Баллистической трансформации является метод, используемый для генерации стабильной интеграции ДНК в геном оппортунистических neoformans Cryptococcus патоген через гомологичной рекомбинации. Покажем баллистической трансформации в конструкции, имеющей ацетат ген, кодирующий слитый киназы в флуоресцентной метки mCherry в C. neoformans.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Баллистической трансформации флуоресцентного Tagged гена в оппортунистических грибковых возбудителя
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Базидиального Cryptococcus neoformans, инвазивных патогенных микроорганизмов центральной нервной системы, является наиболее частой причиной грибкового менингита во всем мире, в результате чего более 625 000 человек в год по всему миру. Хотя электропорации была разработана для преобразования плазмид в Cryptococcus, только биолистическую доставка обеспечивает эффективное средство для преобразования линейной ДНК, которые могут быть интегрированы в геном путем гомологичной рекомбинации.
Ацетат было показано, что основным продуктом ферментации при криптококковой инфекции, но значение этого, пока не известно. Бактериальные путь состоит из ферментов, ксилулозо-5-фосфат / фруктозо-6-фосфат phosphoketolase (Xfp) и ацетат киназа (ACK) является одним из трех возможных путей ацетата производства в С neoformans. Здесь мы демонстрируем баллистической трансформации в конструкции,,который ген, кодирующий Ack слит с флуоресцентной меткой mCherry, в С. neoformans. Мы затем подтвердите интеграции слияния ACK -mCherry в локус ACK.
Введение
Cryptococcus neoformans, инвазивный условно-патогенный микроорганизм центральной нервной системы, является наиболее частой причиной грибкового менингита, приводящего к более чем 625 000 смертей в год во всем мире 1. Было показано, что ацетат является основным продуктом ферментации во время криптококковой инфекции 2,3,4, а гены, кодирующие ферменты из трех предполагаемых путей, продуцирующих ацетат, активируются во время инфекции 5. Это говорит о том, что производство и транспортировка ацетата могут быть необходимой и обязательной частью патогенного процесса; Однако значение этого до сих пор не понято. Одним из возможных путей производства ацетата является ксилулоза-5-фосфат/фруктоза-6-фосфат-фосфокетолаза (Xfp) - ацетаткиназа (Ack), путь, ранее считавшийся присутствующим только в бактериях, но недавно идентифицированный как у эуаскомицетов, так и у базидиомицетовых грибов, включая C. neoformans 6.
Чтобы определить локализацию этих ферментов этого пути в клетке, конструкция, несущая ген устойчивости к неомицину вниз по потоку слияния гена ACK с флуоресцентной меткой mCherry (ACK:mCherry:Neo), будет введена в C. neoformans с использованием хорошо зарекомендовавшего себя метода биолистической трансформации 7,8. Хотя электропорация является эффективным методом трансформации плазмид, которые будут поддерживаться в качестве эписом, в Cryptococcus 9, она не полезна для создания стабильных гомологичных трансформантов 8. Только биологическая доставка с помощью генной пушки обеспечивает эффективные средства для трансформации линейных ДНК, которые будут интегрированы в геном путем гомологичной рекомбинации. Например, Edman et al. показали, что из трансформантов, полученных в результате электропорации плазмидного селективного маркера URA5 в мутанты C. neoformansura5, только от 0,001 до 0,1% трансформантов были стабильными. Chang et al. достигли эффективности стабильного преобразования всего 0,25% с использованием электропорации для восстановления производства капсул у акапсулярного мутанта 10. В отличие от электропорации, было показано, что биолистическая трансформация приводит к стабильной эффективности трансформации от 2 до 50% в зависимости от гена, который изменяется 7,8,11.
Этот визуальный эксперимент обеспечит пошаговую демонстрацию биолистической трансформации линейной конструкции ACK:mCherry:Neo DNA в C. neoformans, а также опишет, как подтвердить его правильную интеграцию через гомологичную рекомбинацию в локус ack. Показанный здесь протокол является модификацией метода, разработанного в лаборатории Perfect 8.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Общая схема этого протокола указано на рисунке 1.
1. C. neoformans Подготовка
- Для каждой реакции трансформации, вырастить 2-3 мл O / N культуру C. neoformans в YPD среде при 30 ° С встряхивании при 250 оборотах в минуту.
- Центрифуга O / N культуру в течение 5 мин при 900 х г при 10 ° С и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют каждый осадок клеток в 300 мкл дрожжей пептон декстроза (YPD) среде.
- Используя стеклянные шарики, аккуратно распространяется 300 мкл промытой клеточной суспензии на YPD агаре, содержащем 1 М сорбит.
