Abstract
アルコール使用障害（AUD）深刻な健康上の課題です。 AUDへの大規模な遺伝性の構成要素にもかかわらず、いくつかの遺伝子が明確に彼らの病因に関与している。ミバエ、 キイロショウジョウバエは 、アルコール関連行動の根底にある分子遺伝学的メカニズムを探索するための強力なモデルであるため、識別し、AUDに影響を与える遺伝子の機能を理解するための非常に有望である。研究は、これらのタイプのためのショウジョウバエモデルの使用を確実にエタノールへの行動応答を測定するアッセイの利用可能性に依存する。このレポートでは、ハエでエタノールの感度と迅速な寛容性を評価するための適切なアッセイを説明しています。このアッセイで測定されたエタノール感受性ハエ、試験の直前に食物なしに収容されているボリュームと使用のエタノール濃度、以前に報告された遺伝子操作で、さまざまな時間の長さも影響される。対照的に、エタノールのこのアッセイで測定されたensitivityフライ取り扱い、ハエの性別、および抗生物質または生酵母と成長培地の補充の活力に影響されない。エタノール感受性を定量するための3つの異なる方法は、すべて本質的に区別できないエタノール感度の結果につながる、記載されている。比較的低経費アップを設定するには、その全体的なシンプルさと組み合わせたこのアッセイのスケーラブルな性質は、エタノール感度やショウジョウバエの急速な寛容の小規模および大規模な遺伝子解析に適したもの。
Introduction
アルコール使用障害（AUD）（1に概説される）世界的な巨大な健康問題である。 AUDの開発を駆動するメカニズムは複雑ですが、これらの疾患は、主要な遺伝的要素を持っている（ 例えば、2）。 AUDと保存された行動反応の大遺伝はより良いの分子基盤を理解するためのエタノール関連行動における特定の遺伝子の関与を調査するために、遺伝的モデル生物を使用することに強い関心を生成している（3,4で検討）は、多くの種にわたってエタノールへAUD。ミバエ、キイロショウジョウバエは、（3,4で見直 し）エタノール関連行動の分子遺伝学的メカニズムを探索するための主要なモデル生物として浮上している。ハエの研究は（5で検討）のエタノールへの行動反応のいくつかのシグナル伝達経路のための役割を強調している。興味深いことに、遺伝子および経路のいくつかの行動RESPONSに影響を与えることハエでエタノールのESはまたげっ歯類エタノール関連行動および/ またはヒトAUD（ 例えば、6-14）に関与している。 ショウジョウバエモデル系で利用可能な遺伝学的ツールのスイートと相まって種にわたってエタノール関連行動を駆動するメカニズムの保全は、エタノールへの行動反応の遺伝学を調査するためのショウジョウバエモデルの有用性を強調する。
感度15,16及びヒトでエタノールに（17に概説）耐性はAUDの開発にリンクされている。エタノールへのこれらの行動反応の両方が（3,4で検討）実験室の種々のアッセイを経由してハエにモデル化することができます。著者らに知られているフライアッセイのすべては、時間依存エタノール誘発鎮静/協調不能またはエタノールの鎮静からの時間依存性の回復のいずれかに基づいている。
エタノール感度とrの遺伝学上の私たちのグループから前回の記事でショウジョウバエ APID耐性が、ハエのエタノール蒸気誘導性の鎮静に基づいて行動アッセイは、18を使用した。このアッセイにおける試験は、ライブ大人を転送することによって開始されたセルロースアセテートプラグの上部（ すなわち、非フライ側）にエタノールを加え、酢酸セルロースプラグ付きバイアル中のハエトラップ、餌バイアルを空に麻酔なしハエ、およびシリコーンストッパー（18を参照すると、 図S3に概略参照）ハエ、セルロースアセテートプラグおよびエタノールを含有するバイアルを密封する。ハエの異なるグループを表す複数のバイアルは、このアッセイのスループットを向上させる、並行して評価した。バイアルを匿名コードを与えられたと実験者は鎮静の評価において意図しない偏りを防ぐために、処置群を知らされた。標準実験では、バイアルにハエは6分間隔で穏やかにタッピングし、30秒の回復後、各バイアル中の鎮静さハエの数を数え、converteパーセントの活性ハエにD。ハエは、内部エタノール18および鎮静（本報告書でのCF参照18および図1Aおよび1B）の漸進的増加を引き起こし、時間依存的に酢酸セルロースプラグからエタノール蒸気を吸収した。このアッセイにおける鎮静は操作上ハエ（I）歩行の不在に立っまたは（ii）で、またはそれらの羽ばたくことなく、彼らの背中に横たわっていると定義した。ここで、このエタノールの鎮静作用アッセイを詳細に記載され、それを使用に関連するさらなる操作上の最適化が提供され、そしてアッセイは、フライ鎮静感度に対する食物補充オプションの寄与をアドレス指定するために使用される。
