Introduction
Etude de Drosophila melanogaster a fourni de grandes connaissances dans la régulation génétique d'un large éventail de phénomènes. En particulier, il ya eu des recherches approfondies sur le développement des œufs, parce oogenèse fournit un moyen souple pour enquêter sur de nombreux processus de développement différents, y compris les motifs des tissus, des changements de polarité cellulaire, la commutation du cycle cellulaire, et la réglementation de translation 1,2,3,4. Un événement important au cours de l'ovogenèse morphogénétique est la spécification, l'acquisition de la motilité et la migration d'un ensemble de cellules appelées cellules frontalières (examinés dans cinq). Depuis la migration cellulaire est un élément clé de la morphogénèse des animaux, et parce que la régulation génétique de ce processus est bien conservé, des mécanismes déterminés mouches sont susceptibles d'être importants dans d'autres contextes. Ainsi, nous étudions le contrôle moléculaire de la migration cellulaire de frontière. Pour nos études, nous avons développé une nouvelle méthode pour observer les pôles antérieurs des œufs en développement,où les cellules se posent aux frontières, d'examiner comment elles se développent en détail.
Dans l'ovaire, chambres d'œufs à divers stades de développement existent le long des chaînes appelées ovarioles, qui sont entourées d'une gaine mince (figure 1A). Chaque chambre de l'œuf va se poursuivre pour former un œuf. Au cours de l'ovogenèse, plusieurs types de cellules différents doivent se développer de manière coordonnée. Le D. chambre melanogaster d'oeuf se compose de 16 cellules germinales, dont un ovocyte, entouré par une seule couche de l'épithélium folliculaire 6. Un petit nombre de cellules spécialisées, appelées cellules polaires, se pose au antérieures et postérieures pôles de l'épithélium. Les cellules de bordure 6-8 proviennent de l'épithélium antérieur de la chambre d'oeuf, induite par les cellules polaires 5,7. À la mi-ovogenèse (étape 9), les cellules de bordure se détachent de leurs voisins et migrent entre les cellules nourricières pour atteindre l'ovocyte à la partie postérieure de la chambre d'oeuf 5,7. Ce mouvement doit être accomplietandis que les mailles de bord restent dans un cluster polaires entourant deux cellules non-mobiles, ce qui rend ce type de migration cellulaire collective. Migration réussie de la grappe de cellules de la frontière assure le bon développement du micropyle de la coquille d'oeuf, qui est nécessaire pour la fécondation.
Les cellules polaires antérieures instruisent le destin des cellules de la frontière en activant une cascade de transduction du signal. Cellules sécrètent une cytokine polaires, non apparié (UPD), qui se lie à un récepteur transmembranaire, Domeless (DOME), sur les cellules de follicules voisin lors de l'étape 8 de développement des ovocytes 8,9. La liaison de UPD provoque Janus tyrosine kinase (JAK) de phosphoryler le transducteur de signaux et activateur de la transcription (STAT) 8,10,11. STAT se déplace ensuite vers le noyau pour activer la transcription. Cellules frontaliers lents (SLBO) est un facteur de transcription qui est une cible transcriptionnelle directe de STAT et est également requis pour la migration des cellules de la frontière 12. Vues latérales de chambres d'œufs indiquent tactivité de STAT chapeau est réglementée dans un gradient à travers l'épithélium antérieure 8,11,13. Cellules folliculaires proches des cellules polaires ont les plus hauts niveaux de activé STAT, ainsi ils deviennent des cellules frontières et envahissent le tissu de la lignée germinale adjacente.