- Разрешить пластин высохнуть при комнатной температуре в течение 3-4 ч.
2. Золото микроносителю Подготовка
- Ресуспендируют 0,25 г 0,6 мкм золотым бисером в 1 мл DDh 2 O, центрифуги в течение 1 мин при 900 мкг для осаждения бусы, и удалить супернатант.
- Ресуспендируют золотые бусины в 1 мл 100% -ного этанола.
- Распределить шарики в 4 пробирки, 250 мкл каждого из них и добавить 750 мкл 100% -ного этанола.
- Хранить золото шарик аликвоты при 4 ° С.
3. Подготовка ДНК
- Подготовка оранжевые диски macrocarrier биолистическую, погружая их в 100% этаноле с использованием щипцов. Место диски в большом чашку Петри, содержащую drierite высохнуть (убедитесь, что drierite не касается дисков).
- После высыхания, нажмите macrocarrier диски в держатели серебро дисков (ранее протирать 100% этанола).
- Vortex золотым бисером (полученного, как в шаге 2) и аликвоту 12 мкл в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, одну трубку в трансформации.
- Добавить в каждую пробирку с тем: 2 мкг ДНК (предпочтительно 2 мкл 1 мкг / мкл ДНК) 10 мкл 2,5 М CaCl 2, и 2 мкл 1 М спермидина свободного основания.
- Установка отрицательный контроль, как на стадии 3,4, но без ДНК.
- Vortex каждая трубка и инкубировать при комнатной температуре в течение5 мин. Аккуратно вылить каждую пробирку иногда ресуспендировать осевшие шарики во время инкубации.
- Побочные трубы на 225 мкг в течение 30 сек для осаждения ДНК-покрытием золотым бисером. Осторожно удалите супернатант (с помощью пипетки или аспирации) и выбросьте.
- Ресуспендируйте шарики полностью в 600 мкл 100% этанола, медленно пипетки вверх и вниз.
- Спин трубы на 225 мкг в течение 30 сек для осаждения шариков без упаковки. Осторожно снимите и выбросьте супернатант.
- Ресуспендируют ДНК покрытием золотые шарики в 8 мкл 100% этанола, медленно пипетированием вверх и вниз.
- Пипетки ДНК покрытием золотые шарики на центре баллистической диска диаметром в 1 см и дать высохнуть.
Примечание: сушили золотой круг видно на центре баллистической диска указывает, что достаточной концентрации золота шариков присутствует.
ПРИМЕЧАНИЕ: macrocarrier загруженных дисков с помощью ДНК-покрытием золотым бисером готовы для использования с генной пушки.
4. Operating в генной пушки
- Включите вакуумный насос.
- Включите газообразного гелия, повернув ручку против часовой стрелки до давления примерно 2200 фунтов на квадратный дюйм достигается на манометр.
- Включите генной пушки, щелкая красный выключатель слева.
- Будьте уверены, что скорость потока для вакуума и вентиляционных настраиваются таким образом вакуум достигнет 28 дюймов ртутного столба в течение 15 сек.
- Будьте уверены, расстояние между разрывным диском и macrocarrier примерно 3/8 дюйма.
- Очистите всю камеру, вытирая с этанолом.
- Погрузите разрывные мембраны в 100% этанола. Дайте высохнуть на стерильную поверхность (например, чашка Петри).
- Используйте динамометрический ключ, чтобы ослабить фиксатор разрыв диска. Вставьте чистую разрывного диска в держатель. Винт держателя разрывной диск на место и затяните динамометрическим ключом, поворачивая его один раз вправо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрыв диски будут заменены после каждого выстрела. - Погрузитесь-йе сетка фильтра в 100% -ном этаноле. Дайте высохнуть на стерильную поверхность (например, чашка Петри).
- После высыхания, поместите экран мыть сетки на белый пластик с монтажной панелью. Поместите macrocarrier диска сторону держатель ДНК вниз в диск камеры. Винт на серебряной крышкой и поместите монтажную пластину в высоком слот.
ПРИМЕЧАНИЕ: сетчатый экран будет заменен после каждого выстрела. - Поместите YPD агаровую пластину, содержащую 1 М сорбит на нижней пластине.
- Завершение отсека и зафиксируйте на месте.
- Нажмите и удерживайте среднюю красный переключатель вверх заниматься вакуум и позволить вакуум, чтобы достигнуть 28 дюймов ртутного столба. После того, как надлежащий уровень вакуума достигается, переместите этот переключатель в нижнее положение. Когда все будет готово, нажмите и удерживайте красную кнопку справа, чтобы стрелять. Когда разрыв диска появляется, сразу же отпустите кнопку пожара и нажмите среднюю красный переключатель в среднем положении, чтобы выразить камеру до 0 фунтов на квадратный дюйм.
