Abstract
חולדה בוגרת ותאים אנושיים חוט השדרה גזע עצבי / אב (NSPCs) בתרבית בינונית מועשר גורם גדילה מאפשר להתפשטות של multipotent, ותאים עצביים להרחבה עצמי חידוש גזע. בתנאים בסרום, NSPCs multipotent אלה יבדיל, יצירת נוירונים, האסטרוציטים, וoligodendrocytes. הרקמה שנקטפו הוא ניתק אנזימים בפתרון פפאין-EDTA ולאחר מכן ניתקה מכאני ומופרד באמצעות שיפוע צפיפות רציף להניב השעיה תא בודדת שמצופית במדיום Neurobasal בתוספת גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF ), והפרין. NSPCs חוט השדרה עכברוש מבוגר בתרבית כריחוף ללא neurospheres וNSPCs חוט השדרה המבוגר אנושי גדלים כמו תרבויות חסיד. בתנאים אלה, NSPCs חוט השדרה המבוגר להתרבות, סמנים מפורשים של תאים מבשר, וניתן להרחיב ברציפות על מעבר. תאים אלה יכולים בהדואר למד במבחנה בתגובה לגירויים שונים, וגורמים חיצוניים ניתן להשתמש כדי לקדם את הגבלת שושלת לבחון התמיינות תאי גזע עצבית. Multipotent NSPCs או צאצאיהם גם ניתן להשתיל לתוך מודלים של בעלי חיים שונים כדי להעריך את תיקון משובי.
Introduction
NSPCs הם תאי multipotent מחויבים לשושלת העצבית שיכול לחדש את עצמו וללא קושי להרחיב במבחנה. אנו מתייחסים לתאים אלה כאוכלוסייה מעורבת של תאי גזע / עצביים שכן הם מציגים את המאפיינים של תאים עצמיים חידוש multipotent גזע ואבות יותר מוגבלים. NSPCs נמצא בשני המוח העוברי ובוגר וחוט השדרה 1,2. במבוגרים, NSPCs הם בדרך כלל שקט ומתגורר בתוך נישות ספציפיות כוללים אזור subventricular המצפה את החדרים לרוחב 2-4, ובאזור סביב חדרי המוח המקיף את התעלה של 5,6 חוט השדרה המרכזית.
בדרך כלל, NSPCs בתרבית כריחוף ללא neurospheres או monolayers חסיד כבמדיום סרום ללא תוספת EGF וbFGF, mitogens שבחרה עבור אוכלוסיות תאי גזע / אב. Assay neurosphere פותח במקור על ידי ריינולדס ווייס 2, הוא נפוץ ביותר לתרבות ולהרחיב תאי גזע עצביים. NSPCs להראות multipotency כאשר הם מצופים בסרום בינוני המכיל ללא גורם גדילה, הבחנה לתוך הנוירונים, האסטרוציטים, וoligodendrocytes. Multipotent, יכול להיות מבודד NSPCs עצמי חידוש ותרבותי מהמכרסמים המבוגרים חוט השדרה כאשר הרקמה התרבותית כוללת אזורים של התעלה המרכזית 6,7. יתרון פוטנציאלי בשימוש NSPCs שנוצר מחוט השדרה המבוגר בניגוד ליצירת תאים מאזורים אחרים הוא שתאי רקמות ספציפיות אלה דומים באופן הדוק ביותר תאים בחוט השדרה שאבדו או ניזוקו בעקבות פציעה או מחלה.
העבודה קודמת הראתה כי neurospheres נגזר מחוט השדרה האדם הבוגר לא יכול להיות מופץ לטווח ארוך או passaged לייצר כמות מספקת של תאי 8,9. עם זאת, עם שינויים בתנאי culturing, שדיווחנו בהרחבה והשתלה של NSPCs נגזר חוט השדרה המבוגר אנושי, הוכחה כי חידוש עצמיויכול להיות מבודד NSPCs multipotent מחוט השדרה האנושי הבוגר של תורמי איברים להשתלה 10. בעיקר, הסרת רוב החומר הלבן בנתיחה וculturing תאים אלה במצע חסיד במדיום מועשר גורם גדילה נבחרה למתרבה NSPCs חוט השדרה האנושי בוגר. בפרוטוקול זה אנו מתארים את הקצירה של חוט השדרה מחולדה בוגרת ומתורמים אדם השתלת איברים, דיסקציה של הרקמה סביב חדרי המוח, ובידוד, התרבות והרחבת NSPCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נהלי כל החיה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של רשת הבריאות באוניברסיטה, טורונטו ON קנדה, בהתאם למדיניות שנקבעה במדריך לטיפול והשימוש בבעלי חיים הניסויי שהוכנו על ידי המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים. לאסיף רקמת חוט השדרה אנושית, התקבל אישור מרשת בריאות אוניברסיטת מחקר האתיקה הדירקטוריון ומTrillium-מתנות של חיים קרן אשר מפקחת תרומת איברים באונטריו, קנדה.