Pour comprendre comment les cellules frontières sont spécifiées à l'intérieur et se détachent de l'épithélium, nous avons besoin d'observer comment le tissu est organisé. Si nous considérons chambres d'œufs dans une perspective antérieure sur, nous nous attendrions à symétrie radiale de l'activité de STAT dans les cellules folliculaires qui entourent les cellules polaires. Une vue en bout serait également montrer avec plus de précision les différences de protéines membranaires et des interfaces cellule-cellule avant et pendant le détachement que de comparer les cellules dans différents plans focaux. Parce que les chambres d'oeuf sont oblongues et fixées les unes aux autres par les cellules de la tige, ils se installent sur des lames latéralement, ce qui rend difficile l'observation de l'architecture antérieure. Ainsi, beaucoup d'informations sur les cellules au niveau des pôles de la chambre d'oeuf aété déduit de vues latérales. Bien que certaines informations peut être obtenue par algorithmiques reconstructions 3-D de sections optiques, diffusion de la lumière, de photoblanchiment, et les limites les plus pauvres de la résolution de l'axe Z rendre cette information moins détaillée et fiable en l'absence de techniques coûteuses comme la microscopie de super-résolution 14 . D'autres types de formation d'image sur la base de l'article (par exemple, la microscopie électronique ou microtome découpe) exigent beaucoup de manipulation de tissus, y compris la déshydratation, ce qui augmente la probabilité pour les artefacts. Ainsi, nous avons développé une nouvelle méthode pour l'image D. chambres melanogaster d'œufs tandis que debout. Cette méthode a déjà fait ses preuves utiles à élucider comment les cellules mobiles sont voués (voir résultats représentatifs et Manning et al, en cours d'examen), et est susceptible d'être plus largement utile dans les études d'autres aspects de l'ovogenèse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dissection de ovarioles
- Transférer environ quinze 2-4 jours d'âge mouches femelles et quelques hommes d'une mouche des aliments frais flacon avec de la levure sèche active ajoutée. Utilisez le coton comme une prise pour les flacons, et ajouter quelques gouttes d'eau au coton pour maintenir l'humidité élevée.
- Lieu flacon dans un incubateur à 25 ° pour 14-16 h pour maximiser le nombre de l'étape 8-10 chambres d'œufs.
NOTE: Le temps d'incubation varie selon la température et stade désiré. - Préparer les médias de dissection, 0,1 M KPO 4 et NP40 solutions au besoin pour le lendemain (voir Matériaux).
- Anesthésier vol utilisant le CO 2, et le placer sous un microscope de dissection. Pipet quelques gouttes de médias de dissection dans chaque cavité dans la glissière de la dépression de verre.
- Tenez pince dans chaque main à un angle d'environ 30 ° vers le haut de table et orienter une mouche femelle avec les ailes vers le bas. Avec votre main non dominante, ramasser la femelle aide d'une pince, son saisissant à la unenterior de l'abdomen, près du thorax, et son plonger dans les médias de dissection dans la dépression coulisse (figure 1A encadré).
- Avec l'autre paire de pinces, saisir l'exosquelette à la partie postérieure de l'abdomen ventral et percer. Prenez les ovaires à l'extrémité postérieure, puis de les sortir de l'abdomen et le placer dans les médias frais de l'autre côté de la glissière de la dépression. (Figure 1A encadré). Évitez de tirer en dehors de l'intestin. Jeter la carcasse.
- Répéter l'opération avec les autres mouches femelles jusqu'à ce que toutes les ovaires sont disséqués. Jeter les mâles.
- Avec une paire de pinces, maintenez un ovaire à l'extrémité postérieure (près des plus grandes salles d'œufs), et avec l'autre main utiliser une paire de pinces pour pincer l'une des chambres les plus antérieures d'œufs (de germarium). (Figure 1A).
- Lentement mais sûrement, tirer une chaîne ovariole hors de la gaine ovaire. Continuer à disséquer ovarioles individuellement jusqu'à ce que toutes les chambres d'œufs souhaités sont removed.
- Répétez les étapes 1.7 à 1.8 pour toutes les ovaires disséqués.
- Une fois terminé, transférer ovarioles dans un tube de 0,6 ml à l'aide d'une pipette de transfert en plastique.
- Laissez ovarioles se déposent au fond du tube, puis passez à fixation et de coloration étapes.
2. immunofluorescence (IF) Coloration des ovarioles
- Retirez délicatement les médias de dissection de ovarioles avec une pipette. Veillez à ne pas supprimer tous les ovarioles ou chambres d'œufs. Laissez environ 50 pi de ovarioles et les médias de dissection.
