Introduction
Исследование дрозофилы оказывает большое понимание генетического регулирования в широком диапазоне явлений. В частности, было обширное исследование развития яиц, потому что оогенез обеспечивает послушный путь, чтобы исследовать различные процессов развития, в том числе ткани рисунка, изменения клеточной полярности, переключение клеточного цикла и поступательного регулирования 1,2,3,4. Одним из важных событий во морфогенетического оогенезе это спецификация, приобретение подвижности и миграции из набора клеток, называемых пограничные клетки (обзор в 5). Поскольку миграции клеток является ключевым признаком животного морфогенеза, и из-за генетического регулирование этого процесса хорошо сохраняется, механизмы, определенные в мух могут быть важными в других контекстах. Таким образом, мы исследуем молекулярную контроль миграции границы ячейки. Для наших исследований мы разработали новый метод, чтобы наблюдать передней полюсов развития яиц,где возникают пограничные клетки, чтобы изучить, как они развиваются в деталях.
В яичнике, яичные камеры на различных стадиях развития существуют вдоль цепочек, называемых овариол, которые заключены в тонкий оболочки (рис 1А). Каждое яйцо камера будет перейти к форме одно яйцо. Во время оогенеза, несколько различных типов элементов должны развиваться в скоординированной манере. D. MELANOGASTER яйцо камера состоит из 16 зародышевой линии клеток, в том числе один ооцит, окруженный однослойной фолликулярного эпителия 6. Небольшое количество специализированных клеток, называемых полярных клетки, возникают на передней и задней опор эпителия. Пограничные клетки 6-8 происходят в передней эпителия яйцевой камеры, вызванного полярных клеток 5,7. В середине оогенеза (стадия 9), пограничные клетки отделяются от своих соседей и мигрируют между питающих клеток, чтобы достичь яйцеклетки на заднем яйцевой камеры 5,7. Это движение должно быть выполненов то время как пограничные клетки остаются в кластере окружающей два неподвижных белых клеток, что делает этот тип коллективной миграции клеток. Успешное миграция границ клеток кластера обеспечивает правильное развитие микропиле яичной скорлупы, которая необходима для оплодотворения.
Передние полярные клетки указания судьбу границы клеток путем активации каскада трансдукции сигнала. Полярные клетки секретируют цитокин, непарных (UPD), который связывается с рецептором трансмембранной, Domeless (купол), на соседней ячейки стручка на стадии развития 8 ооцитов 8,9. Связывание UPD вызывает Janus тирозин-киназы (ЯК) фосфорилировать сигнал датчика и активатора транскрипции (STAT) 8,10,11. STAT затем переходит к ядру, чтобы активировать транскрипцию. Медленные Клетки границе (SLBO) является фактором транскрипции, который является прямым транскрипции цель STAT и также необходим для границы миграции клеток 12. Боковые виды яиц камер указывают тшляпа STAT деятельность регулируется в градиенте через передний эпителий 8,11,13. Фолликулярных клеток близкие к полярным клеток имеют самые высокие уровни активированного STAT, таким образом, они становятся пограничные клетки и вторгаются в соседнюю зародышевой линии ткани.
Чтобы понять, как пограничные клетки указан внутри и отделить от эпителия, мы должны наблюдать, как ткань организована. Если мы рассматриваем яичные камеры от передне-на перспективу, можно было бы ожидать радиальную симметрию STAT деятельности в фолликулярных клеток, окружающих полярные клетки. Конечный на виду также более точно показать различия мембранных белков и межклеточных интерфейсов до и во время отрыва, чем сравнение клеток в различных фокальных плоскостях. Поскольку яйцо камеры продолговатые и прикреплены друг к другу с помощью стебля клеток, они оседают на предметные стекла в поперечном направлении, что делает его трудно наблюдать переднюю архитектуру. Таким образом, много информации о клетках на полюсах яиц камеры имеетбыли выведены из боковых взглядов. Хотя некоторая информация может быть получена путем алгоритмических 3-D реконструкций оптических секций, комбинационного рассеяния света, Фотообесцвечивания и бедных рамки резолюции в Z-оси сделать эту информацию более подробно и надежны в отсутствии дорогих методов, как супер-разрешением микроскопии 14 , Другие виды секции на основе изображений (например, электронная микроскопия или микротом секционирования) требуют больших манипуляций тканей, в том числе обезвоживания, увеличивая вероятность для артефактов. Таким образом, мы разработали новый метод к фотографиям D. MELANOGASTER яичные камеры в то время как в вертикальном положении. Этот метод уже доказали свою полезность в объяснении, как подвижные клетки суждено (см репрезентативные результаты и штатное др рассматривается), и, вероятно, будет более широко ценным при исследовании других аспектов оогенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Вскрытие овариол
- Перевести около пятнадцати 2-4-дневных женского мух и несколько мужчин к новому лету пищевой флакон с добавлением активных сухих дрожжей. Используйте хлопок в качестве плагина для флаконов и добавить несколько капель воды к хлопку, чтобы сохранить высокую влажность.
- Место флакона в 25 ° C инкубаторе в течение 14-16 ч, чтобы максимизировать количество стадия 8-10 яиц камер.
Примечание: Время инкубации варьируется в зависимости от температуры и желаемой стадии. - Подготовка рассечение СМИ, 0,1 М КПО 4 и NP40 решения по мере необходимости в течение следующего дня (см Материалы).
- Обезболить мух с помощью CO 2, и поместите под микроскопом рассечение. Внесите несколько капель рассечение СМИ в каждой полости в стекле депрессии слайда.
- Держите щипцы в каждой руке на примерно 30 ° углом к поверхности стола и сориентироваться одна женщина летать с опущенными крыльями. С вашей не доминантной рукой, забрать самку с помощью щипцов, схватив ее в аnterior живота, недалеко от грудной клетки, и погрузите ее в рассечение СМИ в депрессию слайд (рис 1А вставке).
- С другой парой щипцов, держитесь экзоскелет на вентральной задней части брюшной полости и пробить. Возьмите яичников у заднего конца, то вытащить их из брюшной полости и поместить в свежую среду с другой стороны впадины слайда. (1А вставка). Избегайте потянув за исключением кишечник. Откажитесь от туши.
- Повторите с другими женщинами мух, пока все яичники не расчленены. Откажитесь от мужчин.
- С одной парой щипцов, удерживая яичника на заднем конце (около крупнейших яичных камер), а также с другой стороны использовать пару щипцов, чтобы зажать один из самых передних яиц камер (гермарии). (1А).
- Медленно и постепенно, тянуть ovariole цепь из яичника оболочки. Продолжайте рассекать из овариол индивидуально, пока все нужные яичные камеры не гemoved.
- Повторите шаги 1.7-1.8 для всех расчлененный яичников.
- После завершения передачи овариол в 0,6 мл трубки с помощью пластиковой пипетки передачи.
- Пусть овариол оседают на дно трубки, а затем приступить к фиксации и окрашивания шагов.
2. Иммунофлуоресцентного (IF) Окрашивание овариол
- Осторожно снимите рассечение СМИ от овариол с помощью пипетки. Будьте уверены, что не удалите все овариол яйцо или камеры. Оставьте примерно 50 мкл овариол и рассечение СМИ.
- Добавить 50 мкл 16% параформальдегидом до 150 мкл 0,1 М КПО 4 буфера в трубке, и добавить решение яиц камер, чтобы исправить их. Инкубируют в то время качания в течение 10 мин. ВНИМАНИЕ: параформальдегиде является токсичным.
- Удалить фиксатор и промыть в два раза с 0,5 мл NP40 промывочного буфера.
- Вымойте два раза в течение 15 минут каждый при комнатной температуре.
- Обратитесь к стандарту, если протокол 15 для последующих шагов.
- Если коротко, то после фиксации, добавитьПервичные антитела на соответствующих разведений и инкубировать O / N при 4 ° С. Промыть в NP40 несколько раз, а затем добавить вторичные антитела (1: 200) разведений.
- Промыть несколько раз в NP40, затем добавить DAPI (1: 1000) в течение 10 мин, а затем повторить стирок. Один раз, если протокол будет завершена, добавить 200 мкл 50% глицерина в PBS, чтобы яйцо камер и оставьте при комнатной температуре в течение 2 часов.