1. הכנת Dissection חוצצים ותרבות מדיה
- לבידוד של חוט השדרה עכברוש, להכין 100 מיליליטר חיץ דיסקציה (1x PBS + 0.6% גלוקוז + 2% פניצילין, סטרפטומיצין) ושומר במקרר. לחוט השדרה אנושי להכין 100 מיליליטר חיץ דיסקציה (1x HBSS + 0.6% גלוקוז + 2% פניצילין, סטרפטומיצין) ושומר במקרר.
- הכן 100 מיליליטר סרום ללא בינוני (SFM) וחם על 37 מעלות צלזיוס. כדי להכין SFM, להוסיף L- גלוטמין 2 מ"מ, 100 מיקרוגרם / מ 'פניצילין, סטרפטומיצין l, B27 2%, ו -10% תערובת הורמון לNeurobasal-בינוני. להכין תערובת הורמון, לעשות 1: בינוני / F12 1 DMEM המכיל גלוקוז 0.6%, 3 מ"מ NaHCO 3, 5 מ"מ HEPES, 25 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר apo-transferrin, 10 מיקרומטר פוטרסין, 30 ננומטר סלניום, ופרוגסטרון 20 ננומטר.
- הכן את תקשורת ציפוי מועשר גורם גדילת EFH (לSFM להוסיף 20 ng / ml EGF, 2 מיקרוגרם / הפרין 20 ng / ml bFGF, והמ"ל) וחם על 37 מעלות צלזיוס. ודא שEFH האנושי מכיל גורמי גדילת רקומביננטי אדם (ראה טבלה של חומרים).
2. קציר וDissection של רקמת חוט השדרה למבוגרים עכברוש סביב חדרי מוח
- לעקר מכשירים לנתח באתנול ולשטוף בתמיסת מלח סטרילית, או מכשירי החיטוי מראש. תן חולדה - זריקה קטלנית של נתרן pentobarbital (1 סמ"ק ב 65 מ"ג / מיליליטר) או מנת יתר של חומר הרדמה (כלומר, isofluorane 4%) (6 8 שבועות) על פי המוסד של אחד אישר פרוטוקול בעלי חיים. Dהאוז האחורי של החולדה עם 70% אתנול ולהסיר את העור על פני השטח הגב עם מספריים לנתיחה גדולים.
- מחזיק מספריים בניצב למשטח הגבי, רוחבי לחתוך את עמוד השדרה מעל hindlimbs. השתמש במספריים קטנים יותר לחתוך את השרירים גב שמעל עמוד השדרה בכיוון מקורי לחשוף את תהליכי spinous longitudinally.
- החל בסוף הזנב החשוף, להכניס rongeurs או מכשיר עצם חיתוך בוטה קטן extradurally להיבט הרוחבי של תעלת השדרה במרחב שבין חוט השדרה ועמוד השדרה. לבצע חתכים קטנים לlamina (קשתות גרמיות ימין ועל שמאל של תהליכי spinous בכל צד של החוליות) ולקלף בזהירות lamina לחשוף את חוט השדרה (איור 1 א-ד). להבטיח את הזווית של הלהבים היא רדודה ובמקביל לכבל כך חוט השדרה הבסיסי אינו פגום.
- המשך laminectomy בכיוון מקורי לירידיםדואר חוט השדרה החזי וצוואר רחם.
- בעדינות בלו חוט השדרה מעמוד השדרה עם מלקחיים רקמות בוטים וmicroscissors השימוש לנתק בזהירות את השורשים כדי לשחרר את הכבל. מניחים את חוט השדרה נכרת בצלחת פטרי המכילה 4 ° C חיץ עכברוש סטרילי דיסקציה (שתואר לעיל ב1.1). יש לשטוף את הרקמה במאגר לנתח 4 ° C מוכנים טרי ומספריים באמצעות לחתוך את חוט השדרה רוחבית למגזרי 1 סנטימטר (איור 1E).