- Ajouter 50 ul de 16% de paraformaldéhyde à 150 ul de 0,1 M KPO 4 tampon dans un tube, et ajouter la solution à des chambres d'oeuf pour les corriger. Incuber tout bascule pour 10 min. ATTENTION: paraformaldéhyde est toxique.
- Retirer fixateur et rincer deux fois avec 0,5 ml de tampon de lavage de NP40.
- Laver deux fois pendant 15 min chacune à la température ambiante.
- Reportez-vous à la norme si le protocole 15 pour les étapes suivantes.
- Brièvement, après fixation, ajouteranticorps primaires aux dilutions appropriées et incuber O / N à 4 ° C. Laver à NP40 à plusieurs reprises, puis ajouter des anticorps secondaires (1: 200 dilutions).
- Lavez plusieurs fois dans NP40, puis ajouter DAPI (1: 1000) pendant 10 min, puis répétez lavages. Une fois que si le protocole est complète, ajouter 200 ul de 50% de glycérol dans du PBS pour chambres d'oeufs et laisser reposer à température ambiante pendant 2 h.
- Retirer la solution, le remplacer par 70% de glycérol dans du PBS, et couvrir de papier d'aluminium. Placez échantillon à 4 ᵒC jusqu'au moment pour le montage. Pendant ce temps, passez à l'étape 3.
3. Préparation préalable de glycérine Jelly Diapositives
- Mesurer au moins 4 ml de glycérine gelée aide d'une spatule et remplir un tube de culture de cellules de verre pour la marque à mi-chemin. Faire fondre la gelée de glycérine dans un bain d'eau à 55 ° C pendant 30 min.
- Verser une petite goutte de glycérol, environ 300 pi, de la solution de réserve sur deux lames de microscope. Utiliser un tissu, répartis glycérol dans une fine layer sur chacune des diapositives. Ceci fournit une base et permet de retirer facilement la glycérine gelée à l'étape 5.6.
- Coupez la pointe de d'une pointe de pipette 1000 pi filtré. Utilisez copier pointe de la pipette pour transférer 1000-1500 ul de la glycérine chaude gelée lentement à chaque lame de microscope. Prenez soin d'éviter les bulles.
- Laissez diapositives glycérine gelée reposer pendant 5 min à température ambiante à définir.
- Placez chaque diapositive glycérine gelée dans 60 mm × 15 mm plat de Pétri et couvrir d'une pellicule plastique. Lieu à 4 ° CO / N. Eventuellement, magasin glycérine diapositives de gelée jusqu'à 5 jours à 4 ° C.
4. Montage Chambers oeufs
- En utilisant des échantillons de l'étape 2.5, pipette quelques gouttes 3 pi de chambres d'œufs dans 70% de glycérol dans une diapositive de la gelée de glycérine. Continuer pipetage 3 gouttes ul jusqu'à ce que toutes les chambres d'oeufs sont sur cette diapositive. Assurez-vous que chaque goutte contient au moins dix chambres d'œufs. Pendant ce temps, chauffer un tube de culture de glycérine gelée dans un bain-marie à 55 °.
- Placer la lame de gelée de glycérine avec des chambres d'oeuf sous un microscope à dissection. Ajuster le grossissement de telle sorte que seule une goutte de chambres d'oeuf est dans le champ de vision (figure 1B).
- En utilisant une aiguille de calibre 30 comme une cuillère, ramasser la chambre d'œufs de stade désiré. Si nécessaire, les chambres d'œufs souhaités séparée d'une chaîne de ovariole utilisant l'aiguille comme un couteau.
- Pour éviter les débris qui peuvent interférer avec l'imagerie, transférer la chambre de l'œuf à la deuxième diapositive glycérine gelée, à la face antérieure gauche (figure 1E -1). Répéter jusqu'à ce que il ya au moins sept chambres d'oeuf alignés dans une colonne (figure 1C).
- Former de nouvelles colonnes de sept jusqu'à ce que toutes les chambres d'oeuf désirées sont transférées à la seconde glissière de glycérine gelée.
- Déchirez un petit morceau de tissu et la torsion. Utilisez cette option pour absorber l'excès de PBS-glycérol des chambres d'œufs en effleurant chacun. Prenez soin de ne pas supprimer les chambres d'œufs.
