Nous présentons un protocole pour évaluer le taux de clairance du liquide alvéolaire ou d’œdème pulmonaire dans le poumon de souris néonatale à l’aide de la technologie d’imagerie par rayons X.
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Article de méthode
En temps réel d'imagerie à rayons X du poumon Volumes fluide dans néonatale Souris Lung
Dans cet article
Résumé
Résumé
A la naissance, le poumon profond est soumis à un commutateur phénotypiques de la sécrétion d'absorption, ce qui permet une adaptation à la respiration de manière indépendante. Promouvoir et soutenir ce phénotype est très important dans la croissance et les échanges gazeux alvéolaires normale tout au long de la vie. Plusieurs études in vitro ont caractérisé le rôle des protéines clés réglementaires, des molécules de signalisation, et les hormones stéroïdes qui peuvent influer sur le taux de clairance de liquide pulmonaire. Cependant, dans les examens in vivo doit être effectuée pour évaluer si ces facteurs réglementaires jouent un rôle physiologique important dans la régulation de l' absorption périnatale liquide pulmonaire. En tant que telle, l'utilisation du temps réel d'imagerie à rayons X pour déterminer la clairance périnatale du liquide pulmonaire ou de l'oedème pulmonaire, représente un progrès technologique dans le domaine. Ici, nous expliquons et illustrons une approche pour évaluer le taux de clairance de liquide pulmonaire alvéolaire et l'inondation alvéolaire C57BL / 6 au post natal jour nous 10ing imagerie et l'analyse aux rayons X. La mise en œuvre réussie de ce protocole requiert l' approbation préalable de soins des animaux et de l' utilisation des comités institutionnels (IACUC), un système d'imagerie à rayons X in vivo petit animal, et des logiciels compatibles d'imagerie moléculaire.
Introduction
À la naissance, le poumon nouveau-né doit passer d'un sécrétant fluide à un organe réabsorber le fluide pour établir la ventilation et l'oxygénation du corps adéquat. Les mécanismes qui facilitent (ou entrave) la clairance efficace du liquide pulmonaire au moment de la naissance restent floues. Modélisation de la vitesse de clairance du liquide alvéolaire C57BL / 6 souriceaux nouveau-né va conduire à une meilleure compréhension des facteurs réglementaires qui peuvent améliorer ou atténuer le taux d'absorption de fluide. Il pourrait également être appliqué à d'autres modèles néonatales de lésion pulmonaire aiguë ou d'une infection, et pourrait conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les nouveau-nés présentant une détresse respiratoire.
Puisque les poumons du nouveau-né sont minuscules par rapport aux poumons adultes, des mesures conventionnelles de la clairance liquide alvéolaire qui reposent sur lavage ou gravimétriques mesures peuvent ne pas être approprié pour étudier avec précision la clairance de liquide pulmonaire dans les modèles pulmonaires néonatales. Dans ce protocole, nous démontrons un test qui permet dela détermination précise des taux de clairance liquide alvéolaire chez les chiots postnatales jour 10 C57BL / 6 de souris en utilisant un petit imageur animal. Un avantage majeur d'utiliser une approche fluoroscopique est que les animaux sont imagées in vivo. Ils sont librement respirent et peuvent se remettre de cet essai mini-invasive pour l'observation et l'étude future. L'objectif global de cette méthode est de modéliser un œdème pulmonaire dans les poumons du nouveau-né, et d'évaluer le taux de clairance liquide alvéolaire dans les poumons du nouveau-né. Cette technique a été développée, en partie, comme une stratégie de réduction de diminuer le nombre d'animaux nécessaires, mais maximiser la production expérimentale. Cette technique permet également une détection supérieure des volumes de fluides pulmonaires en utilisant l' imagerie par rayons X et exige la maîtrise du dispositif de retenue pour animaux de base et manipulation 1; petites chirurgies et trachéale animales instillation 2, un petit imageur animal, et le logiciel de base d'analyse d'image. Les chercheurs qui souhaitent évaluer les volumes de liquide pulmonaire in vivo (librement Breathing anesthésié modèles animaux) peuvent trouver cette procédure adaptée à leur application. Enfin, ce protocole pourrait augmenter d' autres modèles existants de lésion pulmonaire néonatale utilisée dans l'étude mécaniste de la dysplasie bronchopulmonaire, y compris les blessures induites par hyperoxie-poumon, ventilation mécanique, et des modèles d'inflammation pulmonaire 3.