- Очистите разрыв диска мусор и выключите генной пушки. Затем выключите heliuм газа, повернув ручку по часовой стрелке и, наконец, выключите вакуумный насос.
5. Покрытие трансформированных клеток
- Разрешить преобразование пластины, чтобы сидеть при комнатной температуре в течение 4 часов, чтобы клетки для восстановления.
- Пипеток 700 мкл YPD на тарелку. Используйте сотовый скребок, чтобы мягко очистить клетки прочь агара и пипетки жидкости в стерильный 1,5 мл пробирке. Повторите этот шаг, чтобы убедиться, что все клетки были извлечены из пластины.
- Гранул клетки при 225 мкг в течение 30 сек. Снимите и выбросьте супернатант.
- Ресуспендируют осадок в 500 мкл YPD.
- Внесите 100 мкл клеточной суспензии на центре + плит YPD антибиотиков и распространяется, используя стеклянные бусы.
- Оставьте перевернутые тарелки при комнатной температуре в течение 3-4 дней. Как появляются колонии, патч на новой YPD + антибиотиков пластин.
6. Геномная выделения ДНК для ПЦР
ПРИМЕЧАНИЕ: Это модифицированная версия с использованием реагентас из комплекта очистки ДНК (табл материалов).
- Выращивают культуры в 5 мл каждого из С neoformans трансформанты в YPD жидкости при 30 ° C встряхивании при 250 оборотах в минуту O / N.
- Гранул 3 мл клеток при 900 мкг, и ресуспендируют в 600 мкл ядер решения лизиса.
- Добавить суспензии в новой 1,5 мл микроцентрифужных трубки с 200 мкл 0,5 мм кислоты промывают стеклянные шарики.
- Однородный в течение 45 секунд в мини beadbeater при температуре окружающей среды, прохладном трубки на льду, и повторить.
- Разрешить образца оседать на льду в течение 2 мин и передавать супернатант в новую пробирку 1,5 мл. Добавить 200 мкл раствора осаждения белка в каждую пробирку, (100 мкл на каждые 600 мкл супернатанта восстановленного) и вихрь энергично в течение 20 сек.
- Разрешить образцы поселиться на льду в течение 5 мин и центрифуге при 11000 мкг в течение 3 мин.
- Передача супернатант в чистую пробирку, содержащую 1,5 мл 300 мкл RT изопропанола. Аккуратно перемешать инверсии.
- Центрифуга образцы на 11000 мкг в течение 2 мин, осторожно удалить супернатант, и слейте трубы на бумажные полотенца.
- Добавить 300 мкл RT 70% этанола в каждую пробирку и осторожно инвертируют, чтобы промыть осадок.
- Центрифуга образцов при 11000 мкг в течение 2 мин и осторожно удалите всю этанола.
- Слейте трубки на чистые бумажные полотенца, и позволяют гранулы высохнуть на воздухе в течение 10-15 мин.
- Добавить 50 мкл регидратации ДНК раствора и 1,5 мкл раствора РНКазы на каждую гранулу и вихря.
- Центрифуга образцы в течение 5 секунд, чтобы удалить всю жидкость из колпачка.
- Инкубируйте образцы при 37 ° С в течение 15 мин.
- Увлажняет ДНК путем инкубации образцов при 65 ° С в течение 1 часа.
- Количественная ДНК спектрофотометрически путем измерения оптической плотности при 260 нм (260 считывания 1,0 эквивалентно ~ 50 мкг / мл двухцепочечной ДНК), и использовать до 200 нг в каждой реакции ПЦР.
7. РНК Изоляция дляРевертазам-ПЦР.
- Использование очистки РНК комплект (смотрите таблицу материалов), следовать инструкциям производителя, чтобы изолировать РНК из клеток дрожжей при использовании minibeadbeater.
- Количественная концентрации РНК путем измерения оптической плотности при 260 нм (260 считывания 1,0 эквивалентно ~ 40 мкг / мл одноцепочечной РНК).