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Protocol
アッセイの前に1日
- 11（シングル性別）短い下（1-5分）CO 2のグループにおける生鮮食品バイアルにハエを収集します。
- ハエは、環境的に制御された空間（典型的には25°C、相対湿度60％、12時間の明/暗サイクル）において食物バイアル中にO / Nを回復することを可能にする。
- 計画された実験のための適切な最終濃度（複数可）に精製された（≥18MΩ）水中の純粋な（100％）エタノールを希釈することによりエタノール溶液（単数または複数）を準備する。溶液（S）は、RT O / Nに戻ることができるようにします。
注：エタノールの希釈は、発熱性である。
アッセイの2日目
- ハエの各バイアルを試験するために、きれいな、空の食品バイアル（i）を調製する。すなわち、（ 表3参照）（ii）の新規セルロースアセテートプラグ、（iii）のシリコーンストッパー及び（iv）のエタノール溶液1mlを、バイアルを試験する。
- 百分の55から65に20〜25℃の温度および相対湿度を調整することにより、試験室を準備します。
- 別の労働者を持っているバイアルの各グループに一意のコードを割り当て、後でコードを記録する。少数分間順応さ試験室にハエでコード化されたバイアルを置きます。
- 2.3からフライバイアル上のコードと一致するように空のテストバイアルにラベルを付けます。
- 表1に似てスプレッドシート内の列（1列/バイアル）にコードを入力することで、ハードコピーのテストログを構築します。
- ガイドとして、テストログを使用して、試験室で配列をマッチングにハエや空のテスト用バイアルにコード化された食品のバイアルを手配。
注：テストするバイアルの合理的な最大数は24である（ すなわち、4バイアルそれぞれの6セット）。 - 転送がマッチした/ラベル空のテストバイアルに食品バイアルから飛ぶと、すぐにセルロースアセテートプラグが2センチメートルバイアルのトップスを下回るまで、テストのバイアルにセルロースアセテートプラグを挿入します。
- 以下、千鳥1分間隔でセットとして4バイアルの各行を処理します。
- 時間0評価のために、wは個別に各バイアルを把握i番目の親指と人差し指、バイアルの底にハエをノック30秒待ってから、死んだ/不動であるハエの数をカウントするテーブルの上に静かに3回タップします。ハードコピーテスト·ログに一度に0分を各バイアルのための不動/死んだハエの数を記録します。
- タイマーが時間0で連続的にカウントアップを起動し、すぐに4バイアルの最初の行/セット用バイアル中にセルロースアセテートプラグにエタノール1mlを加え始める。それらがテストされるために、5秒間隔で、バイアル中のセルロースアセテートプラグにエタノール1mlを加える。エタノールは、セルロースアセテートプラグ全体に均一に吸収されるように円を描くようにセルロースアセテートプラグにエタノールを加える。エタノールは、セット内のすべての4試験バイアルに追加されたとき、それを密封するために、各バイアルシリコーンプラグを差し込む。
- 時間1、2、3、4、5分で、それぞれ、4つのバイアルの第二、第三、第四、第五及び第六のセットにエタノール1mlを加える。後にシリコーン栓を挿入し続けます4バイアルの各セットにエタノールを添加すること。
- 時間6分で、親指と人差し指で各バイアルを把持し、バイアルの底にハエをノックテーブルに静かに三回タップ、30秒待ち、その後の合計数をカウントし、記録することによって、4つのバイアルの一組をテストする鎮静されているハエ。スコアは、彼ら（i）は、バイアルの床の上に立ったが、あるいは彼らの羽ばたくことなく、彼らの背中の上を歩く又は（ii）嘘をつかない場合は、鎮静さとして飛ぶ。
- 表2のスケジュールを使用して5秒間隔でセット内の各バイアルを処理します。
- 最初のセットのために行われたように7倍、8、9、10および11分の時点で、それぞれのバイアルの第2、第3、第4、第5および第6のセットをテスト。
- 時間12分で2.12に記載のように、再び4つのバイアルの最初のセットをテストし、それぞれ、13、14、15、16及び17分でのバイアルの第二、第三、第四、第五及び第六のセットをテストし続ける。
