791-500G Used in 0.1 M KPO4 Buffer 
Name Company Catalog Number Comments
Schneider’s Insect Medium Life Technologies
11720018		 With L-glutamine and sodium bicarbonate
Sodium azide Sigma Aldrich S2002-25G Used in fluorescent antibody staining
Sodium chloride Sigma Aldrich S3014-500G Used in NP40 Wash Buffer
TRIS-HCl IBI Scientific IB70144 1 M TRIS-HCl, pH 7.4
Volocity 3D Image Analysis Software PerkinElmer For processing confocal Z-stacks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  2. Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
  3. Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).
  4. Bilder, D., Haigo, S. L. Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg. Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).
  5. Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).
  6. Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
  7. Montell, D. J. Border-cell migration: the race is on. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).
  8. Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila. Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).
  9. Ghiglione, C., et al. The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis. Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).
  10. Denef, N., Schüpbach, T. Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium. Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).
  11. Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis. Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).
  12. Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP. Cell. 71 (1), 51-62 (1992).
  13. Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium. Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).
  14. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
  15. McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells. Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).
  16. Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness. Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).
  17. Hayashi, Y., et al. Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen. Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).
  18. Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells. J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).
  19. Rørth, P., et al. Systematic gain-of-function genetics in Drosophila). Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).
  20. Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
  21. Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis. Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).
  22. Quiñones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
  23. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
  24. Belu, M., et al. Upright imaging of Drosophila embryos. J Vis Exp. (43), (2010).
  25. Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 97،
التصوير تستقيم من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; غرف البيض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manning, L., Starz-Gaiano, M.… More

Manning, L., Starz-Gaiano, M. Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers. J. Vis. Exp. (97), e52636, doi:10.3791/52636 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter