Introduction
L'ubiquità di specie Arthrobacter in ambienti di terreno offre un vasto numero e la diversità dei fagi che possono essere isolati da questa specie di batteri ospiti. Membri batteriche della famiglia Acintobacteriaceae sono più notevole per i loro percorsi catabolici di degradare composti recalcitranti come l'atrazina e vari altri pesticidi e diserbanti 1,2,3. Sebbene la maggior parte della ricerca è stata effettuata utilizzando ceppi ambientali di Arthrobacter, isolati clinici di questo genere si trova nel sangue, urine, gli occhi, e molte altre fonti umane tutte espongono eterogeneità filogenetico 4.
Mentre vi è un corpo piuttosto ampio di ricerche sui batteri Arthrobacter, solo pochi studi riportano sui fagi capaci di infettare i membri di questo genere vario. Interessante notare, però, il lavoro fatto in precedenza su Arthrobacter fagi tocca diversi argomenti distinti chiave come la tipizzazione del suolo <em> specie Arthrobacter 5, usi industriali con lo scopo di ridurre la schiuma deleterio in attivati impianti di trattamento dei fanghi 6, e il lavoro evidenziando ricombinazione sito specifico e geni integrasi 7.
Vari protocolli tecnica di arricchimento sono stati impiegati per generare pura fagi isolati nelle specie Arthrobacter. Procedure I primi comprendono incubazione del terreno con l'aggiunta di agenti tossici, come i sali di nicotina per periodi di oltre un anno 8 dando luogo a fagi capaci di infettare solo A. globiformis. Studi condotti utilizzando terreno percolati con sostanze organiche labili sembravano produrre fagi rilevabili attraverso tecniche di analisi della placca, omettendo i periodi di incubazione lunghi 8. Interessante notare, però, una tecnica simile a semina diretta è stata utilizzata in passato ha dato origine a diversi fagi, pur avendo un tasso di successo notevolmente basso dagli investigatori 5, citando studi precedenti con basse percentuali di successo In generale, le tecniche di isolamento utilizzate in passato sono stati notevoli per avere poca efficacia nella pratica, nonostante le genere Arthrobacter rappresentano il terreno aerobico più comune isolare in natura 4,9,, Van Twest e Kropinski 10 attuali metodi di arricchimento per isolare i fagi da acqua e suolo adattato dalle tecniche precedenti utilizzate per arricchire isolati batterici ambientali, ma queste tecniche di arricchimento dimostrato inefficiente a isolare fagi Arthrobacter. Lo scopo del metodo qui descritto è quello di mostrare "proof of concept", che i metodi di arricchimento primi possono essere adattati per isolare in modo coerente ed efficace fagi Arthrobacter, superando precedenti sfide tecniche associate a isolare fagi da questo genere di batteri.
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Protocol
1. Preparazione di cellule Arthobacter per Phage Isolation
- Cultura Arthrobacter sp. KY3901 colonie striati su Luria Bertaini (LB) piastra agar incubata a 30 ° C per 2-3 giorni. Scegli una colonia e utilizzare un'ansa sterile per aggiungerlo a 250 ml di brodo LB in un pallone di coltura sconcertato e incubare in un incubatore agitazione a 225 rpm a 30 ° C.
- Lasciare circa 24 ore di crescita per ottenere cellule in fase esponenziale fine / inizio stazionarie per esperimenti di infezione fagi. Monitorare lo stato di crescita batterica strettamente per evitare che le cellule di entrare nel centro di stato di crescita stazionaria tardiva.
NOTA: la crescita delle cellule deve essere composto da un OD densità ottica di 600 tra 0,5 .0.7 per le procedure di isolamento fago e purificazione / passaggi di seguito descritti.
2. Raccolta dei fagi da campioni di suolo
- Raccogliere 200-400 g di suolo da posizione desiderata. Nota: Poiché i batteri nel Arthrobagenere CTER sono batteri del suolo comuni che e fagi che li infettano possono trovare in e sono presenti in quasi tutti i tipi di terreno.
- Aggiungere almeno 400 ml di Phage Buffer (PB) [68 mM NaCl, 10 mM MgSO 4, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5)] al terreno e miscelare in un matraccio abbastanza grande in modo che almeno 200 ml di PB è nel surnatante ed è in grado di essere estratto.
- Mescolare agitando o agitando delicatamente fino a quando il terreno è sospeso e lasciare il sedimento terreno di stabilirsi, di solito 30 min.