- Удалить решение заменить его 70% глицерина в PBS, и накрыть фольгой. Поместите образец на 4 ᵒC до готовности для монтажа. Между тем, продолжите с шага 3.
3. Предварительная подготовка глицерина желе слайдов
- Измерьте по крайней мере 4 мл глицерина желе с помощью шпателя и заполнить трубу стекло культуре клеток в половине пути знак. Melt глицерина желе на водяной бане при 55 ° С в течение 30 мин.
- Налейте небольшое падение глицерина, примерно 300 мкл, от маточного раствора на два микроскопа. Использование ткани, распространяется глицерин в тонком LAЙер на каждом из слайдов. Это обеспечивает основу и позволяет легко удаления глицерина желе на этапе 5.6.
- Отрежьте кончик от фильтрованного пипетки 1000 мкл. Использование пипетки сокращают для передачи 1000-1500 мкл теплой желе глицерина медленно каждому предметное стекло. Позаботьтесь, чтобы предотвратить пузыри.
- Пусть глицерин желе скользит сидеть в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы установить.
- Поместите каждую глицерин желе слайд в 60 мм × 15 мм чашки Петри и накрыть полиэтиленовой пленкой. Место в 4 ° CO / N. Возможно, магазин глицерина желе слайды до 5 дней при 4 ° С.
4. Монтаж яйцо палаты
- Использование образцов, начиная с шага 2.5, пипетки несколько 3 мкл капель яичных камер в 70% глицерине через один глицерина желе слайда. Продолжить Пипетирование 3 мкл капли, пока все яйца камеры не на этом слайде. Убедитесь, что каждая капля содержит, по меньшей мере, десять яиц камер. Между тем, нагреть пробирку глицерина желе в C на водяной бане 55 °,
- Поместите глицерин желе слайд с яйцом камер под микроскопом рассечение. Регулировка увеличения так, что только одна капля яиц камер в поле зрения (Фиг.1В).
- Использование 30 иглы, ложки, подобрать нужный стадии яйца камеры. При необходимости, отдельные желаемые яичные камеры из в ovariole цепочку с помощью иглы, как ножом.
- Чтобы избежать мусора, которые могут помешать изображений, передачи яйцо камеры во вторую глицерина желе слайд, с передней обращенной влево (фиг 1E -1). Повторяйте, пока не существует, по крайней мере семь яиц камеры выстроились в колонну (рис 1в).
- Форма новые столбцы из семи, пока все нужные яичные камеры не передаются на второй глицерин желе слайда.
- Оторвите небольшой кусочек ткани и твист. Используйте это, чтобы поглощать избыточную PBS глицерин из яиц камер, слегка касаясь каждой из них. Будьте осторожны, чтобы не удалить яичные камеры.
- Отрежьтекончик пипетки фильтруют 200 мкл. Используйте это, чтобы передать 150 мкл глицерина желе, чтобы покрыть все столбцы яиц камер.
ПРИМЕЧАНИЕ: количество глицерина желе, необходимых для покрытия столбцы основан на этапах камеры яйцо и число столбцов. Количество может быть отрегулирована. - Пусть установленные яичные камеры сидеть в течение 5 мин при комнатной температуре, пока верхний слой глицерина желе не будет полностью затвердевает (рис 1D).
- Место слайд конных яиц камер в 60 мм × 15 мм чашки Петри и накрыть полиэтиленовой пленкой. Хранить при температуре 4 ° СО / N, чтобы позволить глицерин желе слои, чтобы укрепить вместе (место в темноте, если есть опасения по поводу фотообесцвечиванию).
5. Подготовка яичных палат для работы с изображениями
- Поместите слайд смонтированных яиц камер под микроскопом рассечение. Отрегулируйте увеличение, так что только одна колонка яиц камер находится в поле зрения.
- Использование угол 45 ° миниатюрный скальпель, вырезать straigHT линии с правой стороны от первого столбца яиц камер (близких к задней стороне яйца камер). (Рисунок 1D-Е)
- Далее, на голову выше первого яйца камеры в верхней и ниже последнего яйца камеры в колонке. В этот момент колонна яиц камер должны быть сокращены с трех сторон.