- לכל קטע של רקמה, השתמש ביד אחת להחזיק את הרקמה עם מלקחיים בסדר. ביד השנייה, להשתמש microscissors להסיר בזהירות את קרומי המוח שמעל, חומר לבן, ורוב החומר האפור בסיוע בהיקף לנתח. לחלופין, להשתמש במלקחיים עדינים (מס '4 דומון) לקלף ביותר של החומר האפור ולבן, שעזב את האזור סביב חדרי המוח רק של חוט השדרה הכולל ependyma וכמות קטנה של חומר אפור המקיף (איור 1F-H).
- בריכת הרקמות סביב חדרי המוח גזורים לתוך צלחת 10 סנטימטרים סטרילי פטרי המכילה מאגר נתיחת חולדה קר.
3. קציר וDissection של רקמת חוט השדרה למבוגרים סביב חדרי מוח אנושיים
הערה: רקמת חוט השדרה אדם שנקטפו מתורמי השתלת איברים בוגרים (תורמים בטווח גילי 2-60 שנים) לאחר האיברים האחרים הוסרו להשתלת איברים. Trillium-מתנות של תכנית החיים משיגה הסכמה להסרת רקמה למטרות מחקר ממשפחתו של החולה ומודיעה בזמן אופנת צוות הקצירה שלנו כך שהצלחנו לקצור את מיתרים בתוך 2 שעות של הידוק צולב אב העורקים. תורמי זכר ונקבה בוגרים עם סרולוגיה השלילית ולא זיהומים מתקבלים.
- רקמת הקציר באופן סטרילי בחדר הניתוח באמצעות גישה קדמית תוך שימוש באותה החשיפה קדמית כבר גזור להסרת איברים על ידי Transp האיברצוות קצירת Lant.
- לחשוף את עמוד השדרה הקדמי דרך הכחשה עם מפזרי צלע גדולים ומפשקי ההנעה גדולים של הרקמות ואיברים שנותרו כוללים כלי דם הגדולים.
- השתמש במסור sternal רכוב עם להב ארוך לחתוך את הדיסקים חולייתיים בקצוות מקורי ואת הזנב של האורך הרצוי של עמוד השדרה לכריתה. זווית ראה 45 על ° מדיאלית לחתוך שוקת משולשת מהחלק לרוחב של גופי חוליות לעצור רק קצר של תעלת השדרה.
- הסר מקשת ההיבטים המדיאלי של גופי חוליות של המגזרים הרצויים בעזרת osteotomes המעוקל ופטיש לטפל כדי למנוע חיתוך דרך הדורה. ואז בעדינות להרים את חוט השדרה הדורה מכוסה במלקחי שיניים וחדים לחתוך את הקצוות מקורי ואת הזנב של החוט. השתמש במספריים ומלקחיים ארוכים ותחצה בילטרלי שורשים הבודדים.
- מניחים את הקטע נכרת של חוט השדרה ב 4 °; חיץ סטרילי C (1x HBSS + 0.6% גלוקוז + 2% פניצילין, סטרפטומיצין) במבחנה גדולה לתחבורה לחדר תרבית הרקמה.
- הערה: באופן כללי, 3 - קטע 6 סנטימטר של חוט השדרה מבית החזה העליון ו / או באמצע לרמה נמוכה חזה מוסר בחדר הניתוח בתנאים סטריליים בהקדם האפשרי לאחר הפסקת המחזור והניח במאגר סטרילי הקר . הזמן שחלף בין הפסקת המחזור וההסרה של חוט השדרה משתנה עם הזמן הנדרש כדי לקצור את האיברים הממוקדים לתרומה ונע בין 45 דקות לשעות 2. אם הלב והריאות גם הוסרו, לנתיחה ניתן לקחת הרבה rostrally למסוק חלק של חוט צוואר הרחם הנמוך גם כן.
- לנתח את רקמת חוט השדרה האנושית בהקדם האפשרי לאחר קציר, בדרך כלל בתוך 3 שעות. הסר את הדורה וקרומי מוח אחר עם מלקחיים. יש לשטוף את רקמת חוט השדרה במאגר נתיחת 4 ° C טרי ולחתוך רוחבי למגזרי 1 סנטימטר.
- בסיוע בהיקף לנתח, בלו קרומי המוח שמעל, חומר לבן, ורוב החומר האפור באמצעות מלקחיים רקמות, מלקחיים עדינים וmicroscissors לכל מגזר רקמה. בריכת הרקמות סביב חדרי המוח גזור, הכוללת את ependyma וכמות קטנה של חומר אפור שמסביב, לתוך צלחת 10 סנטימטרים סטרילי פטרי המכילה מאגר נתיחת אדם קר.