- Использование комплекта RT-PCR (смотрите таблицу материалов), следовать инструкциям производителя, чтобы установить RT-PCR реакции с примерно 1 мкг РНК. Для результатов, полученных в этом исследовании, использование праймеров, перечисленных в таблице 1.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Успешный баллистической трансформации С. neoformans можно получить, пройдя по этой схеме протокола (рисунок 1). С баллистической трансформации, успешно стрелять из покрытых золотом шариков обозначено золотое кольцо видимой на пластине после выстрела ДНК (Фигура 2А). Колонии должны появляться пределах от 4 до 5 дней, когда оставляют при комнатной температуре после посева клеток восстановленные из сорбита пластин YPD + 1M на селективной среде. Преобразование 2 мкг ДНК должно прив...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Используя этот протокол, можно осуществить биолистическую трансформацию, при которой линейная ДНК интегрируется в желаемый локус в геноме Cryptococcus neoformans путем гомологичной рекомбинации. Определенные шаги в протоколе могут оказать существенное влияние на эффективность/результативность преобразования. Для успешной трансформации крайне важно, чтобы ДНК, используемая в побеге, имела концентрацию не менее 1 мкг. Тем не менее, объем ДНК, добавляемой к золотым бусинам, может быть увеличен с вероятностью того, ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана награды от Национального научного фонда (премии # 0920274) и Южная Каролина опытная станция проекта SC-1700340. Эта статья isTechnical Вклад No. 6283 из опытной станции Университет Клемсона. Авторы благодарят доктора Лукаш Kozubowski за полезные советы в развитии этого итогового протокола и д-р Шерил Ingram-Смит, Кэти Гленн, и Грейс Kisirkoi их критическое прочтение рукописи.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,6 μ m Золотые бусины | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
| Безспермадиновая основа | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
| G418 - Сульфат (Неомицин) | Золото Биотехнология | G-418-10 | www.goldbio.com |
| Гигромицин | Золото Биотехнология | H-270-1 | www.goldbio.com |
| 1350 фунтов на квадратный дюйм Разрывные диски | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
| Остановочные экраны | Bio-Rad | 165-2336 | http://www.bio-rad.com |
| Макроносители диски | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
| YPD Broth | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
| Агар | Бектон Дикинсон и Ко. | 214530 | www.bd.com |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | http://www.fishersci.com |
| PDS-1000/He System | Bio-Rad | 165-2257 | http://www.bio-rad.com |
| Микроскоп | Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
| KOD One Step PCR Kit | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | www.qiagen.com |
| Wizard Набор для очистки геномной ДНК | Promega | A1120 | www.promega.com |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | www.qiagen.com |
| Mini Beadbeater - 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
| Microfuge 18 | Centrifuge Beckman Coulter | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
| Микропланшетный спектрофотометр | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |
Ссылки
- Price, M. S., et al. Cryptococcusneoformans requires a functional glycolytic pathway for disease but not persistence in the host. MBio. 2, e00103-e00111 (2011).
- Bubb, W. A., et al. Heteronuclear NMR studies of metabolites produced by Cryptococcusneoformans in culture media: identification of possible virulence factors. Magn Reson Med. 42, 442-453 (1999).
- Himmelreich, U., et al. Identification of metabolites of importance in the pathogenesis of pulmonary cryptococcoma using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Microbes Infect. 5, 285-290 (2003).
- Wright, L., et al. Metabolites released by Cryptococcusneoformans var. neoformans and var. gattii differentially affect human neutrophil function. Microbes Infect. 4, 1427-1438 (2002).
- Hu, G., Cheng, P. Y., Sham, A., Perfect, J. R., Kronstad, J. W. Metabolic adaptation in Cryptococcusneoformans during early murine pulmonary infection. Mol Microbiol. 69, 1456-1475 (2008).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Davidson, R. C., et al. Gene disruption by biolistic transformation in serotype D strains of Cryptococcus neoformans. Fungal Genet Biol: FG & B. 29, 38-48 (2000).
- Toffaletti, D. L., Rude, T. H., Johnston, S. A., Durack, D. T., Perfect, J. R. Gene transfer in Cryptococcusneoformans by use of biolistic delivery of DNA. J. Bacteriol. 175, 1405-1411 (1993).
- Edman, J. C., Kwon-Chung, K. J. Isolation of the URA5 gene from Cryptococcusneoformans var. neoformans and its use as a selective marker for transformation. Mol Cell Biol. 10, 4538-4544 (1990).
- Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. Complementation of a capsule-deficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence. Mol Cell Biol. 14, 4912-4919 (1994).
- Del Poeta, M., et al. Topoisomerase I is essential in Cryptococcusneoformans: role In pathobiology and as an antifungal target. Genetics. 152, 167-178 (1999).
- McClelland, C. M., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. High frequency transformation of Cryptococcusneoformans and Cryptococcusgattii by Agrobacteriumtumefaciens. Fungal Genet Biol:FG & B. 42, 904-913 (2005).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Nicola, A. M., Frases, S., Casadevall, A. Lipophilic dye staining of Cryptococcusneoformans extracellular vesicles and capsule. Eukaryot Cell. 8, 1373-1380 (2009).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