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Protocole
Toutes les techniques expérimentales doivent être menées conformément aux lignes directrices de soins institutionnels et l'utilisation du Comité.
1. X-ray Imaging Acquisition
- Présentation du logiciel (voir la figure 1 pour une vue d' ensemble des Paramètres du logiciel).
- Sélectionnez le bouton de capture directement sous l'onglet Fichier.
- Dans le menu déroulant Paramètres, sélectionnez la session en cours.
- Sélectionnez Exposition standard dans la liste déroulante située sous Temps d' exposition.
- Réglez le temps d'exposition à 2,00 min, et n ° L' exposition à 1. Réglez le X Binning et Y Binning à 2 pixels. Voir Figure 1.
- Sélectionnez Accumulation final dans le menu déroulant des options d' exportation.
- Dans les paramètres d'éclairage, select X-Ray dans le menu déroulant Illumination Source. La valeur par défaut KVP est fixé à 35.
- Sélectionnez Autoselect dans le menu Fichier Postuler Référence déroulante pour appliquer le fichier de référence de rayons X correspondant. (Voir la section 2).
- Dans l'appareil photo Set Pour les réglages, réglez le f-stop à 2,51.
- Réglez le FOV (Field of View) à 125.64 pour les souris PN10.
- Réglez le plan focal à 13, et dans le menu déroulant à côté du plan focal curseur, sélectionnez X-Ray.
- Pour les rayons X, réglez le filtre d'excitation et le filtre d'émission à 0 dans le menu déroulant.
- Enregistrer session en cours en cliquant sur Nouveau dans le haut à côté de Paramètres. Entrez le nom pour le Nouveau Acquérir fichier de paramètres, par exemple, "Jove exposition unique événement pour faire un protocole." Voir la figure 2.
- Création d' un protocole d'imagerie à rayons X
- Cliquez sur le bouton / Créer Modifier les protocoles sur le côté droit de la fenêtre ouverte.
- Comme la fenêtre pop-up nouveau protocole apparaît, cliquez sur le bouton Nouveau dans le coin supérieur droit
- Entrez le nom que le protocole enregistrer sous, par exemple "Jove Protocole Demo", puis cliquez sur OK. (Voir figure 3).
- Sur le fond de la fenêtre pop-up Protocole Protocole étapes, veiller à ce que l' étape 1 est mise en évidence en rouge, saisir de nouvelles images est sélectionné, et ne rien faire est sélectionné dans l'Avant Capture d'image du menu déroulant.
- Capture Setting, sélectionnez l'événement d'exposition unique généré récemment à l' étape 1.1.12.
- Sélectionnez Wait (s) dans le menu Après la capture d' image déroulante.
- Cliquez sur le bouton Modifier, type 180 dans la boîte de pop-up, puis cliquez sur OK pour ajouter un temps d'attente de 3 minutes après chaque acquisition de 2 min.
- Dupliquer Étape 1 en cliquant droit sur l'onglet Étape 1 et en sélectionnant l' étape Duplicate. Créer 23 doublons pour une période d'observation de 2 heures. (Voir la figure 4).
- Sur la dernière étape (étape 24), changer l'image après la mise sur Ne rien faire de Wait (s) Capture.
- Cliquez sur le bouton Enregistrer et quittez l'éditeur de protocole.
2. Illumination fichiers de référence
Remarque: Appliquer des fichiers de référence d'éclairage à rayons X à une image de rayons X afin de corriger automatiquement les variations de détecteur uniformité des images à rayons X obtenus tout au long de l'expérience. Les procédures décrites ci - dessous sont spécifiques à la Bruker in vivo des systèmes d' imagerie animale; d' autres systèmes d'imagerie in vivo peut ,être utilisé.