- Passare il "estratto terreno" su carta da filtro per filtrazione a gravità per rimuovere i detriti detriti sedimenti.
- Aggiungere la polvere LB e miscelare per ottenere una soluzione al 2% (4 g LB polvere in 200 ml di estratto suolo).
- Far passare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron per filtrazione sotto vuoto per ottenere un filtrato sterile. Se possibile, passare alla fase 2.7 immediatamente. Se del caso, conservare i campioni filtrati a 4 ° C per una settimana prima di procedere, tuttavia, il numero di particelle fagiche vitalisarà ridotto.
- Aliquota più 50 ml di miscela di estratto LB / terreno filtro sterilizzato in singole da 250 ml sterile agitando cultura palloni sconcertato utilizzando tecniche asettiche. Aggiungere sterile M CaCl soluzione 2.0 2 alle concentrazioni finali desiderati (0-50 mm) in quanto diversi fagi Arthrobacter crescono in modo ottimale in diverse CaCl 2 condizioni.
NOTA: Troviamo che la maggioranza dei fagi Arthrobacter individuati da noi sono all'interno della gamma di 1 mM-2.5 mM CaCl 2. Tuttavia, molti dei fagi isolati cresciuto da noi esclusivamente a 0 mM CaCl 2 .o ad altissima CaCl 2 concentrazioni. Procedere immediatamente al punto 3.1.
3. Phage isolamento
- Aggiungere 1 e 2,5 ml di ritardo esponenziale / inizio stazionaria coltura batterica di fase a ciascuno dei flaconi. Per un OD 600 0,5-0,7, utilizzare 1 ml di cellule. Per una OD 600 superiore un OD di 0,7 utilizzare 2,5 ml dicellule.
NOTA: Le cellule in fase di crescita esponenziale in genere producono più fagi e titoli superiori rispetto alle cellule in crescita fase stazionaria. - Agitare beute a 250 rpm a 30 ° C per circa 24 ore in un incubatore agitazione.
- Dopo un periodo di incubazione 24 ore rimuovere fiaschi di arricchimento dal termostato scuotimento e diluire i campioni di arricchimento di dieci volte in tampone fago.
- Istituito tubi di coltura con 0,5 ml di ritardo esponenziale / inizio stazionario coltura batterica di fase e aggiungere diverse quantità di coltura di arricchimento (5 ml a 500 ml di una diluizione 10 -1 in PB) ai tubi di coltura.
NOTA: Si consiglia di testare una vasta gamma di concentrazioni dal momento che ogni campione di suolo genera diversi titoli fagi dopo arricchimento. - Aggiungere CaCl 2 per provette di coltura per effettuare una concentrazione finale pari alla concentrazione presente nel pallone arricchimento originale. Utilizzare una gamma di CaCl 2 concentrazioni di selezionare per molti fagi wesima variabile CaCl 2 dipendenze.
NOTA: La maggior parte dei fagi saranno isolati all'interno della gamma CaCl 2 di 1-2,5 mm, ma ci sono fagi isolati più in modo ottimale ovunque 0-50 mM CaCl 2 concentrazioni. Per questo motivo è meglio controllare una gamma di CaCl 2 concentrazioni per massimizzare il numero di unici isolati fagi Arthrobacter. - Mescolare 4,5 ml di LB top agar nel tubo cultura e versare il composto su una piastra di agar LB. Agitare delicatamente per distribuire attraverso la piastra in modo uniforme e consentire top agar a solidificare per circa 15 min.
NOTA: Top agar può essere preparato in lotti più grandi (250 ml) e top agar extra può essere conservato a temperatura ambiente e riutilizzato per successivi esperimenti per almeno due settimane. Anche se ci sono diverse formule utilizzate per fare top agar, facciamo top agar utilizzando 7g / L di agar mescolato con LB. Inserire superiore agar in un bagno di acqua 60 ° C per mantenere allo stato liquido durante il corso di un esperimento. - Inverti tegli piastra e incubare a temperatura desiderata (temperatura di 30 ° C) O / N a 48 hr. Vary queste condizioni per ottimizzare i fagi attuali. Fagi più isolati provengono da piastre incubate a 30 ° C a 1-2.5 CaCl 2 mM concentrazione dopo una incubazione di 24 ore.
4. Phage Purificazione
- Dopo un controllo di incubazione 24 ore per la formazione della placca sui piatti. Continuare l'incubazione per un massimo di 72 ore se non placche sono evidenti o per determinare se appariranno targhe supplementari. Se necessario, le piastre negozio con targhe putativi per un massimo di una settimana a 4 ° C prima di procedere.