- 2.12で説明したように、すべてのハエがSになるまで、テストのハエを続行edated。
- ハードコピー·テスト·ログの各バイアルにハエの合計数を入力します。ハエの総数から時間0で不動/死んだハエを検閲。
- 時間（x軸）対％活性ハエ（y軸）として、各評価時点でのパーセントの活性ハエプロットデータを算出する。三次多項式またはシグモイド曲線から50値（ST50、50％の鎮静までの時間）が収まるまたは曲線下面積を計算鎮静時間を補間することにより、エタノールの鎮静を定量する。
- デコードされたバイアルからデータをコンパイルし、統計分析を行う（ 例えば、一方向ANOVAボンフェローニの多重比較検定付き）実験計画のために、必要に応じて。
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Representative Results
このエタノールの鎮静作用アッセイからの生データは、エタノール蒸気暴露時間の関数として鎮静化されたハエの数である。生データは、時間の関数としてパーセント活性ハエに変換される（一次データ1Aの図、B、D - F）。曲線がフィットするから、一次データからのエタノール鎮静に対する感度が補間を経由して、鎮静時間50（ST50）として曲線（AUC）下の鎮静さまたはAEAになるためにハエの50％に要する時間を定量することができる。以前は予想通りS字状の曲線は幾分良好（平均R 2 = 0.997、N = 24、プライマリ·データに合わせても18三次多項式曲線は、（平均R 2 = 0.934、N = 24、 図1A）も主要なデータを適合報告した。 図1B）。カーブフィットからST50の値を決定する代わりに、一次データからのエタノールの鎮静感度も面積として定量することができる曲線下（ 図1C）（AUC、％活性ハエは時間をX）。定量の3つの方法からの結果は、互いに非常によく相関（ピアソンのr 2を ≥0.998はn = 24）とユニットはST50（分）およびAUC（活性％は必ずしも異なるが、本質的に区別できない（ 図1C）である）×時間を飛ぶ。その他すべての計算に関する詳細は、使用されるスプレッドシートには、対応する作者から入手可能である。高く、ST50（またはAUC）の下位値はそれぞれ、鎮静をエタノールに平滑化し、強化された感度を示していることに注意してください。以前の報告18との一貫性を保つため、三次の多項式曲線のフィットから得られST50値はこのstudy.Importantlyの残りの部分で使用された、アッセイはSCBでCnx14D（ 図1D）との突然変異に対するRNAiの効果を検出する（ 図1E） 、ARUとhppy（ 図1F）、
このアッセイの日常的な使用中に、2mlのエタノールで湿らせたセルロースアセテートプラグがバイアルのタッピングすることにより、潜在的にハエ「無料を変更する、いくつかの個々の実験（図示せず）内にいくつかのバイアルの底部に向かって移動するセルロースアセテートプラグを引き起こし空間及びエタノール蒸気の濃度。それらはまた、エタノールの液体に暴露されたこれらのアッセイに飛ぶ可能性を高め、2mlのエタノール（ 図2A）で濡らしたときさらに、約0.25ミリリットルのエタノールを、セルロースアセテートプラグの底部（ すなわち、側フライ）に達しエタノール蒸気に。 2ミリリットル〜1 mlの酢酸セルロースプラグ中のエタノールの量を減少させることcellulosの下向きの移動をなくす激しいタップ（図示せず）、またセルロースアセテートプラグ（ 図2A）の底部のエタノール溶液の測定可能な量を除去した後も、アッセイ中に電子アセテートプラグ。ハエの鎮静は、さらには1ミリリットル（ - C図1A）よりも少ない容量で使用されるエタノールの容積に敏感であった。 1mlのエタノールを使用すると、したがって、アッセイ中にハエのために一定のオープンスペースを維持するのに役立ちますし、液体エタノールを摂取されていないことを保証します。ハエは、したがって、おそらく、単に、このアッセイにおいて蒸気としてエタノールにさらされている。 （ すなわち、85％（体積/体積）エタノールを1mlの蒸気）と[A]ハエワット古い1-5日は、特に断らない限り、ここで報告されたすべてのその後の研究に使用した85％エタノール1mlを。