- Générer un fichier de référence d'éclairage en ouvrant le logiciel d'imagerie moléculaire et en cliquant sur le bouton Capture.
- En utilisant le menu pop-up, établir les paramètres de capture de rayons X dans Illumination Source (voir réglages suggérés dans la section 1 ci - dessus), puis sélectionnez Illumination référence dans le type d'exposition. Cela peut être trouvé en vertu des positions standard dans la case déroulante. (Voir Figure 5).
- Retirer tous les échantillons de la station d'image. Réglez le binning X et Y à 4 x 4 binning. Se reporter au Tableau 1: temps d'exposition de fichier de référence d'éclairage pour déterminer le temps d'exposition précise.
- Appuyez sur Expose.
- Appliquer le fichier de référence en sélectionnant Auto Sélectionnez dans le menu déroulant Appliquer sous Fichier de référence. (Voir Figure 6). Le fichier de référence d'éclairage va maintenant être appliquée automatiquement à tous les im X-rayâges capturés avec les mêmes réglages de l'appareil. Les étapes de 2,1 à 2,4 ne seront pas besoin d'être répété si mêmes réglages de l'appareil sont utilisés dans des expériences ultérieures.
Remarque: Un fichier de référence d'éclairage peut être appliqué après l'acquisition d'images, ou si un message d'erreur se produit après la sélection automatique des fichiers de référence. Appliquer illumination référence fichiers post-capture d' image en utilisant la série de commandes dans le panneau de navigation du logiciel d'imagerie moléculaire: Image> Image en Math> Type: Tâche> Calculer: correction d'éclairage. Sélectionnez l'image d'entrée (X) que vous souhaitez appliquer le fichier de référence d'éclairage (Y). Renommez le fichier corrigé (Z). (Voir Figure 7).
Manipulation 3. Animal
- L' acquisition d' animaux
- Achetez barrages enceintes des éleveurs commerciaux ou reproduire des souris femelles dans la maison à 12 semaines d'âge (ou plus) conformément à la directive institutionnelles.
- Maison souris nouveau-né avec les mères allaitantes jusqu'au jour postnatal (PN) 10.
- Anesthésie animale (PN 10)
- Préparer un cocktail kétamine / xylazine pour anesthésier PN 10 souris pour effets anesthésiques prolongés pouvant durer jusqu'à 40 minutes. Ajouter 500 ul de kétamine (100 mg / ml) à 75 ul de xylazine (100 mg / ml). Diluer au 1/10 dans une solution saline à 0,9% pour faire un kétamine (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) cocktail anesthésiant.
- Peser les souris nouveau-nés.
- En utilisant une seringue avec une aiguille 3/10 31 G 5/16 de pouce (8 mm), d'administrer 10 ul / g de poids corporel de l'anesthésie par une injection intra-péritonéale.
- Garder les animaux secs et isolés pour éviter la perte excessive de chaleur corporelle.
4. trachéale instillations
- Préparer une solution saline intratrachéale composé de 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de CaCl2 et 10 mM de HEPES; pH = 7,4. L'osmolalité de cette solution devrait être319 mosmol / kg H 2 O.
- Mont anesthésié les animaux face ventrale sur une planche inclinée chirurgicale en utilisant du ruban chirurgical. Ensurethat têtes »les animaux sont au sommet de la pente.
- Effectuer une pincée d'orteil pour assurer que les animaux sont anesthésiés et prêt pour la chirurgie. Désinfecter tous les domaines, les instruments et la région thoracique chirurgicale de l'animal.
- Faire un petit (3 mm) incision dans la face ventrale antéro-médial du cou (région de la gorge) à l'aide d'un scalpel, la taille 11. Poussez de côté le platysma et antérieur muscles trachéaux utilisant des pinces émoussées afin de visualiser et d'accéder à la trachée.
- Instiller 3 ul / g de poids (environ 10 - 30 pi de volume final) de sérum physiologique par l'intermédiaire de la trachée exposée en utilisant une aiguille 31 G 5/16 de pouce (8 mm). L'incision mineure est laissée ouverte pendant l'imagerie animale et se guérit généralement bien. Consultez Division locale de ressources animales afin de déterminer si l'incision peut également être laissée ouverte. Dans le cas contraire, les sutures peuventêtre requis.
