שינוי Biolistic הוא שיטה המשמשת ליצירת אינטגרציה יציבה של DNA לתוך הגנום של neoformans הפתוגן קריפטוקוקוס האופורטוניסטי באמצעות רקומבינציה ההומולוגית. נדגים שינוי biolistic של מבנה, שבו יש קינאז אצטט גן המקודד התמזג mCherry תג הניאון לneoformans ג.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שינוי Biolistic של פלורסנט Tagged Gene לOpportunistic פטרייתיים פתוגן
במאמר זה
סיכום
תקציר
Basidiomycete neoformans קריפטוקוקוס, הפתוגן האופורטוניסטי פולשנית של מערכת העצבים המרכזית, הוא הסיבה השכיחה ביותר לדלקת קרום המוח פטרייתי בעולם וכתוצאה מכך יותר מ 625,000 מקרי מוות בשנה ברחבי העולם. למרות electroporation פותח להפיכתו של פלסמידים בקריפטוקוקוס, רק משלוח biolistic מספק אמצעי יעיל כדי להפוך את ה- DNA ליניארי שניתן לשלב לתוך הגנום ידי רקומבינציה ההומולוגית.
אצטט הוכח להיות מוצר תסיסה גדול בזיהום cryptococcal, אבל המשמעות של זה עדיין לא ידוע. מסלול חיידקים המורכב מהאנזימים xylulose-5-פוספט / פרוקטוז-6-פוספט phosphoketolase (XFP) וקינאז אצטט (Ack) הוא אחד משלושה מסלולים אפשריים לייצור אצטט בג neoformans. הנה, אנחנו מדגימים את שינוי biolistic של מבנה,שגן קידוד Ack שהתמזג לתג פלורסנט mCherry, לג neoformans. לאחר מכן, אנו מאשרים שילוב של היתוך ACK -mCherry למוקד ACK.
מבוא
Cryptococcus neoformans, פתוגן אופורטוניסטי פולשני של מערכת העצבים המרכזית, הוא הגורם השכיח ביותר לדלקת קרום המוח הפטרייתית הגורמת ליותר מ-625,000 מקרי מוות בשנה ברחבי העולם 1. הוכח כי אצטט הוא תוצר תסיסה עיקרי במהלך זיהום קריפטוקוקלי 2,3,4, והוכח כי גנים המקודדים אנזימים משלושה מסלולים משוערים המייצרים אצטט מווסתים במהלך הזיהום 5. זה מצביע על כך שייצור והובלה של אצטט עשויים להיות חלק הכרחי ונדרש בתהליך הפתוגני; עם זאת, המשמעות של זה עדיין לא מובנת. מסלול אפשרי אחד לייצור אצטט הוא הקסילולוז 5-פוספט/פרוקטוז 6-פוספט פוספוקטולאז (Xfp) - אצטט קינאז (Ack), מסלול שבעבר נחשב לקיים רק בחיידקים אך זוהה לאחרונה הן בפטריות אואסקומיצט והן בפטריות בסיסיומיצט, כולל C. neoformans 6.
כדי לקבוע את הלוקליזציה של אנזימים אלה של מסלול זה בתא, מבנה הנושא גן עמידות לניאו-מיצין במורד הזרם של היתוך גן ACK לתג הפלואורסצנטי mCherry (ACK:mCherry:Neo) יוכנס ל-C. neoformans באמצעות השיטה המבוססת היטב של טרנספורמציה ביוליסטית 7,8. למרות שאלקטרופורציה היא שיטה יעילה לטרנספורמציה של פלסמידים שיישמרו כאפיזומים לקריפטוקוקוס 9, היא אינה שימושית ביצירת טרנספורמציות הומולוגיות יציבות 8. רק אספקה ביולוגית באמצעות אקדח גנים מספקת אמצעי יעיל לשינוי DNA ליניארי שישולב בגנום על ידי רקומבינציה הומולוגית. לדוגמה, אדמן ועמיתיו הראו כי מבין הטרנספורמנטים הנובעים מאלקטרופורציה של סמן URA5 הניתן לבחירה הנישא על ידי פלסמיד למוטציות C. neoformansura5, רק 0.001 עד 0.1% מהטרנספורמנטים היו יציבים 9. צ'אנג ועמיתיו השיגו יעילות טרנספורמציה יציבה של 0.25% בלבד באמצעות אלקטרופורציה כדי לשחזר את ייצור הקפסולה במוטציה אקפולרית 10. בניגוד לאלקטרופורציה, הוכח כי טרנספורמציה ביוליסטית מביאה ליעילות טרנספורמציה יציבה של 2-50% בהתאם לגן שמשתנה 7,8,11.