4. בידוד וCulturing של עכברוש למבוגרים וNSPCs חוט השדרה האנושי
- בצע את השלבים הבאים בסביבה נקיה מחיידקי זרימה למינרית.
- לרכך את העכברוש גזור או רקמות סביב חדרי מוח אנושיים ל1 מ"מ 3 חתיכות עם microscissors.
- אנזימים לנתק את הרקמה הטחון עם אנזימי מפרקי חלבונים באמצעות ערכת ניתוק פפאין כפי שצוין בטבלה של חומרים / חומרים כימיים. הערה: רכיבים מגיב כוללים 4 בקבוקונים; 1 בקבוקון: מלח הפתרון מאוזן של ארל (EBSS), בקבוקון 2: containin פפאיןז L-ציסטאין וEDTA, 3 יאל: Deoxyribonuclease אני (DNase), 4 יאל: מעכבי פרוטאז Ovomucoid עם אלבומין בסרום שור (BSA).
הערה: פפאין הוא פרוטאז sulfhydryl שיש סגוליות רחבות למצעי חלבון. פפאין במסמך זה נגזר מהלטקס ממפעל פפאיה Carica והמדרדרת ביותר מצעי החלבון באופן נרחב יותר פרוטאזות לבלב. במהלך תהליך הניתוק יש כמה DNA גורם נזק לתאים להשתחרר לתוך מדיום הניתוק אשר יגדיל את הצמיגות ולעשות pipetting קשה. לפיכך, DNase כלול בהליך בידוד התא לעכל את ה- DNA מבלי לפגוע בתאים שלמים. Ovomucoids הם גליקופרוטאין מעכבי פרוטאז נהגו לעכב את פעילות פפאין אחרי צעד הניתוק.
- בשימוש הראשון, מחדש את תערובת מעכב ovomucoid אלבומין (4 בקבוקון) עם 32 מיליליטר של EBSS (1 בקבוקון), ולאחר מכן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש לבידודים שלאחר מכן.הערה: זה מניב פתרון בריכוז יעיל של 10 מ"ג של מעכב ovomucoid ו -10 מ"ג של אלבומין לכל מיליליטר.
- הוסף 5 מיליליטר של EBSS (1 בקבוקון) לבקבוקון פפאין (2 בקבוקון), מניב פתרון ב 20 יחידות של פפאין / מיליליטר בL-ציסטאין 1 מ"מ עם 0.5 mM EDTA. בדוק כי פתרון פפאין מופיע ברורה מתי נמס לגמרי, אעמיד את הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך עשר דקות, עד שהוא נמס לגמרי פפאין, כדי להבטיח פעילות מלאה של האנזים.
- הוסף 500 μl של EBSS (1 בקבוקון) לבקבוקון DNase (בקבוקון 3) ומערבבים בעדינות כDNase רגיש לגזירת denaturation. הוסף 250 μl של פתרון DNase לבקבוקון המכיל פפאין, וכתוצאה מכך ריכוז סופי של כ 20 יחידות / מיליליטר פפאין ו0.005 DNase%. שמור את האיזון של בקבוקון DNase לשימוש מאוחר יותר.
- מניחים את החולדה הטחון או הרקמה אנושית בפתרון פפאין כפי שהוכן בשלב 4.4 לעיל. לבידוד הרקמה האנושי, לפצל את הרקמות טחונות שווים בשווה בין שתיבקבוקוני פפאין (כ 0.2 גר '/ בקבוקון).
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה מתמדת על פלטפורמת נדנדה ללנתק את הרקמה בפתרון פפאין מופעל. דגירה רקמות חולדה במשך 45 דקות לשעה 1, ורקמות אנושיות ל1-2 שעות בהתאם לכמות של רקמות טחונות, על 0.2-0.4 גרם בהתאמה.
- Triturate את התערובת עם פיפטה 10 מיליליטר לניתק כל פיסות רקמה שנותרו להניב השעיה תא מעונן. מעבירים את ההשעיה התא (לא כולל פיסות רקמת undissociated) לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר חרוטי ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות על RT.
- Resuspend תאי pelleted בovomucoid בינוני מכיל, מעכב פפאין.
- הכן את פתרון ovomucoid על ידי ערבוב של 2.7 מיליליטר EBSS (בקבוקון 1) עם 300 μl של הפתרון המעכב אלבומין-ovomucoid מחדש (4 בקבוקון) בצינור חרוטי 15 מיליליטר. להוסיף 150 μl של פתרון DNase (בקבוקון 3) הציל בשלב 4.4 לעיל.