24バイアルを用いた実験では、ハエの実験（ すなわち、周期の）妥当な所定schedul上のすべてのバイアルを評価することを可能にするために6分間隔で穏やかにタップされているE。少ないバイアル5分間隔を使用して対照ハエでの研究からST50sは6分間隔での研究からST50sに匹敵した（データは示さず）。ハエは、従来各バイアル中のハエの鎮静状態を決定するシーケンスの4つのバイアルのセットをタップし、実験の時間を可能にするためにタップした後に鎮静30秒間評価される。インパクトエタノール鎮静感度をタップした後に活力や回復時間をタップの違いは、男性と女性の対照ハエでST50値は通常のタップ中（ハードディスク）（通常サイズ）または非常に鋭く測定し、標準30秒以上60秒後にされたかどうかを判断するには回復。タッピング活力（ 図2B）および回復時間（ 図2C）は、制御男性または女性におけるST50値に対して測定可能な効果を有さなかった。
抗生物質は、フライ食品培地における細菌の増殖を抑制するために用いることができる。抗生物質を食品媒体の補充はエタノール鎮静感度に影響を与えるかどうかを判断するには、ST50値三抗生物質（;テトラサイクリン、20μgの/ mlのクロラムフェニコール、125 / mlのアンピシリンを100μg/ ml）の存在下または非存在下で一世代飼育ハエで測定した。これら三つの抗生物質に飼育ハエはエタノールの鎮静感度（ 図2D）に影響を及ぼさなかった。
ハエは、空の食品に転送され、バイアル-ので、事前の鎮静アッセイでエタノール蒸気にさらされることに〜5分、すぐに食料と水を奪われている。時間ハエの量は、アッセイの影響をエタノール鎮静感度を開始する前に、空の食品用バイアルに保たれているかどうかを判断するために、ハエは、6時間（ノーマルの少なくとも70倍）飢餓状態にし、その後、ST50値を測定した。 6時間飢餓が大幅に両方の男性と女性の対照ハエ（ 図2E）にST50sを減少させた。 ST50に飢餓の影響は（これらの実験で百分の9から14まで）は比較的小さかったが、時間の量は、SPEを飛ぶND空のバイアル中でアッセイでエタノール蒸気にさらされる前には、実験内で、また実験間でグループ間で均一に保持してください。
実験室ハエ用食品は、子孫の産生を促進するために生酵母（ 例えば、18,20,23,24）を補充することができる。子孫の総数は20日間に生成されているが、例えば、生酵母（ サッカロミセス·セレビシエ ）を補充した食物バイアルは、以前に加熱殺菌酵母または無生酵母（d10の-d11の比較を、白色のバー、 図3A）を有するものよりも大人生産ライブおよび熱殺菌酵母（ 図3A）を補足したバイアル中で区別できなかった。酵母フライ食品にエタノールの意味のある量を産生生きる可能性に対処するために、食品の培地中では、（i）エタノール、ハエにおける（ii）のエタノール、およびハエ（iii）において、エタノールの鎮静感度に生酵母の効果を測定した。食品媒体は、生酵母に含まれるサブで補充熱殺菌あるいは全く酵母（ 図3B）を補充した食品に比べてエタノールのstantial量。それにもかかわらず、ライブを添加した培地上で増殖させた対照ハエは、殺されたりイーストは、内部エタノール（ 図3C）の区別できない低濃度を有していなかった。さらに、エタノール鎮静感度は熱殺菌されたか、生酵母（ 図3D）を添加した培地上で増殖させた対照ハエで区別できなかった。
図1（AC）鎮静アッセイデータ分析オプション。 W 制御 [A]、女性（1118同質遺伝子ワット 、ブルーミントンインディアナショウジョウバエストックセンターストック＃5905）が85％（体積/体積）エタノールの示されたボリュームから蒸気にさらされた。（A）鎮静経時データは、サードにフィット次の多項式。（B）鎮静タイムコースデータは、S字状のカーブにフィット。（左Y軸）のように定量（C）エタノール鎮静感度曲線（AUC、％の下で三次の多項式とシグモイド曲線や（右Y軸）の領域から補間ST50値アクティブハエ）は、時間をxは。エタノールの体積ではなく、分析方法、影響エタノール感受性（双方向ANOVA;体積の効果はp <0.0001;分析法、ナノ秒の効果はn = 8 /群; AUCデータの差を考慮するために1/100に形質転換神経系におけるCnx14D RNAiの。（D）式（ELAV-GAL4 / v5597）コントロールに平滑化し、エタノール感度相対（v5597 / +及びELAV-GAL4 / +からの値の大きさ）。（DF）代表の経時データ）。 （EとF）■CBの変異（SCB Vol2の ）とARU hppyの（8.128 ARU）強化されたエタノールの鎮静感度と突然変異（hppyKG5537）は 、対照と比較してエタノール鎮静感度を鈍らせ。 ST50は、18値としてEF内のデータは、以前に報告された。