NOTA: Non è raro trovare una varietà di differenti morfologie placca su una piastra. Trovare placche dopo 3 giorni di incubazione è possibile ma rara. - Purificare fagi desiderati da placche chiaramente isolati con il metodo striscia targa. Toccare una targa con un bastone di legno sterile. Streak la targa eseguendo un bastone di legno con una fiamma, allowing bastone raffreddare brevemente, e poi strofinando il bastone sulla piastra di agar nel moto dolce come mostrato in Figura 1. Ripetere questo utilizzando uno scovolo per ogni passaggio.
- In alternativa, utilizzare il tradizionale saggio di placca titolo di isolare i singoli placche fagi. Il saggio di placca titolo richiede l'uso di più reattivi come LB agar LB e superiore agar e materiali come piastre Petri per l'isolamento fago placca. Abbiamo avuto un grande successo con il metodo striscia targa ma è tecnicamente più facile isolare singole placche utilizzando il saggio di placca titolo.
- Una volta che la piastra di agar LB è striata almeno tre volte, segnare l'area con la più bassa concentrazione di particelle fagiche putativi e delicatamente applicano 0,5 ml di Arthrobacter e 4,5 ml di LB agar fuso superiore (contenente la stessa concentrazione di cloruro di calcio come la piastra madre ) e permettono di diffondere in modo uniforme in tutto il piatto.
- Capovolgere e incubare piastra O / N. Ripetere la targa strisciatecnica per almeno tre iterazioni per assicurare una specie fagi puri è isolato. Conservare le piastre a 4 ° C per un massimo di una settimana, se necessario tra strisce senza una significativa perdita di redditività fago.
- Placche volta desiderati sono stati coltivati e isolato sul piatto striscia finale, toccare uno ben isolato targa con una punta micropipetta e risospendere in 100 microlitri PB. Serialmente diluire questa soluzione 10 0 fuori della diluizione 10 -8 passando 20 microlitri del campione in 180 ml di PB fresco.
- Aggiungere 10 ml di ciascuna diluizione di 0,5 ml di Arthrobacter cresciuto in una provetta per 5 a 10 min a temperatura ambiente e la piastra mescolando i batteri infettati con 4,5 ml di LB agar fuso superiore contenente la stessa concentrazione di CaCl 2 utilizzati per isolare il fago dal campione originale suolo. Salvare tutte le diluizioni effettuate a 4 ° C fino al giorno successivo.
- Determinare la diluizione in serie fago necessario per fare un modello web utilizzando il tradizionale titolo placcadire. Lo scopo del saggio di placca titolo è determinare il titolo fago necessario per ottenere una placca modello web. Identificare un modello piastra tela come in gran parte privi di batteri, ma contenente resti di batteri che non sono ancora stati lisati per fagi. Aggiungere 5 ml di cultura Arthrobacter stazionario esponenziale / inizio tardi per un 50 ml pallone di coltura sterile.
- Aggiungere 100 ml di diluizione (che ha dato un modello web alla cultura Arthrobacter) nel pallone di coltura e permettono fagi di infettare le cellule batteriche per 5 a 10 minuti a RT. Mescolare con fusa superiore agar LB contenente la stessa concentrazione di CaCl 2 come utilizzato per identificare inizialmente fago e piastra 5 ml di questa miscela su 10 piastre LB fresco. Lasciar solidificare ed incubare le piastre capovolte a 30 ° C.
- Il giorno successivo, inondare le placche modello web con 5 ml di PB e negozio O / N a 4 ° C o 4 ore a temperatura ambiente.
- Filtrare il lisato fago attraverso un filtro siringa da 0,22 microne conservare a 4 ° C. Utilizzare questo fago magazzino finale per ulteriori esperimenti come le immagini di microscopia elettronica di particelle dei fagi, fago isolamento DNA genomico per l'analisi di restrizione del DNA enzima e il sequenziamento genomico utilizzando le procedure standard. Per la conservazione a lungo termine del fago magazzino, aggiungere una quantità uguale di lisato fago di glicerolo sterile in piccole fiale per azione archiviazione a -80 ° C.
NOTA: Per chi non sperimentato con queste tecniche fagi, una grande risorsa è il sito online www.phagesdb.org accessibili.