- Использование microknife, срез вдоль левой стороны колонки, как можно ближе к передней стороне яйца камер (рис 1E -3).
- Пипетировать 100 мкл холодной 1X PBT через колонку вырезом.
- Используйте круглый краями шпателя, чтобы удалить лишнюю желе глицерина вокруг трех сторон разреза колонны яичных камер и отказаться, оставив остальное на слайде.
- Вставьте шпатель в надреза на передней стороне яйца камер и отделить столбец из основного блока глицерин желе.
- Подготовка образцов для любой перевернутые (5.8.1) или вертикально (5.8.2) микроскопии.
- Для инвертированный микроскоп: трансфер Tон колонна яиц камер для покровное с передней стороны яичных камер вниз. Повторите шаги 5,2-5,8 пока все столбцы глицерина желе не были удалены и установлены. Добавьте пару капель 50% PBS-глицерина на каждом блоке яичных камер, чтобы предотвратить их от высыхания. Изображение яичные камеры непосредственно на покровное.
- Для вертикального микроскопа: Трансфер столбец из яиц камер для предметное стекло микроскопа с передней стороной вверх. Повторите шаги 5.2-5.9, пока все столбцы глицерина желе не были удалены и установлены на предметных стеклах. Добавьте пару капель 50% PBS-глицерина на каждом блоке яичных камер и крышки блоков с # 1 ½ покровное.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метод прямой визуализации позволил нам увидеть непосредственно в организацию клеток в передней фолликулярного эпителия на стадии 8. общим маркером для судьбы фолликул клеток, об отсутствии Глаза (ЕЯ) белок, а также маркер ядерной ДНК DAPI, показали даже выражение по этой области клеток, и показали, что все клетки можно рассматривать с аналогичными интенсивности окрашивания (Фигура 2В "). Белки, регулируемые в ответ на цитокинов UPD, однако, показали переменных модели и уровни экспрессии. Полярные клетки выделяют UPD вершине до этой стадии развития яиц 16,17, так что мы ожидали STAT должен быть активирован радиально полярных клеток, которые иногда случается. Часто, однако, мы обнаружили, что вниз по течению целей STAT, в том числе SLBO, имел более сложные паттерны экспрессии. Например, GFP репортер выражения SLBO появились в большинстве, но не во всех, клетки, которые окружали полярные клетки (рис 2B, чтобы увидеть МаннING и др рассматривается). Мы заметили, небольшие различия в E-кадгерина слова / локализации (рис 2В »), которые могут отражать изменения в адгезии, но больше работы будут необходимы для количественной оценки и интерпретации этого результата. Эти тонкости не были обнаружены через боковой трехмерной реконструкции устроили яиц камер (рис 2С-D). Различия в апикальной-базальной оси фолликула клеток также можно отличить с помощью вертикально метод. Мы использовали репортер линию для кольца канала белка Visgun (ВСГ), который присутствует в апикальной области плазматической мембраны 18 (фиг.3А). Вертикальный изображения подтверждается выражение VSG был обнаружен в апикальной части фолликулярных клеток, вблизи самой узкой части полярных клеток (фиг.3В).
Мы также обнаружили, что способ в вертикальном положении формирования изображения работает хорошо, чтобы просмотреть передний эпителий в стадии 9 яиц камер. В этом развиopmental этап, пограничные клетки сливаются вместе вокруг полярных клеток (рис 4а). Мы могли наблюдать эти уплотненные скопления, используя с торца томография (рис 4B-C). Как и в стадии 8, мы обнаружили сходные уровни экспрессии ЭЯ во всех эпителиальных клетках (не показаны), в то время как slbo -GFP, а также активируется, ядерная STAT отмечены подвижные границы клетки (фиг.4В и 4С). Локализация FAS3 белка указывает на полярную клеток-полярный интерфейс клеток (рис 4б). Кроме того, в обоих этапах 8 и 9, мы могли видеть большие питающих клеток, на что указывает DAPI или фаллоидином-окрашивания кортикального актина (не показан), который предполагает, этот метод также будет полезна при исследовании клеток зародышевой линии или клетки зародышевой -follicle межклеточных взаимодействий.