- בטל supernatant מתאים ומייד pelleted resuspend התא גלולה בתערובת אלבומין-מעכב DNase המדולל.
- תאים נפרדים בשלמות מקרום תא על ידי צנטריפוגה דרך שיפוע צפיפות רציפה צעד אחד.
- הכן את שיפוע הצפיפות רציף על ידי הוספת 5 מיליליטר של תמיסת אלבומין-מעכב (בקבוקון 4) לצינור 15 מיליליטר, ובעזרת פיפטה 5 מיליליטר, בעדינות ובשכבת ההשעיה התא לאט (שהוכן כפי שתואר לעיל בשלב 4.8) על גבי פתרון אלבומין-המעכב.
- צנטריפוגה ב 70 XG במשך 6 דקות ב RT.
- הערה: הממשק בין שתי השכבות של הצבע צריך להיות לעין, למרות ערבוב מינימאלי בגבול זה אינו משפיע על התוצאה. שברי קרום להישאר בממשק ותאים ניתקו גלולה בחלק התחתון של הצינור.
- לתאי עכברוש, לבטל את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של מדיום EFH חולדה (חיממו מראש על 37 מעלות צלזיוס).רוזן צפיפות תא חי עם haemocytometer וצלחת התאים לתוך בקבוק תרבות T25 בצפיפות של 10 תאים / μl בEFH. התשואה האופיינית לתאים מרקמות עכברוש היא כ 2 x 10 6 תאים עם תרבויות כ -80% viability.If משובטים הם רצויים, תאי זרע בצפיפות של פחות מ -10 תאים / μl. דגירה צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 ולאפשר התרבויות לגדול ללא הפרעה במשך שבוע 1 להימנע מצבירה של תחומים.
- לתאים אנושיים, לבטל את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 מיליליטר של מדיום EFH האנושי (חיממו מראש על 37 מעלות צלזיוס). סנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא ניילון 40 מיקרומטר אחריו עם 30 מיליליטר של EFH להסיר שברי המיאלין וקרום תא. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות וresuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של מדיום EFH.
- רוזן צפיפות תא חי עם haemocytometer וצלחת התאים האנושיים לתרבות צלחות 6-גם בצפיפות של 10 5 תאים / גם בנפח כולל5 מיליליטר EFH / טוב. התשואה האופיינית לתאים מרקמות אנושיות היא על 1 x 10 6 תאים עם כדאיות כ -70%. בארות טרום מעיל עם מצע חסיד כגון Matrigel (ראה הערה בהמשך). לדלל ביחס של 40 μl Matrigel: 1 מיליליטר SFM.
- הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במצעים חסיד אחרים, כגון פולי-D ליזין / laminin, פיברונקטין, או קולגן.
- דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 ולאפשר התרבויות לגדול ללא הפרעה במשך שבוע 1.
5. Passaging של עכברוש למבוגרים וNSPCs חוט השדרה האנושי
- NSPCs העכברוש יהווה neurospheres הקטן כ -70 מיקרומטר קוטר בתוך השבוע של זריעה ראשונית 1; NSPCs עכברוש מעבר שבועי על ידי איסוף ההשעיה התא, צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, ומכאני triturating התא גלולה לנתק neurospheres.
- זרעי התאים ניתקו לתוך צלוחיות T25 מכילות בינוני EFH עכברוש טרי. לחלופין,להשתמש 50% בינוני חולדה מותנית לpassaging. התשואה האופיינית לNSPCs העכברוש בpassaging היא כ -5 x 10 6 תאים אשר מגדיל באופן אקספוננציאלי עם מספר מעבר.
- לתרבויות האנושיות, שבוע לאחר הציפוי הראשוני, להחליף מחצית בינונית עם תרבות EFH הטרי פעמיים בשבוע כדי לאפשר לתאים לדבוק במצע. בדרך כלל, 1-2 שבועות מאוחר יותר ברגע שהתאים מחוברים למצע, להחליף את כל הנפח של מדיום תרבות פעמיים בשבוע עם EFH הטרי.
- תאים תת-תרבות לפני שהגיע מפגש בין 4-8 שבועות.
- תאים תת-ידי ניתוק תאים מהמצע אנזימים (ראו טבלה של חומרים) עם 2 מיליליטר של אנזים למודגרות גם לכ 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס. לאסוף השעיה תא, צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות, ובעדינות resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של מדיום EFH טרי.