5. Imagerie animale
- Placez les chiots ventral sur un fond transparent, amovible, plateau d'imagerie animale. Centrer les animaux de sorte que le faisceau de rayons X sera placé directement sur la région thoracique.
- Pour les cohortes d'animaux impaires, placez le premier chiot directement au milieu du plateau, et les cohortes paires placent le premier chiot juste à gauche du centre de sorte que lorsque les autres animaux sont placés sur le plateau tous les animaux sont centrés.
- Remettre le plateau d'imagerie pour l'imagerie armoire à rayons X et de fermer la porte de l'armoire.
- Mettre en marche l'appareil de régulation thermique animal pour maintenir la température corporelle des animaux anesthésiés. Utilisez le réglage haute pour atteindre une température de chambre d'environ 35-37 ° C. Allumez l'unité d'anesthésie animale (isoflurane vaporisé délivré par l'oxygène) pour assurer que les animaux sont anesthésiés et immobilisés pendant toute la durée de 2 h procédure d'imagerie.
- Exécution rayons X protocole d'imagerie
- Cliquez sur la capture et sélectionnez le protocole approprié, par exemple, "Jove Protocole Demo," dans le menu déroulant Protocole. (Voir figure 8).
- Cliquez sur le bouton Exécuter protocole sélectionné sur le logiciel d'imagerie moléculaire.
Remarque: Une fenêtre pop-up apparaîtra pour suivre l'état de l'acquisition d'image, lorsque le protocole est terminé, la fenêtre disparaît. La dose de rayons X est faible, <à 0,3 mRem ou environ 10 fois moins d'une radiographie dentaire. Comme avec d'autres procédures X-Ray, il n'y a pas de rayonnement résiduel. - Lorsque la session d'acquisition de 2 heures est terminée, retirez les animaux du plateau d'imagerie et de les retourner dans leur cage. Surveiller les animaux pour la récupération complète avant de retourner à crémaillères.
Analyse 6. Données
Remarque: le logiciel d'imagerie moléculaire permet la quantification et la traduction de Xray intensité de pixel dans le taux de clairance de liquide pulmonaire. Les étapes ci-dessous décrivent les procédures nécessaires pour normaliser les images à rayons X et de quantifier l'intensité dans les régions définies d'intérêt (ROI).
- Concevoir un modèle de ROI
Remarque: Une région de modèle d'intérêt doit être créé spécifique aux images à rayons X capturés au cours de l'étude de 2 h, et doit être utilisé pour comparer les intensités de rayons X entre les groupes expérimentaux. Depuis de petits volumes de défis salins accumulent généralement dans le lobe supérieur gauche du poumon 4-6, le retour sur investissement (s) devrait se concentrer sur cette partie du poumon.- Ouvrez la première et la dernière image de rayons X dans l'ensemble 2 h. Sélectionnez la fenêtre de la première image x-ray.
- Dans la barre d' outils de navigation, sélectionnez Manuel-ROIs> Nouveau ROI Set.
- Cliquez ROI Ellipse et créer un retour sur investissement qui couvre de manière adéquate à gauche lung.An ROI de la souris ne soit pas défini jusqu'à ce que le rouge, a souligné le retour sur investissement est dragged à une position différente. Un retour sur investissement défini sera présenté en bleu avec un numéro.
- Si plusieurs chiots sont imagés, cliquez sur le rouge, ROI décrit et faites glisser vers les poumons gauche des autres souris pour créer plus ROIs individu dans le même ensemble. Faites glisser le rouge, ROI décrit dans une zone avec un fond clair pour créer un retour sur investissement de fond.
- Sélectionnez Pointer Sélection pour positionner les ROIs pour se trouver sur le poumon gauche de chaque souris, directement sous la deuxième côte.
- Dans la barre d' outils, cliquez sur Affichage de l' image.