Рисунок 1. Вертикальный монтаж Drosophila яйцевой камерыс. () Drosophila яичников с указанием яйцо камеры, оболочка, и ovariole. Живописание иллюстрирует положение щипцов для вывода ovariole медленно из яичника оболочки. Врезка показывает расположение лету для вскрытия. Брюшная сторона женской лету обращена вверх. -Передняя, P-задней. (BD) Процедура монтажа яичные камеры. (B) небольшая капля яйца камер в 70% глицерин-PBS, смотреть под рассечение стереомикроскопа. Желтая стрелка указывает на ovariole цепь; желтый стрелка указывает отдельного яйца камеру. Красная стрелка указывает на край капли Глицерин-PBS. (C) Колонны яиц камер, расположенных на тонком слое отвердевшей желе глицерина. Желтый наконечник стрелы указывает на отдельные камеры яйца. (D), второй тонкий слой расплавленного глицерина желе охватывает столбцы яйца камеры, чтобы вставлять их. Желтый пунктирная линия показывает, где сокращение должно быть сделано после O / N инкубации при 4ᵒC. Красная стрелка указываеткромка второго слоя глицерина желе. Красные цифры указывают порядок резки столбцы яйца камеры (горизонтальная верхняя и нижняя разрезы не показан). Передняя находится слева. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Визуализация переднего эпителия ранней стадии 8 яйцевой камеры. (А) вид сбоку ступени 8 медленно пограничные клетки (slbo) ген-репортер яиц камеры (генотип: slbo -Gal4, БАС-mCD8-GFP), 19,20 окрашивали DAPI и первичных антител, как указано, или для slbo> GFP. Armadillo (ARM) является муха гомолог β-катенина. Передняя () находится слева, заднего (P) справа. (BB ") End-на представлениях яйца чаmber. Трехмерная реконструкция изображений Z-стеков в стадии 8 slbo- ген-репортер яйцевой камеры, установленных вертикально, витражи с первичными антителами, как указано. Magenta звездочки указывают полярные клетки. DAPI отмечает ядра. (B ') slbo> GFP выражается только в предполагаемых границ клеток (SLBO). Е-кадгерин (E-CAD) представляет собой молекулу адгезии локализованы на мембране и обогащенный пограничных клеток. (В '') Глаза отсутствуют (ЕЯ) находится равномерно выражены в ядрах клеток всех фолликулов, за исключением полярных клеток. (С) Стандартный вид сбоку slbo -reporter этап 8 яйцевой камеры, окрашенных DAPI (синий) и антител против GFP (SLBO, зеленый), ARM (красный), и FAS3 (белый). На вставке приведены осей: X-ось вниз (зеленая стрелка), Y-ось влево (красная стрелка), и Z-оси к зрителю (синий) (D) для сравнения с новой техникой. эта панель показывает Crea конец на просмотрТед по трехмерной реконструкции, обработанного с помощью программного обеспечения Volocity, используя Z-Stack боковых изображений яйцевой камеры, показанной в C. На вставке приведены превратились осей: X-ось вниз (зеленая стрелка), Z-оси Теперь влево (синяя стрелка), и Y-оси в направлении зрителя (красный). Отдельные клетки размыты из-за низкого разрешения в Z-оси; Таким образом, новый подход показан в B представляет собой значительное улучшение изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Сравнение экспрессии белка в боковых и передних областей фолликулярной эпителия этап 8 яйцевой камеры. () Реконструкция бокового зрения этап 8 яиц камеры visgun (VSG) -GFP репортера <SUP> 21-23, витражи для антител, направленных против GFP или ARM (белый). DAPI отмечает ядер в синий, и крупные ядра медсестра клеток являются очевидными. VSG локализуется в кольцевых каналах фолликулярных клеток (зеленые). (BB ') End-на представлениях яйца chamber.Three-мерного реконструкции Z-Stack изображений стадии 8 VSG-GFP репортер яйцо камеры, окрашивали Первичные антитела, как указано. SLBO белок (красный) обнаруживается в обоих полярных и пограничных клеточных ядер. ARM отмечает мембраны фолликула клеток и обогащается в приграничных клеток; DAPI этикетки ядер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. визуализации ранней стадии 9 яичных камер. () Боковой вид на ранней стадии 9 SLБо -reporter яйцевой камеры. Пограничные клетки (зеленый) группировались в передней эпителия (белая стрелка). До н.