ניסוי ויזואלי זה יספק הדגמה שלב אחר שלב של הטרנספורמציה הביוליסטית של מבנה ה-ACK:mCherry:Neo DNA הליניארי ל-C. neoformans, ויתאר כיצד לאשר את שילובו הנכון באמצעות רקומבינציה הומולוגית לתוך לוקוס ה-ack. הפרוטוקול המוצג כאן הוא שינוי של השיטה שפותחה במעבדה המושלמת 8.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: התכנית הכוללת של פרוטוקול זה מתואר באיור 1.
1. ג neoformans הכנה
- עבור כל תגובת שינוי, לגדול 2-3 O מיליליטר / תרבות N של ג neoformans במדיום YPD ב 30 ° C רועד ב 250 סל"ד.
- צנטריפוגה O / תרבות N במשך 5 דקות ב 900 XG ב 10 ° C וזורקים supernatant.
- Resuspend כל תא גלולה ב 300 μl של דקסטרוז בינוני Peptone השמרים (YPD).
- שימוש בחרוזי זכוכית, בעדינות להפיץ 300 μl של ההשעיה התא שטף על אגר YPD המכיל סורביטול 1 M.
- לאפשר צלחות לייבוש בטמפרטורת הסביבה במשך 3-4 שעות.
2. זהב microcarrier הכנה
- Resuspend 0.25 גרם של 0.6 מיקרומטר חרוזים זהב ב 1 מיליליטר של DDH 2 O, צנטריפוגות 1 דקות ב 900 XG כדי גלולה את החרוזים, ולהסיר את supernatant.
- Resuspend חרוזים הזהב ב 1 מיליליטר של 100% אתנול.
- להפיץ את החרוזים ל4 צינורות, 250 μl כל אחד, ולהוסיף 750 μl של 100% אתנול.
- aliquots חרוז זהב החנות ב 4 מעלות צלזיוס.
3. DNA הכנה
- הכן דיסקי biolistic macrocarrier כתומים על ידי השריית אותם במלקחיים באמצעות אתנול 100%. דיסקי מקום לצלחת פטרי גדול המכילה Drierite לייבוש (לוודא Drierite לא נוגע בדיסקים).
- לאחר יבש, לחץ על דיסקי macrocarrier למחזיקי דיסק כסף (ניגבו את העבר עם 100% אתנול).
- חרוזים זהב וורטקס (מוכנים כמו בשלב 2) וμl 12 aliquot לתוך 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge, צינור אחד לכל שינוי.
- הוסף לכל צינור כדי: 2 מיקרוגרם של ה- DNA (רצוי 2 μl של 1 מיקרוגרם / μl של DNA), 10 μl 2.5 M CaCl 2, ובסיס חופשי 2 μl M 1 spermidine.
- הגדרת בקרה שלילית כמו בשלב 3.4 אך ללא DNA.
- מערבולת צינור כל דגירה בטמפרטורת הסביבה ל5 דקות. בעדינות קפיצית כל צינור מדי פעם כדי resuspend חרוזים התיישבו במהלך דגירה זה.
- צינורות ספין ב 225 XG למשך 30 שניות עד גלולה חרוזים הזהב מצופה DNA. מוציא בזהירות את supernatant (על ידי pipetting או שאיפה) וזורקים.
- חרוזים Resuspend לחלוטין ב600 μl של 100% אתנול על ידי pipetting לאט מעלה ומטה.
- ספין צינורות ב 225 XG למשך 30 שניות עד גלולה חרוזים ללא אריזה. מוציא בזהירות וזורקים supernatant.
- Resuspend חרוזים הזהב מצופה DNA ב 8 μl של 100% אתנול על ידי pipetting לאט מעלה ומטה.
- פיפטה חרוזים זהב מצופה DNA על מרכז דיסק biolistic בקוטר 1 סנטימטר ולאפשר לו להתייבש.
הערה: מעגל זהב מיובש גלוי על מרכז דיסק biolistic מצביע על כך שריכוז מספק של חרוזים זהב הוא הווה.