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Representative Results
Per dimostrare la riproducibilità della tecnica di arricchimento migliorata per fagi Arthrobacter, 30 diversi campioni di terreno sono stati utilizzati in tempi e luoghi diversi durante la primavera e l'estate del 2014. Di questi campioni di suolo 30 fagi Arthrobacter unici sono stati ottenuti da 22 campioni di terreno raccolti utilizzando questo arricchimento procedura. La procedura standard di arricchimento prodotto fagi unici da 3 degli stessi campioni di suolo. I campioni di arricchimento possono avere un alto titolo fago dover diluizione iniziale per isolare placche o relativamente basso titolo fago richiede un volume maggiore di Arthrobacter arricchito per il rilevamento di successo delle placche. Usiamo il metodo targa striscia per isolare popolazioni fagi pure dopo arricchimento iniziale e placcatura in LB agar (Figura 2). In alternativa, uno standard tradizionale saggio di placca titolo può essere utilizzata per isolare un isolato fago pura se questo metodo richiede più tempo, reagenti, e materialila s. Come accennato in precedenza, noi utilizzare il saggio di placca titolo per determinare empiricamente numeri di titolo fago e il numero di unità formanti placca (PFUs) per formare un modello della tessitura su un piatto. La Figura 3 mostra una serie di diluizioni seriali per fago Banana e dimostra per una delle piastre ciò che un buon modello di web dovrebbe essere simile. Figura 4 illustra immagini micrografiche elettroni di 20 fagi Arthrobacter isolato con la tecnica di arricchimento. Dei 25 fagi attualmente isolate, 23 di loro sono siphoviruses con piuttosto lunghe code. Due dei fagi isolati sono myoviruses contenenti diametri di testa simili in lunghezza per quella delle loro code.
Figura 1. consecutive tecnica piastra schematica usata per l'isolamento di singole placche fagiche. La stella gialla rappresenta l'area sulla piastra che la LBtop agar soluzione più batteri devono essere attentamente versato sulla piastra dopo la striature fago placca è stata completata.
Figura 2. Esempi di tecnica piastra striscia utilizzata per l'isolamento delle placche per un fago (Dylan) a tre diverse temperature. Si noti che fago Dylan produce placche simili a RT, 30 ° C e 37 ° C. I cerchi rossi sulle due piastre circondano placche chiaramente isolati.
Figura 3. Targa dosaggio titolo. Arthrobacter fago Banana era serial diluito in PB e placcato su piastre di agar, come descritto nelle sezioni 4.6 e 4.7 del protocollo di testo. Indicati sono diluizioni seriali T-4 a T-8 (dall'alto). Si noti che the T-5 diluizione (dal basso verso l'alto) ha un modello web con solo una piccola quantità di prato batterica rimanendo. Diluizioni seriali inferiori (T-1 a T-3) creati piastre chiari con tutti i batteri lisati da particelle fagiche dimostrato dalla mancanza di crescita batterica.
Figura 4. Electron immagini micrografici di 20 fagi Arthrobacter isolati con la tecnica di arricchimento. Le immagini sono state scattate con una FEI Morgagni TEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nonostante i molti precedenti tentativi di isolare i fagi in grado di infettare gli host Arthrobacter, abbiamo avuto poco successo utilizzando le procedure di arricchimento standard. Il metodo generalizzato di arricchimento batterica sviluppato e adattato da van Twest e Kropinski 10 per arricchire fagi da campioni ambientali resta la base per la maggior parte delle procedure di arricchimento. Prove da studi precedenti suggeriscono che i metodi di placcatura diretta hanno prodotto placche rilevabili sui ceppi di Arthrobacter anche se con molto bassi tassi di successo di isolamento 5. Con il metodo di placcatura diretto, fagi sono estratti da campioni di terreno in un buffer fago e filtrati per rimuovere batteri contaminanti. L'estratto filtrato contenente particelle fagiche vengono aggiunti all'host batteri desiderato per consentire l'infezione della cellula ospite e placcato senza turni aggiuntivi di crescita di batteri e fagi di amplificazione.