э.) End-на вид яйца камер. Трехмерная реконструкция Z-Stack изображений на ранней стадии 9 slbo- ген-репортер яйцо камеры, окрашивали с использованием первичных антител, направленных против белков как указано, или GFP. (B) slbo> GFP выражается в приграничных клеток (зеленый) , в то время как Fasciclin 3 (FAS3, белый) локализуется высоко в мембране между двумя полярными клетками; DAPI отмечает ядер (синий). Magenta звездочки указывают полярные клетки. (С) как ядерного, так (активированный) STAT и slbo> выражение GFP можно найти только в приграничных клеток, в то время как Е-кадгерин (E-CAD) отмечает мембраны фолликулярных клеток, и DAPI указывает ядра. Magenta звездочки указывают полярные клетки. Результаты Окрашивание показаны индивидуально для slbo> GFP (C ') и STAT (C' ') Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем метод монтажа и изображение небольшой, развивающееся яйцо камеры с точки зрения конечного дальше. Общие методы для работы с изображениями яйца камер оптимизированы для боковым видом и, прежде всего, позволяют точно визуализировать Медио-боковая фолликулярных клеток при окраске флуоресцентными антителами. Использование Z-стеки или 3-D реконструкций средств при просмотре нескольких фокальных плоскостей, но по-прежнему недостаточно для субклеточном разрешением полюсов эллиптических яиц камер (рис 2D). Хотя это может быть частично преодолены с новейшими методами микроскопии, такие как супер-разрешением изображения, эти методы являются дорогостоящими и не всегда доступны. Мы адаптировали протоколы прямо изображений для Drosophila эмбрионов 24,25, которые будут использоваться для более мелких камер яиц. Есть несколько ключевых изменений в метод учета для гораздо меньшего размера яичных камер по сравнению с эмбрионами. Ключевым компонентом описанной методике физического Separвания отдельных камер, которые не требуется эмбрионов. Еще одним изменением является использование второго глицерин желе слайд во время монтажа (4,4). Размер яиц камер и их крепление через стебля клеток к другим яиц камер требует манипуляций с иглой и приводит к разрушению глицерина желе. Поэтому, яичные камеры должны быть переданы с помощью иглы к новому глицерина желе слайд для монтажа (4.5). Вертикальный изображений позволяет выводить областях размыты боковыми или горизонтальными видом, выявление новую информацию об организации тканей во время развития яиц. Это привело к новому пониманию на кучность событий, и мы полагаем, что этот метод может быть использован для изучения дополнительных аспектов оогенеза.
Мы определили несколько важных шагов в успешной вертикальном монтаже. Мы обнаружили, что это необходимо для удаления ovariole цепи полностью из ножен во время вскрытия, и желаемые яичные камеры должны быть вырезаны из ovariolе цепи. Несоблюдение свободных яичных камер от ovariole делает его трудно подобрать правильный стадии яйца камеры (шаг 4,3). Мы рекомендуем работать с небольшим количеством глицерина желе в то время, по аликвоты его в пробирки. Не нагревайте глицерина кисель, чем в два раза, потому что повторяется отопление меняет свою консистенцию и препятствует его затвердевание правильно (3.1). Используйте советы фильтров для предотвращения аспирации желе в пипеток. Разрешить глицерина желе, чтобы закрепить на предметном стекле микроскопа, по крайней мере, 8 часов при 4 ° С. Сокращение этот шаг делает установку яичные камеры сложно (3,6). Важно, чтобы убедиться, чтобы поглотить все ПБС-глицерин с установленными яиц камер (4,6). Если слишком много жидкости присутствует, то он предотвращает верхний слой глицерина желе от присоединения к нижней части. В этом случае, яичные камеры может плавать, и изменить положение. Для достижения наилучших результатов визуализации, глицерин желе блоков должны быть обрезаны как можно ближе к передней стороне яйца камер и физически возможно (5.4). Слишком много глицерин желе на этосторона уменьшает качество изображения из-за увеличения расстояния между образцом и покровное.