הערה: דיסקי macrocarrier עמוסים חרוזים זהב מצופה DNA מוכן לשימוש עם אקדח הגן עכשיו.
4. Operating Gun ג'ין
- הפעל את משאבת הוואקום.
- הפעל את גז הליום על ידי סיבוב הידית נגד כיוון השעון עד שלחץ של כ -2,200 psi הוא הגיע במד הלחץ.
- הפעל את אקדח הגן על ידי מדליק את אדומה בצד השמאל.
- הקפד שהספיקה לוואקום והאוורור מותאמות כך הוואקום יגיע 28 אינץ 'כספית בתוך 15 שניות.
- הקפד המרחק בין דיסק הקרע וmacrocarrier הוא כ 3/8 אינץ '.
- נקה את כל החדר על ידי ניגוב עם אתנול.
- להטביע את דיסקי הקרע באתנול 100%. לאפשר לו להתייבש על משטח סטרילי (למשל, פטרי צלחת).
- השתמש במפתח מומנט כדי לשחרר את בעל דיסק קרע. הכנס דיסק קרע נקי לבעל. לדפוק את בעל דיסק קרע בחזרה למקומו והדק עם מפתח מומנט על ידי הפיכתו פעם לימין.
הערה: תקליטורי קרע יוחלפו הבא כל לירות. - לצלול המסכי רשת דואר באתנול 100%. לאפשר לו להתייבש על משטח סטרילי (למשל, פטרי צלחת).
- לאחר יבש, למקם את מסך רשת שטף על צלחת הרכבת פלסטיק הלבנה. הנח את צד DNA בעל דיסק macrocarrier לתוך תא הדיסק. לדפוק על מכסה הכסף, ומניח את צלחת ההרכבה בחריץ הגבוה ביותר.
הערה: מסך הרשת יוחלף לאחר כל לירות. - מניחים צלחת אגר YPD המכילה 1 M סורביטול על הצלחת התחתונה.
- כבה תא דלת ומנעול למקום.
- לדחוף והחזק את המתג האדום באמצע עד לעסוק ואקום ולאפשר הוואקום כדי להגיע 28 אינץ 'Hg. ברגע שהוא הגיעה לרמה ואקום הנכונה, להעביר בורר זה למצב למטה. כאשר מוכן, החזק את המתג האדום על הזכות לפטר. כאשר דיסק קרע אבא, שחרר מייד את לחצן האש ולחץ על המתג האדום באמצע למצב האמצע לפרוק התא ל0 psi.
- לנקות את דיסק קרע הפסולת ולכבות את אקדח הגן. לאחר מכן לכבות את heliuגז מ 'על ידי סיבוב הכפתור בכיוון השעון, ולבסוף, לכבות את משאבת הוואקום.
5. תאי ציפוי שינו
- אפשר צלחות השינוי לשבת על RT במשך 4 שעות כדי לאפשר לתאים להתאושש.
- 700 μl פיפטה של YPD לצלחת. השתמש מגרד תא לגרד בעדינות את התאים מהנוזל אגר ופיפטה לתוך צינור microfuge סטרילי 1.5 מיליליטר. חזור על שלב זה כדי להבטיח את כל התאים כבר התאוששו מהצלחת.
- גלולה תאים ב 225 XG למשך 30 שניות. להסיר ולסלק supernatant.
- Resuspend גלולה ב 500 μl של YPD.
- פיפטה של ההשעיה התא 100 μl על המרכז + צלחות האנטיביוטיקה YPD ולהפיץ באמצעות חרוזים זכוכית.
- השאר צלחות הפוכות ב RT במשך 3-4 ימים. כמושבות מופיעות, תיקון על YPD החדש + צלחות אנטיביוטיות.
6. בידוד הדנ"א הגנומי לPCR
הערה: זו גרסה שונה באמצעות מגיבים מערכת טיהור DNA (ראה טבלה של חומרים).
- לגדול תרבות 5 מיליליטר של כל אחד מג transformants neoformans בנוזל YPD ב 30 ° C רועד ב 250 סל"ד O / N.
- גלולה 3 מיליליטר של תאים ב 900 XG, וגלול ב600 μl של פתרון תמוגה גרעינים.