- Coupez lepointe d'une pointe de pipette 200 pi filtré. Utilisez cette option pour transférer 150 pi de glycérine gelée pour couvrir toutes les colonnes de chambres d'œufs.
REMARQUE: La quantité de glycérine gelée nécessaire pour couvrir les colonnes est basé sur les étapes de la chambre d'œufs et le nombre de colonnes. Montant peut être ajustée. - Laissez chambres d'œufs montés reposer pendant 5 min à température ambiante jusqu'à ce que la couche supérieure de la glycérine gelée est complètement solidifié (figure 1D).
- Placer la lame de chambres d'œufs montés dans une boîte de 60 mm × 15 mm de Pétri et couvrir d'une pellicule plastique. Conserver à 4 ° CO / N pour permettre aux couches de gelée de glycérine pour solidifier ensemble (lieu dans l'obscurité se il est préoccupé par photoblanchiment).
5. Préparation des Chambres oeufs for Imaging
- Placer les lames de chambres d'oeufs montés sous un microscope à dissection. Ajuster le grossissement de telle sorte que seulement une colonne de chambres d'oeuf est dans le champ de vision.
- L'utilisation d'un angle de 45 ° scalpel miniature, couper un Straight ligne le long du côté droit de la première colonne de chambres d'oeuf (à proximité de la face postérieure des chambres d'oeuf). (Figure 1D-E)
- Ensuite, couper au-dessus de la première chambre d'oeuf en haut et en dessous de la dernière chambre de l'oeuf dans la colonne. A ce stade, la colonne de chambres d'oeuf doit être coupée sur trois côtés.
- Utilisation d'un microknife, tranche le long du côté gauche de la colonne, aussi près que possible de la face antérieure des chambres d'oeufs (Figure 1E) -3.
- Introduire à la pipette 100 pi de froid 1X PBT sur la colonne de coupe.
- Utilisez une spatule à bords arrondis pour éliminer l'excès de glycérine gelée autour de trois côtés de la colonne de chambres d'œufs et jetez la coupe, en laissant le reste de la diapositive.
- Insérer la spatule dans la coupe faite à la face antérieure de chambres d'oeuf et séparer la colonne du bloc de glycérine gelée primaire.
- Préparer les échantillons pour les deux inversées (5.8.1) ou verticale (5.8.2) microscopie.
- Pour microscope inversé: t Transfertil colonne de chambres d'oeufs à une lamelle avec le côté antérieur de chambres d'œufs vers le bas. Répéter les étapes 5.2 à 5.8 jusqu'à ce que toutes les colonnes de la glycérine gelée ont été enlevés et monté. Ajouter quelques gouttes de 50% de PBS-glycérol sur chaque bloc de chambres d'oeuf pour les empêcher de se dessécher. Chambres image d'œufs directement sur la lamelle.