Есть некоторые предостережения от установки образцов в глицерине желе. С одной стороны, это увеличивает расстояние между образцом и объективом. Это расстояние при большом увеличении, особенно при использовании масляной цели, может создать трудности, уделяя внимание на образец, которые могут привести к ухудшению качества изображения. Учитывая это, очень важно, чтобы вырезать глицерина желе блоков очень близкие к яичным камер. Хотя глицерин желе является оптически прозрачной, она делает defract некоторый свет. Другим ограничением является то, что сигнал антитело может быть уменьшена за счет сочетания рабочей расстояние объектива и толщины глицерина желе. Увеличение концентрации первичного и / или вторичного антитела иногда может помочь в снижении этой проблемы. Несмотря на то, варьируется в зависимости от антитела, мы, как правило, приобрели лучшие изображения с помощью двойной концентрации вторичного муравьяibody в вертикальном изображений по сравнению с количеством используемого в стандартной боковой изображений. Нам не известны альтернативы глицерин желе для монтажа яичные камеры в вертикальном положении. Другие материалы, такие как агарозы и полиакриламида пытался, но все defracted свет более сильно, вызывая потерю ясности то время как изображения. Таким образом, эта монтажная техника лучшее, что есть в настоящее время доступны для использования со стандартным микроскопии.
В то время как мы сосредоточились на этапах спецификации границы ячейки и начала моторики, яичные камеры разных этапах могут быть использованы в данном протоколе с только несколько незначительных корректировок. Самое главное, датчик иглы могут быть изменены, чтобы манипулировать яичные камеры различных размеров и стадий развития. Для стадиях 7-10, игла 30 G работает хорошо, потому что яйцо камеры легко поместится в скоса. Для более старых камер стадии яйца больше игла (меньше коническая) следует использовать и аналогично меньшего калибра (большие конические) должен быть использован для последующего улв возрасте яичные камеры. Все в старшем этапе развития было бы слишком большой для этой калибровке (4.3). Кроме того, любая сторона яйцевой камеры могут быть отображены с помощью этой техники за счет организации глицерин желе блок яичных камер площадью интереса к цели.
Монтаж небольшие образцы, поддерживаемые в глицерине желе имеет потенциал, чтобы быть полезным в нескольких контекстах. Эта стратегия может быть использована для визуализации различных типов малых, фиксированных тканей из других организмов, в особенности, когда это было бы недостаточно, чтобы исследовать образцы с только одной точки зрения. После того, как этот метод освоен, он может быть использован для просмотра яичные камеры под любым желаемым углом, в зависимости от того, как яйцо камеры расположены в желе. Этот метод позволяет уникальным видом создание гораздо лучше трехмерную понимание клеточной организации. Вертикальный изображений яйцо камер в сочетании с окрашиванием иммунофлуоресцентного антитела позволяет для точного обнаружения белкаS и межклеточных контактов, что было бы невозможно при стандартных условиях монтажа. Мы планируем использовать этот метод в картирования межклеточные взаимодействия, которые позволяют слияние и отряд пограничной клеток кластера из эпителия. В это время, в вертикальном положении методом визуализации не могут быть использованы с живыми образцами, но также работает, чтобы преодолеть это препятствие. Мы ожидаем, этот метод также будет применяться для изучения других аспектов Drosophila оогенеза, или могут быть адаптированы к изображений других мелких тканей на новых ракурсов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14 ml |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60 W x 15 H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCl | IBI Scientific | IB70144 | 1 M TRIS-HCl, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).
- Bilder, D., Haigo, S. L. Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg. Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).
- Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).
- Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
- Montell, D. J. Border-cell migration: the race is on. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).
- Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila. Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).
- Ghiglione, C., et al. The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis. Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).
- Denef, N., Schüpbach, T. Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium. Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).
- Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis. Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).
- Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP. Cell. 71 (1), 51-62 (1992).
- Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium. Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
- McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells. Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).
- Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness. Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).
- Hayashi, Y., et al. Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen. Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).
- Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells. J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).
- Rørth, P., et al. Systematic gain-of-function genetics in Drosophila). Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
- Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis. Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).
- Quiñones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
- Belu, M., et al. Upright imaging of Drosophila embryos. J Vis Exp. (43), (2010).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).