- מוסיף את ההשעיה לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש עם 200 μl של חומצת 0.5 מ"מ שטף חרוזי זכוכית.
- Homogenize במשך 45 שניות בbeadbeater מיני בטמפרטורת הסביבה, צינור מגניב על קרח, ולחזור.
- לאפשר מדגם להתיישב על קרח למשך 2 דקות ולהעביר supernatant לצינור 1.5 מיליליטר חדש. הוסף 200 μl של פתרון ממטרים חלבון לכל צינור, (100 μl לכל 600 μl של supernatant התאושש) ומערבולת במרץ במשך 20 שניות.
- לאפשר דגימות להתיישב על קרח למשך 5 דקות, וצנטריפוגות ב 11,000 XG במשך 3 דקות.
- מעביר את supernatant לצינור 1.5 מיליליטר נקי המכיל 300 μl של isopropanol RT. לערבב בעדינות על ידי היפוך.
- צנטריפוגה דגימות 11,000 XG למשך 2 דקות, להסיר בזהירות את supernatant, ולנקז את הצינורות על מגבות נייר.
- להוסיף 300 μl של RT אתנול 70% לכל צינור, בעדינות להפוך ללשטוף את הכדור.
- צנטריפוגה דגימות 11,000 XG למשך 2 דקות, ובזהירות להסיר את כל אתנול.
- מסננים את הצינור על מגבות נייר נקיות, ולאפשר לגלולה לייבוש באוויר במשך 10-15 דקות.
- הוסף 50 μl של פתרון להחזרת נוזלי DNA ו -1.5 μl של פתרון RNase לכל גלולה ומערבולת.
- צנטריפוגה דגימות במשך 5 שניות כדי להסיר את כל הנוזל מהכובע.
- דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- רעננות DNA על ידי דוגרים הדגימות ב 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- לכמת DNA spectrophotometrically על ידי מדידת הספיגה ב 260 ננומטר (קריאת 260 של 1.0 היא שווה ערך ל~ 50 מיקרוגרם / DNA פעמיים תקועים מיליליטר), ולהשתמש עד 200 ng בכל תגובת PCR.
בידוד RNA 7. להפוך transcriptase-PCR.
- באמצעות ערכת טיהור RNA (ראה טבלה של חומרים), בצע את הוראות היצרן כדי לבודד RNA מתאי שמרים באמצעות minibeadbeater.
- לכמת את הריכוז של RNA על ידי מדידת הספיגה ב 260 ננומטר (קריאה 260 של 1.0 היא שווה ערך ל~ 40 מיקרוגרם / מיליליטר RNA חד-גדילים).
- שימוש בערכת RT-PCR (ראה טבלה של חומרים), בצע את הוראות היצרן כדי להגדיר את תגובות RT-PCR עם כ 1 מיקרוגרם של RNA. לתוצאות שהתקבלו במחקר זה, השתמש בצבעי היסוד המפורטים בטבלה 1.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שינוי biolistic מוצלח של ג ניתן להשיג neoformans על ידי ביצוע תכנית זו פרוטוקול (איור 1). עם שינוי biolistic, לירות מוצלחת של חרוזים זהב מצופים מצויינים על ידי טבעת זהב גלויה על הצלחת לאחר DNA היא ירייה (איור 2 א). מושבות אמורות להופיע בתוך 4-5 ימים שבם השאירו בטמפרטורת חדר לאחר ציפוי התאים התאוששו מצלחות סורביטול YPD + 1M על גבי מדיה סלקטיבית. הפיכת 2 מיקרוגרם של ה- DNA צריכה לגרום 20 עד 30 מושבות (איור 2). כאשר...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לבצע טרנספורמציה ביולוגית שבה DNA ליניארי משולב בלוקוס רצוי בגנום Cryptococcus neoformans על ידי רקומבינציה הומולוגית. לשלבים מסוימים בפרוטוקול יכולה להיות השפעה דרמטית על האפקטיביות/יעילות של השינוי. לטרנספורמציה מוצלחת, הכרחי שה-DNA המשמש בנבט יהיה בריכוז של לפחות 1 מיקרוגרם. עם זאת, ניתן להגדיל את נפח ה-DNA שנוסף לחרוזי הזהב בסיכוי שתפוקת ה-DNA נמוכה מ-1 מיקרוגרם (שלב 3.4).