- Pour microscope droit: Transférer la colonne de chambres d'oeuf à une lame de microscope avec le côté antérieur vers le haut. Répéter les étapes 5.2 à 5.9 jusqu'à ce que toutes les colonnes de la glycérine gelée ont été retirés et montés sur des lames de microscope. Ajouter quelques gouttes de 50% de PBS-glycérol sur chaque bloc de chambres d'oeufs et des blocs de couverture avec un ½ lamelle # 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La méthode d'imagerie verticale nous a permis de voir directement l'organisation des cellules de l'épithélium folliculaire antérieure à l'étape 8. Un marqueur général pour le destin des cellules du follicule, l'Absent Eyes (EYA) protéine, ainsi que le marqueur d'ADN nucléaire DAPI, a montré même l'expression à travers ce champ de cellules, et ont montré que toutes les cellules ont pu être observés avec des intensités de coloration similaires (figure 2B "). Les protéines régulées en réponse à l'UPD de cytokines, cependant, ont montré des motifs variables et des niveaux d'expression. Cellules polaires libèrent UPD apicale avant ce stade de développement de l'oeuf 16,17, nous nous attendions donc STAT pour être activé radialement sur les cellules polaires, ce qui était parfois le cas. Souvent, cependant, nous avons observé que cibles en aval de STAT, y compris SLBO, eu profils d'expression plus complexes. Par exemple, le rapporteur GFP pour l'expression SLBO apparu dans la plupart, mais pas tous, les cellules qui entourent les cellules polaires (figure 2B, et voir MannING et al cours de révision). Nous avons remarqué que de légères différences dans la E-cadhérine expression / localisation (Figure 2B '), qui peut refléter des changements d'adhérence, mais d'autres travaux seront nécessaires pour quantifier et à interpréter ce résultat. Ces nuances ne étaient pas détectables par latérale reconstruction tridimensionnelle de chambres d'oeuf étagées (Figure 2C-D). Les différences dans l'axe apicale-basale des cellules folliculaires peuvent également être distinguées en utilisant la méthode à la verticale. Nous avons utilisé une lignée de rapporteur pour la protéine de canal annulaire Visgun (VSG), qui est présent dans la région apicale de la membrane plasmique 18 (figure 3A). Montant imagerie confirmé VSG expression a été détectée dans la partie apicale des cellules folliculaires, près de la partie la plus étroite des cellules polaires (figure 3B).
Nous avons également constaté que la méthode d'imagerie verticale fonctionne bien pour voir l'épithélium antérieure à l'étape 9 chambres d'œufs. A ce developmental stade, les cellules de frontière coalescence ensemble autour des cellules polaires (Figure 4A). Nous avons pu observer ces groupes compactés en utilisant le bout sur l'imagerie (figure 4B-C). Comme à l'étape 8, nous avons trouvé des niveaux similaires d'expression EYA dans toutes les cellules épithéliales (non représenté), tandis que slbo GFP ainsi que activé, STAT nucléaire ont marqué les cellules frontières mobiles (figure 4B et 4C). La localisation des protéines FAS3 indiqué l'interface cellule-cellule polaire polaire (figure 4B). En outre, dans les deux étapes 8 et 9 nous pouvions voir les grandes cellules nourricières, comme indiqué par DAPI ou phalloïdine-coloration de l'actine corticale (non représenté), ce qui suggère cette méthode sera également utile dans l'étude des cellules germinales ou les cellules germinales -follicle interactions cellulaires.
Figure 1. montage vertical de la chambre d'oeuf Drosophilas. (A) Drosophila ovaire indiquant chambre de oeuf, gaine, et ovariole. Représentation illustre la position des pinces pour tirer le ovariole lentement de la gaine ovaire. Encart montre le positionnement de la mouche pour la dissection. Face ventrale de mouche femelle vers le haut. A-antérieur, P-postérieur. (BD) Procédure de montage des chambres d'oeufs. (B) Une petite goutte de chambres d'oeuf dans 70% de glycérol-PBS, vu sous un stéréomicroscope à dissection. La flèche jaune indique une chaîne ovariole; flèche jaune indique une chambre d'oeuf individuel. La flèche rouge indique le bord de la goutte de glycérol-PBS. (C) Colonnes de chambres d'oeufs disposés sur mince couche de gelée de glycérine solidifié. Flèche jaune indique une chambre d'oeuf individu. (D) Une deuxième couche mince de fondre la gelée de glycérine couvre les colonnes de la chambre de l'œuf à les intégrer. Ligne pointillée jaune indique où les coupes devraient être faites après O / N incubation à 4ᵒC. La flèche rouge indique labord de la seconde couche de glycérine gelée. Les chiffres rouges indiquent l'ordre de couper les colonnes de la chambre de l'oeuf (supérieure horizontale et des réductions de fond ne sont pas représentés). Antérieure est à gauche. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. imagerie de l'épithélium antérieure d'une chambre stade précoce de 8 oeuf. (A) de la vue latérale d'une 8 cellules frontalières lents (slbo) chambre de stade de gène rapporteur de l'œuf (génotype: slbo -Gal4, UAS-mCD8-GFP) 19,20, colorées avec DAPI et des anticorps primaires comme indiqué ou pour slbo> GFP. Armadillo (ARM) est l'homologue de la mouche de β-caténine. Antérieure (A) se trouve à gauche, postérieur (P) vers la droite. (BB ") End-on vues d'un cha oeufmbre. Reconstruction tridimensionnelle d'images Z-empilement d'une chambre 8 slbo- d'oeuf de gène rapporteur de phase monté en position verticale, colorées avec des anticorps primaires comme indiqué. Astérisques indiquent les cellules Magenta polaires. DAPI marque les noyaux. (B ') slbo> GFP est exprimé uniquement dans les cellules de la frontière présomptifs (SLBO). La E-cadhérine (E-CAD) est une molécule d'adhésion localisée à la membrane et enrichie en cellules de bordure. Yeux (B '') Absent (de EYA) se trouve uniformément exprimé dans les noyaux de toutes les cellules folliculaires, à l'exception des cellules polaires (C). Mode d'affichage standard latérale d'un stade de 8 chambre de oeuf slbo de -reporter colorées avec DAPI (bleu) et des anticorps contre la GFP (SLBO, vert), ARM (rouge), et FAS3 (blanc). Encart montre les axes: l'axe X est en baisse (flèche verte), l'axe Y est vers la gauche (flèche rouge), et l'axe Z est vers le spectateur (bleu) (D) Pour comparaison avec la nouvelle technique. , ce panneau montre un crea fin en vueted par une reconstruction tridimensionnelle, traitées avec un logiciel Volocity, en utilisant une pile de Z-images latérales de la chambre d'oeuf représenté sur C. En médaillon montre les axes tournés: l'axe X est vers le bas (flèche verte), l'axe Z est maintenant vers la gauche (flèche bleue), et l'axe Y est la direction de visualisation (rouge). Les cellules individuelles sont floues en raison de faible résolution dans l'axe Z; Ainsi, la nouvelle approche montré dans B représente une amélioration significative de l'imagerie. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Comparaison de l'expression de protéines dans des domaines latérale et antérieure de l'épithélium folliculaire d'une chambre d'oeuf étape 8. (A) la reconstruction d'une vue latérale d'une chambre stade 8 œufs de visgun (VSG) GFP journaliste <sup> 21-23, teinté pour les anticorps dirigés contre la GFP ou ARM (blanc). DAPI marque les noyaux en bleu, et les grands noyaux infirmière cellulaires sont apparents. VSG se localise dans les canaux périphériques de cellules folliculaires (vert). (BB ') de fin sur les vues d'une reconstruction chamber.Three dimensions œuf d'un Z-pile d'images d'un stade de 8 VSG-GFP chambre journaliste d'oeuf, colorées avec anticorps primaires comme indiqué. SLBO protéine (rouge) est détecté dans les deux noyaux de cellules polaires et des frontières. ARM marque membranes de cellules folliculaires et est enrichie en cellules de frontière; DAPI étiquettes noyaux. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. imagerie des premières étapes 9 chambres d'œufs. (A) de la vue latérale d'un stade précoce 9 slla chambre d'oeuf de bo. Les cellules de la frontière (en vert) ont regroupées au sein de l'épithélium antérieur (flèche blanche). BC) fin sur les vues des chambres d'œufs. Reconstruction tridimensionnelle d'un Z-pile d'images à un stade précoce neuf gène slbo- de chambre journaliste d'oeuf, teinté en utilisant des anticorps primaires dirigés contre les protéines comme indiqué ou GFP. (B) slbo> GFP est exprimé dans les cellules de la frontière (vert) , tandis que fascicline 3 (FAS3, blanc) localise très à la membrane entre les deux cellules polaires; DAPI marque le noyaux (bleu). astérisques magenta indiquent les cellules polaires. (C) Les deux nucléaire (activé) STAT et slbo> expression de la GFP ne se trouvent que dans les cellules de la frontière, tandis que la E-cadhérine (E-CAD) marque les membranes des cellules du follicule et DAPI indique les noyaux. Astérisques indiquent les cellules Magenta polaires. les résultats de la coloration sont présentés individuellement pour slbo> GFP (C ') et STAT (C' ') Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nous décrivons ici une méthode pour monter et petite image, développer chambres d'œufs dans une perspective de fin sur. Techniques communes pour les chambres imagerie d'œufs sont optimisés pour des vues latérales et permettent principalement la visualisation précise des cellules folliculaires médio-latérale lorsqu'ils sont colorés avec des anticorps fluorescents. L'utilisation de piles ou Z-3-D reconstitutions aides à la visualisation de plusieurs plans focaux, mais est encore insuffisante pour la résolution sub-cellulaire des pôles de chambres d'œufs elliptiques (Figure 2D). Alors que cela peut être surmonté en partie avec les techniques de microscopie plus récentes telles que super-résolution imagerie, ces méthodes sont coûteuses et pas toujours disponibles. Nous avons adapté protocoles d'imagerie verticale pendant embryons de Drosophila 24,25 à utiliser pour les chambres d'oeuf beaucoup plus petites. Il ya plusieurs modifications clés de la méthode pour tenir compte de la taille beaucoup plus petite des chambres d'œufs par rapport aux embryons. Un élément clé de la technique décrite est le separ physiqueation des chambres individuelles, qui ne est pas requis d'embryons. Une autre modification est l'utilisation d'un second coulisseau de glycérine gelée pendant le montage (4.4). La taille des chambres d'oeufs et leur fixation par les cellules de la tige à d'autres chambres d'oeuf nécessite la manipulation de l'aiguille et mène à la destruction de la glycérine gelée. Par conséquent, les chambres d'œufs doivent être transférés avec une aiguille pour une nouvelle diapositive de la gelée de glycérine pour le montage (4,5). Imagerie verticale permet la visualisation des zones floues par des vues latérales ou horizontales, révélant de nouvelles informations sur l'organisation des tissus au cours du développement de l'œuf. Cela a conduit à de nouvelles perspectives sur les événements de structuration, et nous proposons que cette méthode pourrait être utilisée pour explorer d'autres aspects de l'ovogenèse.
Nous avons déterminé plusieurs étapes critiques à montage vertical succès. Nous avons trouvé que ce est nécessaire de retirer les chaînes ovariole complètement de la gaine lors de la dissection et chambres d'œufs désirés doivent être coupés de la ovariole chaîne. Défaut de chambres d'oeufs libres de la ovariole rend difficile pour ramasser la chambre d'œufs de stade approprié (étape 4.3). Nous vous recommandons de travailler avec de petites quantités de glycérine gelée à la fois en aliquotage en tubes. Ne pas chauffer glycérine gelée plus de deux fois parce que le chauffage répétée change sa consistance et l'empêche de se solidifier correctement (3,1). Utilisez bouts filtres pour empêcher l'aspiration gelée en pipettes. Laisser la glycérine gelée pour solidifier sur lame de microscope pendant au moins 8 heures à 4 ° C. Le raccourcissement de cette étape permet le montage des chambres d'oeuf difficiles (3,6). Il est important de se assurer d'absorber toute PBS-glycérol de chambres d'œufs montés (4,6). Si une trop grande quantité de liquide est présente, elle empêche la couche supérieure de la glycérine gelée d'adhérer à la partie inférieure. Dans ce cas, les chambres d'œufs peuvent flotter et changer de position. Pour de meilleurs résultats d'imagerie, glycérine blocs de gelée doit être découpé aussi près de la face antérieure de chambres d'œufs que possible physiquement (5,4). Trop de glycérine sur cette geléecôté diminue la qualité de l'image due à l'augmentation de la distance entre l'échantillon et la lamelle.