- ספירת תאים חיים עם haemocytometer וצלחת התאים לתרבות צלחות 6-היטב (טרום שיתוףated כאמור בשלב 4.12) בצפיפות של 10 5 תאים / גם בנפח כולל של 5 מיליליטר EFH / טובה. התשואה האופיינית לNSPCs האנושי בpassaging היא כ 2 x 10 6 תאים ובאופן כללי זה יוכפל במעבר. בדרך כלל, לשמור על תרבויות עם 50% בינוניים EFH מותנה 2 - 3 פעמים בשבוע בין passaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאי חוט השדרה עכברוש מבוגר גדלו בתרבות השעיה במדיום EFH יהוו neurospheres הקטן (מושבות של תאים שלא עברו התמיינות) בתוך השבוע של ציפוי ראשוני 1. בתרבויות עיקריות, רוב התאים מצופים ימותו ותאי גזע גורם מגיב צמיחה יתרבו ונבחרו במדיום EFH. על ידי מעבר 3, יהיה ריחוף ללא neurospheres רב כ -100 מיקרומטר הקוטר (איור 2 א). Neurospheres עגול ושלב-בהיר, ובהגדלה גבוהה, microspikes כמו cilia-נראה בולט מהתאים בצד החיצוני של תחומים האופייניים לneurospheres ניגוד הגושים של פסולת תא (איור 2). התשואה האופיינית לתאים מרקמות עכברוש היא כ 2 x 10 6 תאים עם כדאיות כ -80%. לא צריך להיות נזרע neurospheres בצפיפות גבוהה מדי, כדי למנוע הצטברות של צבירי תאים. כמו כן, neurospheres הגדול להיות קשה לנתק ותאים יהפכונמקים במרכז הכדור. זה יתרחש גם אם תרבויות נשארות יותר מדי זמן לפני passaging. בתרבות EFH, NSPCs חוט השדרה עכברוש בוגר להתרבות (איור 2 ג) ולהביע nestin (איור 2 ד) סמן לתאים מבשר, ורמות נמוכות של סמנים עצביים בוגרים (מידע לא מוצגים).
תרבויות NSPC חוט השדרה אדם בוגר לא גדלות במהירות כמו תרבויות NSPC החולדה. אם תאי חוט השדרה אנושיים לראשונה בתרבית השעיה, הם יהוו אגרגטים ואשכולות סדירים של מספר הקטן של תאים בשילוב עם הפסולת (איור 3 א). passaging הבא של תרבויות אלה אינו מקדם העשרה של אוכלוסיית NSPC. עם זאת, כאשר התאים האנושיים הם מצופים בEFH על monolayer חסיד, NSPCs הגורם מגיב הצמיחה לדבוק במצע (איור 3) והחלפת תקשורת שלאחר מכן מסיר המיאלין ופסולת תא (איור 3 ג). התשואה האופיינית לגאמות מהרקמה אנושית היא על 1 x 10 6 תאים עם כדאיות כ -70%. כאשר תרבויות NSPC האנושיות להתבסס גם monolayer חסיד, אז יכול גם להיות מצופה NSPCs בתרבויות השעיה כדי ליצור neurospheres צף חינם. בתרבות EFH, NSPCs חוט השדרה אדם הבוגר להתרבות (איור 3D) ולהביע nestin (איור 3E) וSox2 (איור 3F), גורם שעתוק מוצג להתבטא בתאי גזע עצביים, ורמות נמוכות מאוד של סמנים עצביים בוגרים (נתונים לא מוצג).