- Vérifiez Overlay dans la boîte de dialogue d'affichage des images pour superposer la dernière image de rayons X tout en maintenant les emplacements ensemble de retour sur investissement. Si nécessaire, sélectionnez Pointer Sélection dans la barre d' outils de navigation pour ajuster les positions des ROIs et d' assurer une couverture adéquate du poumon dans les deux images.
- Dans la boîte de dialogue de ROI manuel, sélectionnez Modèle> Enregistrer modèle. Nom til modèle et cliquez sur OK.
- Fermez les deux images. Sélectionnez Non lorsque vous êtes invité à enregistrer les modifications.
- Appliquer le modèle de ROI à chaque image de rayons X pour analyser capturé jeu fluide en ouvrant toutes les images prises au cours de l'étude. Commencez par sélectionner un fichier ouvert et cliquez sur ROIs Manuel> Modèle.
- Sélectionnez le modèle de ROI précédemment créé à partir du menu déroulant et cliquez sur Appliquer pour tous les documents ouverts.
- Export numérique ROI données des images sur une feuille de calcul
- Dans le coin supérieur gauche, cliquez sur Fichier> Exporter des données> ROI.
- Vérifiez Comme affiché et Auto Ouvrir dans Excel dans la boîte de dialogue pop-up.
- Sélectionnez Exporter tous les documents ouverts.
- Nommez le fichier et cliquez sur Enregistrer.
- Fermer le logiciel d'imagerie moléculaire.
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Résultats
Les panneaux de gauche dans les figures 9 - 10 sont des PN 10 poumons de souris imagées au départ (pré-instillées). Ces images montrent l'instillation réussie des défis salins dans le lobe gauche du poumon néonatal. Dans la figure 9, le poumon de la souris a été trachéale instillé avec la solution saline définie ci - dessus (voir section 2.1). Les panneaux du milieu et de droite de la figure 9 sont des images de rayons X provenant de...
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Discussion
En utilisant l'imagerie par rayons X, des images claires des poumons néonatals peuvent être analysés pour pulmonaires volumes de fluide. Nous 7,3,11, et d' autres 10, avons utilisé avec succès imagerie par rayons X pour déterminer les changements dynamiques dans le volume de liquide pulmonaire dans des modèles animaux librement respiration anesthésiés, et cette technique est très prometteuse pour faire avancer l'étude des lésions pulmonaires néonatales. Un avantage majeur dans l' ut...
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Déclarations de divulgation
Cet article fait partie d'un numéro spécial sur l'imagerie multimodaux pré-clinique, parrainé par Bruker Biospin.
Remerciements
Ce travail est soutenu par une subvention accordée au MNH par Children’s Healthcare of Atlanta, la bourse APS 2014 Short-Term Research Education Program to Increase Diversity-Related Research (STRIDE) attribuée à PT, et l’installation d’imagerie intégrée de l’Université de Notre Dame.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Système d’imagerie préclinique (In-vivo MS FX PRO) | bruker ; Billerica, MA | ||
| Kétamine | Ketaset ; Santé animale Fort Dodge, IA | 26637-411-01 | |
| Laboratoires Xylazine | Lloyd ; Shenandoah, IA | 4821 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (avec calcium et magnésium) ; | Lonza ; Walkersville, MD | 17-513F | |
| Chlorure de sodium | Amresco ; Solon, OH | 241 | |
| Chlorure de Potassuim | Fisher Scientific ; Fair Lawn, NJ | P217-3 | |
| Chlorure de calcium | Sigma-Aldrich ; St. Loius, MO | C5080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich ; St. Loius, MO | H3375 | |
| Seringue à insuline de 0,3 ml avec aiguille de 31 G x 5/16" (8 mm) | Seringue à insuline BD ; Franklin Lakes, NJ | 328438 |
Références
- Institute of Laboratory Animal Resources. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8, The National Academies Press. (2011).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. , (2010).
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- Goodson, P., et al. Nadph oxidase regulates alveolar epithelial sodium channel activity and lung fluid balance in vivo via O2- signaling. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L410-L419 (2012).
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Réimpressions et autorisations