鎮静アッセイにおける動作パラメータの図2の評価。セルロースアセテートプラグの底部2ミリメートル中のエタノールの（A）の量。 *ボンフェローニ;エタノールの量は、モック60分間の実験（一方向ANOVAのp <0.0001中にセルロースアセテートプラグの底部2ミリメートルに移動し、エタノールの体積に大きな影響を与えたセルロースアセテートプラグの上部に追加多重比較検定2mlの対0、1mlの、p <0.05でのn = 4）。エタノールは、セルロースアセテートプラグの質量の変化として定量した。（B）（レギュラーハード）のテスト中にバイアルをタップの活力も、影響を受けたST50sを試験したハエの性別（二ワットいずれAY ANOVA。 、NSタッピングの効果。性別、NSの効果。 。のn = 12）（C）回復タッピング後の時間や性別いずれもST50sに大きな影響（二元配置ANOVAを有し、回復時間の影響を、ナノ、性別、ナノ秒の効果; nは抗生物質= 6）（D）を含める。 （ATC;アンピシリン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコール）増殖培地中でST50sには全体的な影響を及ぼさなかったが、ST50（二元配置ANOVAに対する性別の影響があった。ATC、ナノ秒の効果;性別はp = 0.001の効果は、相互作用、NS;エタノール鎮静感度に飢餓のn = 6）の（E）の影響。 ST50sは通常、供給（FED）ハエに比べて6時間（スターブド）のために食料と水を奪わハエで有意に低かった。雄と雌でST50sは全体の区別がつかなかった（二元配置ANOVA、飢餓の影響、P <0.0001、性別、NSの効果であり、n = 12; *ボンフェローニの多重比較試験を、雄と雌で飢餓の影響、P <0.05） 。
成長、エタノール含有量および鎮静感度に生酵母の図3影響なし酵母（いいえY）を補充した食物培地を含むバイアルから（A）成体子孫、熱は、酵母（Y殺した）または生酵母（ライブY）を殺した。白バー、日10-11時の新興大人の子孫。灰色の棒、日12-20。すべての（10-20）日に、p <0.0001;日数10-11はp <0.0001;日数12-20はp = 0.0002;全体として、酵母処理は子孫の生産（一元配置ANOVAに大きな影響を与えたのn = 5 ）。すべて（10-20）日中に生成子孫の総数はありませんY（ボンフェローニの多重比較検定、p <0.05）よりも殺したYとライブYとのバイアルから大きかった。日10-11時には、ライブYとのバイアルを殺したYで殺さYおよびバイアルより多くの子孫を生成しませんY（白いバー、ボンフェローニ多重比較検定、P <0.05）よりも多くの子孫を生産した。 12-20日の間に、バイアルののWi殺しY番目食品培地（灰色の棒、ボンフェローニの多重比較検定、p <0.05）。（B）エタノール無しとバイアルと比較して、ライブ·Yを補充したバイアル中で有意に高かった無YまたはライブYをバイアルより子孫を産Yと殺したY（一方向ANOVAのp <0.0001、nは5;ボンフェローニの多重比較検定、p <0.05）（C）[A]メスのハエが著しく酵母補充によって影響されなかったワットの内部エタノール（ワン。分割バグレーANOVA、NS、N = 5-10）。 18は、説明したようにBとC中のエタノール含量を測定（D）ST50値が著しくワット男性または女性における酵母増殖培地の補充によって影響されなかった[A]（二元配置ANOVA;酵母、ナノ秒の効果、効果性別、NSのであり、n = 12）。
| バイアル→ | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| コード→ | ||||||||
| 合計＃→ | ||||||||
| 0分 | ||||||||
| 6分 | ||||||||
| 12分 | ||||||||
| 18分 | ||||||||
| 24分 | ||||||||
| 30分 | ||||||||
| 36分 | ||||||||
| 42分 | ||||||||
| 48分 | ||||||||
| 54分 | ||||||||
| 60分 |
表1：一般的なテストのログ 。プロトコルステップ2.5を参照してください。
| バイアル | タップ | 評価する |
| 1 | 6分0秒 | 6分30秒 |
| 2 | 6分5秒 | 6分35秒 |
| 3 | 6分10秒 | 6分40秒 |