איור 1. Laminectomy של חוט השדרה עכברוש ונתיחה של אזור סביב חדרי המוח. (א) בסוף הזנב החשוף של חוט השדרה, rongeurs מוכנס extradurally להיבט הרוחבי של תעלת השדרה. חתכים קטנים (ב) נעשים לlamina על כל si דה של החוליות וlamina הוא קילף בזהירות כדי לחשוף את חוט השדרה. חוט השדרה הצווארי נחשף לאחר laminectomy (C). (ד) סכמטי של חתך בחוליות בית החזה מראה כבל ומיקום של חתכים שנעשו עבור laminectomy השדרה (מתואר עם קווים מקווקווים אדומים). הרבדים ותהליך spinous (אזור מוצל) יוסרו. (E) בחוט השדרה הוא לחתוך רוחבי למגזרי 1 סנטימטר. (F) קרומי המוח שמעל, חומר לבן, ורוב החומר האפור הוא הסיר בזהירות באמצעות microscissors. (G ) רקמה טחון סביב חדרי מוח. (H) רוחבי סעיף של חוט השדרה עכברוש מוכתם בluxol hemotoxylin המהיר כחול וeosin עם קווי המתאר מנוקדים מראים אזור סביב חדרי מוח גזור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
לשמור-together.within עמודים = "תמיד">: 
NSPCs איור עכברוש למבוגרים 2. חוט השדרה. (א) על ידי מעבר 3, neurospheres רב נראה כשNSPCs חוט השדרה עכברוש גדלים בתרבות השעיה-צף חופשית. (ב) neurospheres הוא שלב-בהיר וmicrospikes הבולט מneurospheres (חיצים ) ניכרים בהגדלה גבוהה. (ג) ניתק neurospheres (קטע 3, יום 4) הם מצופים בבארות Matrigel מצופה במדיום EFH, קבוע, וimmunostained וcounterstained עם Hoechst לדמיין גרעינים (כחול). בתנאי EFH, NSPCs חוט השדרה העכברוש בוגר להתרבות (כפי שמוצג בimmunostaining Ki67), ובעיקר nestin המפורש (ד '). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
FO: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> 
NSPCs איור 3. מבוגרים אנושי בחוט השדרה. (א) כאשר בתחילה מצופה בצלוחיות תרבות, NSPCs חוט השדרה מבוגרת אנושי לא גדל היטב. תרבויות עיקריות צפה בחינם במדיום EFH (13 ימים לאחר ציפוי) אגרגטים מופע של תאים ופסולת. (ב) לעומת זאת, בתרבויות חסיד עיקריות בEFH, NSPCs צירפו למצע Matrigel (חיצים), מוצגים בגיל 17 ימים לאחר ציפוי, ו- (ג) בשעה 41 ימים במבחנה. (ד) במדיום EFH, NSPCs חוט השדרה מבוגרת האנושי להתרבות, כפי שמוצג בimmunostaining Ki67 (26 ימים במבחנה הראו), ובעיקר nestin מפורש (E) (26 ימים ב מבחנה הראה) ו- (F) Sox2 (66 ימים במבחנה מוצגים). הגרעינים counterstained עם Hoechst (כחול)."Target =" _ /ftp_upload/52732/52732fig3large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במהלך הנתיחה של טיפול רקמות חוט השדרה העכברוש יש לנקוט לא לפגוע בחוט השדרה בעת ביצוע laminectomy. קל יותר לבודד את הרקמות סביב חדרי המוח כאשר מגזרי חוט השדרה הם בשלמותה. מגזרי הרקמה צריכים להיות שקועים לחלוטין במאגר לנתיחה וניתן לחתוך את קרומי המוח שמעל וחומר לבן כרצועות אורך עם microscissors. לחלופין, ניתן להשתמש במלקחי רקמה עדינים לקלף חומר הלבן משם.
להליך הבידוד לNSPCs, השתמשנו בשיטת ניתוק פפאין-EDTA בשילוב עם טחינה דקה מכאנית לנתק את העכברוש ורקמת חוט השדרה אנושית. בהשוואה לפרוטאזות אחרות, פפאין הוא פחות מזיק אך יעיל, כפי שמוצג בעבר עם ניתוק של תאי עצב בקליפת המוח חולדה לאחר הלידה 11. מצאנו ניתוק שעם טחינה דקה מכאנית בלבד, המשמש לעתים קרובות עם רקמה עוברית, אינו יעיל כמו ברקמה מהבוגרת. לאחר הדיסוציאציה האנזימטית הדואר, טחינה דקה מכאנית חשובה כדי לשבור את שברי רקמות שנותרו. טחינה דקה עם פיזור תא חוזר על עצמו עם טפטפת צריכה להתבצע ולכן אין שברי רקמה שלמים שנותרו וכתוצאה מהשעית תא מעונן. עם זאת, טחינה דקה לא צריכה להיות מבוצעת חזקה מדי, כדי למנוע מבעבע של ההשעיה התא והמוות של תאים כתוצאה.
לpassaging, neurospheres העכברוש הם ניתקו לתוך השעיה תא בודדת באמצעות טחינה דקה מכאנית, כפי שתואר במקור 2. עם זאת, יכול גם להיות מנותק neurospheres בשיטות האנזימטית כגון טריפסין-EDTA שלא לפגוע בקולטנים בתא שטח או להפריע להיווצרות כדור כל עוד חשיפה האנזימטית היא קצרה 12.