Il ya quelques mises en garde d'échantillons de montage dans la glycérine gelée. D'une part, il augmente la distance entre l'échantillon et l'objectif. Cette distance à fort grossissement, en particulier lors de l'utilisation d'un objectif à l'huile, peut créer des difficultés se concentrant sur l'échantillon, ce qui peut entraîner une mauvaise qualité d'image. Compte tenu de cela, il est très important de se tailler les blocs de glycérine gelée très proches les chambres d'œufs. Bien que la gelée de glycérine est optiquement clair, il ne defract un peu de lumière. Une autre limitation est que le signal de l'anticorps peut être réduit en raison d'une combinaison de la distance de travail de l'objectif et l'épaisseur de la glycérine gelée. Une augmentation de la concentration en anticorps à la fois primaire et / ou secondaire peut parfois aider à réduire ce problème. Bien que cela varie par l'anticorps, nous avons généralement acquis de meilleures images en utilisant le double de la concentration de fourmi secondaireibody en imagerie verticale par rapport à la quantité utilisée dans l'imagerie latérale standard. Nous ne connaissons pas d'alternatives à la gelée de glycérine pour le montage des chambres d'oeuf debout. D'autres matériaux tels que le polyacrylamide agarose et ont été jugés mais tous defracted lumière plus sévèrement, causant une perte de clarté tout en imagerie. Ainsi, cette technique de montage est le meilleur qui est actuellement disponible pour une utilisation avec la microscopie standard.
Alors que nous nous sommes concentrés sur les étapes de la spécification des cellules de la frontière et l'initiation de la motilité, chambres d'oeufs de différentes étapes pourraient être utilisés dans ce protocole avec seulement quelques ajustements mineurs. Plus important encore, le calibre de l'aiguille peut être modifié pour manipuler les chambres d'oeufs de différentes tailles et de stades de développement. Pour les stades 7-10, une aiguille 30 G fonctionne bien parce que les chambres d'oeufs se intègrent facilement dans le chanfrein. Pour antérieures chambres d'œufs de stade d'une aiguille de gros calibre (plus petit de biseau) doit être utilisé et de même une jauge plus petite (plus grandes de biseau) doit être utilisé pour plus tard stchambres d'œufs âgés. Tout ce à un stade de développement plus serait trop grand pour cette jauge (4,3). Aussi ne importe quel côté de la chambre d'oeuf peut être imagé en utilisant cette technique en disposant le bloc de gelée de glycérine chambres d'oeuf avec la zone d'intérêt vers l'objectif.
Montage de petits échantillons pris en charge dans la glycérine gelée a le potentiel pour être utiles dans des contextes multiples. Cette stratégie pourrait être utilisée pour visualiser les différents types de petits tissus fixés provenant d'autres organismes, en particulier quand il serait insuffisante pour examiner des échantillons d'une seule perspective. Une fois que cette technique est maîtrisée, il peut être utilisé pour afficher chambres d'œufs à tout angle désiré, selon la façon dont les chambres d'oeufs sont placés dans la gelée. Cette méthode permet une vue unique créant une bien meilleure compréhension tridimensionnelle de l'organisation cellulaire. Montant imagerie de chambres d'oeuf conjointement avec un anticorps immunofluorescent coloration permet la détection précise de la protéines et cellule-cellule contacts qui ne serait pas possible dans des conditions de montage standard. Nous prévoyons d'utiliser cette méthode pour cartographier les interactions entre les cellules qui permettent la coalescence et le détachement de la grappe de cellules de la frontière de l'épithélium. A cette époque, la technique d'imagerie verticale ne peut pas être utilisé avec des échantillons vivants, mais nous travaillons aussi pour surmonter cet obstacle. Nous prévoyons que cette méthode sera également applicable pour étudier d'autres aspects de la drosophile ovogenèse, ou pourrait être adapté à l'image d'autres petits tissus de nouveaux angles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14 ml |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60 W x 15 H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCl | IBI Scientific | IB70144 | 1 M TRIS-HCl, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).
- Bilder, D., Haigo, S. L. Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg. Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).
- Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).
- Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
- Montell, D. J. Border-cell migration: the race is on. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).
- Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila. Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).
- Ghiglione, C., et al. The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis. Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).
- Denef, N., Schüpbach, T. Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium. Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).
- Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis. Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).
- Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP. Cell. 71 (1), 51-62 (1992).
- Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium. Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
- McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells. Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).
- Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness. Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).
- Hayashi, Y., et al. Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen. Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).
- Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells. J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).
- Rørth, P., et al. Systematic gain-of-function genetics in Drosophila). Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
- Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis. Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).
- Quiñones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
- Belu, M., et al. Upright imaging of Drosophila embryos. J Vis Exp. (43), (2010).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).