| 4 | 6分15秒 | 6分45秒 |
表2：一般的なタップしてテストスケジュールプロトコルステップ2.13を参照してください。
| 材料/機器の名称 | 会社 | カタログ番号 | コメント/説明 |
| 食品バイアル | VWR | 89092-772 | 狭い |
| Flugs | ジェネシー/ flystuff.com | 49から102 | 狭い |
| シリコーンストッパー | フィッシャーサイエンティフィック | 09-704-1l | ＃4 |
| エタノール | 薬理Aaper | 111000200 | 200プルーフ |
表3：材料。
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Discussion
再現可能に意味のある表現型を定量簡単なアッセイは、行動の分析のために大きな価値がある。ここで説明する作業は、エタノールの鎮静感度とショウジョウバエの急速な許容範囲を測定するためのアッセイのいくつかの実用的な側面に対応しています。この作品の焦点ではないが、行動の分析は研究の中の被験者のための環境と遺伝的背景を一定に維持することによって促進される。さらに、比較は、典型的に飼育並べて試験したハエの群の間でなされるべきである。この目的のために、この作業で個々の実験内の全てのハエは同じ遺伝的背景を有し、標準的な食物培地で均一な環境条件（25℃、相対湿度60％、12時間の明/暗サイクル）下に並んで飼育した（10食品媒体を明示的に操作されたそれらの実験を除き％スクロース、3.3％のコーンミール、2％酵母および1％寒天）。
ETHここで説明サノール鎮静アッセイは安価で市販の供給源（ 表3）から容易に入手可能である全てが非常に少ない材料（プラスチックバイアル、セルロースアセテートプラグ、シリコーンストッパー及びエタノール）を必要とする。このエタノール鎮静アッセイは、（総合的に3,28にレビュー例えば、6,20,25-27、）は、以前に報告された方法に基づいて、大部分と類似しています。これらのアッセイの全ては、エタノールの鎮静感度を測定するための有用性を有しているが、ここに記載されるアッセイの利点は、（i）ハエは、アッセイ中に液体をエタノールに曝露されていない、（ii）のハエを低減する可能性が綿又は他の材料中に巻き込までき含むアッセイ中の試験バイアル中で、並行してハエの多くのグループをテストする（iii）の能力、および一次データセットからのエタノール感受性の客観的定量化のための（iv）の3つのオプション。一緒に、これらの利点は、主に、THAを飲むのエタノールを飛ぶ可能性を排除トンエタノール、それによって全体的な運動能力を阻害するハエの外表面を濡らすことができ、そしてアッセイにおけるハエの性能は、テスト環境で材料を交絡することに関連する困難によって混乱することができる。さらに、これらの利点は、アッセイの全体的なスループットと再現性を高める。さらに、このアッセイで測定されたエタノールの感度がトランスジーン一般ショウジョウバエ遺伝子分析に使用される遺伝的背景を用いた研究に適して、内因性の白色またはトランスジェニックマーカーミニホワイト 18の発現によって影響されない。
いくつかの重要なパラメータは、エタノールの鎮静アッセイからの信頼性のある結果を得るために制御されるべきである。成長環境と試験される株の遺伝的バックグラウンドを制御することに加えて（上記参照）、エタノールの体積濃度は、もちろん、エタノールの定量に非常に重要であるsensitiviTY。水中のエタノールの希釈は発熱反応であることに注意してください。したがって、希釈されたエタノール溶液前鎮静アッセイの開始前に室温に平衡化させるべきである。試験されるグループ間で均一化されるべき追加のパラメータは、ハエが鎮静アッセイを開始する前に、空の食品用バイアル中に収納されている時間の長さである。二つの追加のパラメータも制御されるべきである。バイアルあたりハエの数は、理想的であるべきである（a）すべてのバイアルおよびグループ内の同じ、（b）は
簡単に迅速にカウントすることができる数、および（c）は、比較的滑らかな鎮静タイムコースを可能にするのに十分に大きい数。イレブンバイアルが私たちの研究室でうまく機能を提示出発点である/飛ぶ。考慮すべき最後のパラメータは、鎮静アッセイで使用するハエの時代です。 1-10日齢のハエにおけるエタノールの鎮静感度に対する年齢のない再現性の効果が（データは示さず）が検出されていないが、若い年齢をマッチさせた動物の使用に思えるハエ29,30における年齢関連行動の変化に対して大きな文学与えられた正当化した。