ישנם מספר יתרונות בבאמצעות assay neurosphere לתרבות NSPCs. זה הוא יחסית פשוט, לשחזור, ומאפשר להתרחבות המהירה של טלפונים סלולר גזע עצבייםLS 2,12. עם זאת, neurospheres הם הטרוגניים מורכב בעיקר מתאי אב, כי הם יותר מוגבלים ורק מספר קטן של תאי גזע. מספר גורמים כגון צפיפות תאים וטכניקת passaging עשויים להשפיע על הפנוטיפ של התרבויות, וneurospheres עלול להיוצר מתאי אב 13. Neurospheres הוא ניעתי מאוד ועשוי למזג גם בתנאים של צפיפות תאים נמוכה 14. לפיכך, מספר neurospheres בתרבות אינו מייצג את מספר תאי גזע. להפלות בתאי גזע עצביים מתאי אב, יש להשתמש העצבית-המושבה להרכיב תא assay 15,16.
NSPCs חוט השדרה עכברוש מבוגר לגדול גם neurospheres בתרבות השעיה בEFH תוספת בינוני והם בקלות להרחבה. לעומת זאת, מצאנו כי NSPCs חוט השדרה האנושי הבוגר לגדול יותר טוב כמו monolayer חסיד 10. יכולים להתקיים בתאי גזע אנושיים המופק ממוח עצביים ארוך טווח בפולחן monolayerיור במדיום הגדרה כימית בנוכחות mitogens אשר לקדם יכולת השגשוג שלהם 17,18. כפי שתואר בפרוטוקול זה, יכול להיות מבודד NSPCs מחוט השדרה האדם הבוגר מתורמים להשתלת איברים וpassaged והרחיב כmonolayer חסיד בנוכחות EGF, bFGF, והפרין 10. זה קל יותר לבודד NSPCs מצעיר מתורמים מבוגרים כמו התאים להרחיב מהר יותר, אם כי עדיין יכול להיות מבודד NSPCs מתורמים עד הגיל המרבי שלנו של 60 שנים 10. בחנו מגוון רחב של מצעים חסיד כגון Matrigel, פיברונקטין, קולגן סוג אני, ופולי-D ליזין / laminin, ומצאתי אלה להיות יעילים לדבקות של חוט השדרה אדם בוגר NSPCs 10. בתחילה שני neurosphere ותרבויות חסיד מכילים אגרגטים סלולריים, פסולת, ותאים מתים. עם זאת פסולת זו הוסרה בהדרגה עם subculturing והצמיחה בינוני neurobasal מועשרת גורם בוחרת עבור NSPCs מתרבים. גם פסולת וזיהום המיאלין יכולים להיות מופחת עם נתיחה וההסרה של חומר לבן ממגזרי רקמת חוט השדרה זהירות. סינון ההשעיה תא התוצאה דרך מסננת לפני הציפוי גם מסירה המיאלין.
יש לנו NSPCs תרבותי מבוגר אנושי בחוט השדרה כמו monolayers חסיד לפחות 9 חודשים מעורבים כ -10 קטעים, אם כי בתרבויות מבוגרות יש עלייה בסיכון למומי karyotypic. ביצענו ניתוח קריוטיפ בNSPCs האנושי בתרבית למשך 4 חודשים ומצאנו קריוטיפ דיפלואידי נורמלי ללא הפרעות כרומוזומליות (מידע לא מוצג). מצאנו גם כי התפשטות תאים והיכולת להתמיין oligodendrocytes ירדו עם זמן הולך וגדל בתרבות. לדוגמא, אחוז היחסי של תאים חיוביים O4 ירד מ -1.3% בחודש 1 בתרבות ל0.01% ב 4 חודשים בתרבות 10. עכברוש וNSPCs אדם שניהם ניתנים להקפאה באמצעות הקפאה סטנדרטית נפגשהארגזים ולהראות הבדלים משמעותיים בפרופיל פנוטיפי.
הבידוד והרחבת NSPCs multipotent בתרבות מאפשר לכמה יישומים במבחנה כולל הבדיקה של גורמים שונים על התמיינות תאי גזע עצבית מבוגרת. מספרים מוגברים של NSPCs יכולים להיות שנוצרו במבחנה והושתלו מודלים של בעלי חיים כגון פגיעה בחוט השדרה, שבץ ומחלות ניווניות של מערכת עצבים לבחון את תגובת המתקן של תאי גזע העצביים אלה in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1x HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10,000 U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10 mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100x) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
- Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
- Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
- Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
- Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
- Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079 (2011).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
- Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1. i112-i120 (2006).