שלב חשוב נוסף הוא בציפוי ה-DNA של חרוזי הזהב. מספר לא מספיק של חרוזים בדגימת הכנת ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין לנו מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדע (פרס # 0,920,274) וניסוי הדרום קרוליינה תחנת פרויקט SC-1,700,340. נייר תרומת מס 'זה isTechnical 6283 של תחנת ניסיונות אוניברסיטת קלמסון. המחברים מודים לד"ר לוקאש Kozubowski לעצות מועילות שלו בפיתוח של פרוטוקול זה סופי ושריל ד"ר אינגרם-סמית, קייטי גלן, וגרייס Kisirkoi לקריאה הביקורתית שלהם של כתב היד.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.6 μ m חרוזי זהב | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
| בסיס נטול זרע | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
| G418 - סולפט (ניאומיצין) | Gold Biotechnology | G-418-10 | |
| www.goldbio.com Hygromycin | Gold Biotechnology | H-270-1 | www.goldbio.com |
| 1350 psi Rupture Discs | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
| מסכי עצירה | Bio-Rad | 165-2336 | |
| http://www.bio-rad.com Macrocarriers דיסקים | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
| YPD Broth | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
| אגר | בקטון דיקינסון ושות' | 214530 | www.bd.com |
| סורביטול | פישר סיינטיפיק | BP439 | http://www.fishersci.com |
| PDS-1000/He מערכת | Bio-Rad | 165-2257 | |
| מיקרוסקופ | http://www.bio-rad.com Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
| KOD ערכת PCR צעד אחד | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
| One ערכת שלב RT-PCR | Qiagen | 210212 | אשף www.qiagen.com |
| ערכת טיהור DNA גנומי | Promega | A1120 | www.promega.com |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| www.qiagen.com מיני מקצף חרוזים - 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
| מיקרופוגה 18 צנטריפוגה | בקמן קולטר | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
| ספקטרופוטומטר מיקרופלייט | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |
מקורות
- Price, M. S., et al. Cryptococcusneoformans requires a functional glycolytic pathway for disease but not persistence in the host. MBio. 2, e00103-e00111 (2011).
- Bubb, W. A., et al. Heteronuclear NMR studies of metabolites produced by Cryptococcusneoformans in culture media: identification of possible virulence factors. Magn Reson Med. 42, 442-453 (1999).
- Himmelreich, U., et al. Identification of metabolites of importance in the pathogenesis of pulmonary cryptococcoma using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Microbes Infect. 5, 285-290 (2003).
- Wright, L., et al. Metabolites released by Cryptococcusneoformans var. neoformans and var. gattii differentially affect human neutrophil function. Microbes Infect. 4, 1427-1438 (2002).
- Hu, G., Cheng, P. Y., Sham, A., Perfect, J. R., Kronstad, J. W. Metabolic adaptation in Cryptococcusneoformans during early murine pulmonary infection. Mol Microbiol. 69, 1456-1475 (2008).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Davidson, R. C., et al. Gene disruption by biolistic transformation in serotype D strains of Cryptococcus neoformans. Fungal Genet Biol: FG & B. 29, 38-48 (2000).
- Toffaletti, D. L., Rude, T. H., Johnston, S. A., Durack, D. T., Perfect, J. R. Gene transfer in Cryptococcusneoformans by use of biolistic delivery of DNA. J. Bacteriol. 175, 1405-1411 (1993).
- Edman, J. C., Kwon-Chung, K. J. Isolation of the URA5 gene from Cryptococcusneoformans var. neoformans and its use as a selective marker for transformation. Mol Cell Biol. 10, 4538-4544 (1990).
- Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. Complementation of a capsule-deficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence. Mol Cell Biol. 14, 4912-4919 (1994).
- Del Poeta, M., et al. Topoisomerase I is essential in Cryptococcusneoformans: role In pathobiology and as an antifungal target. Genetics. 152, 167-178 (1999).
- McClelland, C. M., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. High frequency transformation of Cryptococcusneoformans and Cryptococcusgattii by Agrobacteriumtumefaciens. Fungal Genet Biol:FG & B. 42, 904-913 (2005).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Nicola, A. M., Frases, S., Casadevall, A. Lipophilic dye staining of Cryptococcusneoformans extracellular vesicles and capsule. Eukaryot Cell. 8, 1373-1380 (2009).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