その他のパラメータは、少なくともここで説明するパラメータの範囲を使用して、対照ハエをテストするときに、鎮静アッセイなどの重要ないないようです。セックス、タッピングの強さ、タップからの回復時間、および抗生物質（アンピシリン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコール）または生酵母とハエの餌の補充、ここで説明したように測定されたエタノールの感度を変化させない。同様に、プライマリ鎮静時間コースから三次の多項式曲線、S字状の曲線から補間、またはAUCの決定から補間によってエタノール感受性を定量データは、本質的に区別できない解釈につながる。セックスのは効果が一貫してここに記載された研究では観察されなかったが、いくつかのショウジョウバエ遺伝的背景におけるエタノール感受性にセックスの効果は31を報告されている。したがって、性別の影響があった可能性がある単にここで使用されるW [A]バックグラウンドでの遺伝的差異によってマスク。あるいは、 ショウジョウバエ行動反応に性別の影響を測定することはまだ同定されていないアッセイまたは成長条件として要求することが可能である。いずれの場合でも、推奨は、明示的に比較されている任意のグループの性別、鎮静アッセイにおいてできるだけ均一にすべてのパラメータを、作ることである。
生酵母フライ食品中のエタノールのかなりの量を生成することを考えると、それは、生酵母食品の補充がハエ内部エタノールを増加させなかったことを幾分驚くべきことであった。一つの可能な説明は、従って、選択的エタノールのないまたは比較的低濃度で食品を摂取する可能性があり、食品およびハエの表面全体にエタノールが均一に生成されないことである。さらなる研究は、この発見のためにこれと他の可能な説明に対処する必要があります。
アッセイdescribに対する変更の大多数EDはここに実験が実施されての目標に応じて可能です。例えば、実験で試験したバイアルの数は、各バイアルで試験したハエの数、使用されるエタノールの濃度と体積、エタノール曝露期間、鎮静の評価との間の時間間隔は、ハエの年齢および性別、試験し、および鎮静のための基準は、すべての個々の研究室のニーズに合わせて変更することができる。勧告は、最初にアッセイを学習するときに4バイアルの1または2個の基で開始し、プロジェクトに必要なスループットを提供バイアルの数を使用してスケールアップすることです。予想外に短いまたは長いST50sそれは、テストハエが麻酔時間は、麻酔のO / Nから回復させた（1-5分）ショートに供したことを確認するために良い習慣であるように、観察されるべきで、10日未満古い、であった物理的に取り扱い中に損傷しない、エタノール溶液で濡れていなかった、と運動障害を持っていなかった。
アッセイは、エタノール鎮静感度は唯一、したがって、設計またはエタノールに他の行動反応を評価するには適していません。ハエにおけるすべての既知のエタノール行動パラダイムと同様に、このアッセイは、主として通常の歩行能力を持っているハエを必要とし、したがって、障害のある運動との遺伝子型をテストするべきではありません。アッセイの別の制限は、バイアル中のエタノール蒸気の濃度は、おそらくセルロースアセテートプラグからの薬物が揮発として連続的に上昇していることである。ハエの内部エタノールがエタノール行動アッセイを飛ぶすべての時間で徐々に上昇するが、それはハエにエタノール蒸気の一定濃度を送達するこのアッセイからの結果の一貫性を向上させることができることが可能と思われる。エタノール蒸気の一定濃度を送達するための方法は、まだ検定は、ここに記載のスケールで使用することができるようになることが確認されていない。
エタノール鎮静ここに記載されるアッセイは、エタノール感受性および耐性の急速な18の遺伝的分析のために適している。成長環境、遺伝的背景、エタノールの濃度と体積は、時間ハエの量は、空の食品バイアルに費やし、そして使用されるハエの数と年齢がすべて制御されるべきである。これらのパラメータが適切に制御されていると仮定すると、鎮静アッセイは、 ショウジョウバエでエタノールに行動反応の分子基盤を調査逆転フォワード両方遺伝的アプローチに適しているべきである。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
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