La nostra tecnica di arricchimento è robusto e optimized per la relativamente facile isolamento di fagi Arthrobacter da Arthrobacter sp. KY3901. Con procedure arricchimento tradizionali, fagi, insieme con diversi tipi di batteri presenti nei campioni di suolo, sono estratti dal suolo in tampone fago e aggiunto al terreno di crescita fresco con cellule batteriche desiderati utilizzati come host per infezione fago. Con il metodo di arricchimento, tutti i batteri del terreno vengono rimossi dal terreno estratto campioni fagiche mediante filtrazione attraverso un filtro di 0,22 micron. I filtrati lisato contenente particelle fagiche sterili, ma non batteri del suolo, sono diluiti in 2x LB brodo con i batteri desiderati utilizzati come host propagazione fago. La principale differenza tra la nostra procedura di arricchimento e di altri è che non ci sono contaminanti batteri del suolo che competono per la crescita con i batteri di accoglienza durante il periodo di incubazione di arricchimento. L'unico host terreno estratto fago può infettare è quella dei batteri ospitanti desiderate e quindi MaximiZES il potenziale di crescita dei batteri ospitanti e l'amplificazione dei fagi specifici dell'host desiderati.
Nello sviluppo della procedura qui descritta si è cercato di tenere conto di polarizzazione selettiva inerenti a qualsiasi procedimento di arricchimento testando una serie di CaCl 2 concentrazioni 11. Qual è emerso che alcuni isolati fago mostrano differenze fisiologiche dipendenti parametri come concentrazione di ioni calcio e la temperatura. Per i futuri isolamenti Arthrobacter fagi abbiamo intenzione di testare fattori chiave come come il pH, la temperatura, la salinità, nutrienti, bivalenti ioni metallici per isolare i fagi in grado di riprodurre in modo ottimale i loro ospiti in varie condizioni ambientali.
Usiamo appena cresciuto Arthrobacter cellule in questo esperimento. Non usiamo cellule che raggiungono mezzo a fine fase stazionaria di crescita dal momento che abbiamo avuto difficoltà a isolare fagi o aventi titoli decenti con fagi noti a thè periodo di crescita. Altri hanno mostrato una inibizione di infezione fagi in fase stazionaria cellule Achromobacter 12 che può spiegare la mancanza di successo di isolare fagi utilizzando cellule batteriche in mezzo a fine fase stazionaria di crescita. Abbiamo avuto successo con le culture di questi esperimenti con una densità cellulare ovunque da una OD6 00 da 0,5 a 0.9. Colture coltivate sono conservati a 4 ° C e possono essere usati per l'isolamento fago fino a sette giorni. Tuttavia, il più le cellule Arthrobacter vengono conservati a 4 ° C più basso è il titolo e scoppio dimensioni delle particelle fagiche infettive. Risultati simili sono stati trovati con l'utilizzo di Escherichia coli per l'infezione di phageT4 13. Pertanto utilizzando cellule batteriche non appena possibile dopo che raggiungano la crescita desiderata massimizza possibilità di ottenere un romanzo fago da un campione di suolo.
In generale, l'uso di questa tecnica arricchimento con mezzi LB dovrebbe risultare difficilmenteesclusiva per l'isolamento di fagi Arthrobacter. Mentre LB è stato lo standard industriale per la coltura di E. ceppi coli e altri membri delle Enterobacteriaceae, supporta la crescita di un'ampia varietà di batteri in condizioni aerobiche 14. La ricca composizione nutrizionale di LB media può probabilmente essere usato in questo metodo per diffondere fagi in un gruppo incredibilmente eterogeneo di batteri aerobi impediscono sfide tecniche da ostacolare la scoperta fago.
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Disclosures
Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
I finanziamenti per lo sviluppo di questo protocollo è stato fornito dal Consorzio Pennsylvania sud-est per l'istruzione superiore e il Dipartimento di Scienze Cabrini College. Il finanziamento e il sostegno aggiuntivo provenivano da Arcadia University e Immacolata University. Abbiamo particolarmente Ringraziamo il Dr. Karen Snetselaar al St. Joseph University per prendere gentilmente le immagini al microscopio elettronico dei nostri fagi isolati. Ulteriore supporto è stato fornito dai Cacciatori Howard Hughes Medical Institute Science Education Alliance fagi Advancing Genomica e Evolutionary Science programma (SEA-fagi).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth powder | Fisher | BP9722-2 | It's best to order these in bulk. |
| Granulated Agar | Fisher | BP1423-2 | It's best to order these in bulk. |
| 0.22 um syringe filters | Fisher | 09-719A | |
| 0.22 um buchner filters | Fisher | 430320 | More than 50 ml of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube. |
| Eppendorf Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 5 ml pipets individual | Fisher | 13-678-11D | |
| 50 ml conical tubes | Fisher | 76002844 | |
| 15 ml conical tubes | Fisher | 76002845 | |
| 10 ml pipets individual | Fisher | 13-676-10J | |
| 25 ml pipets individual | Fisher | 13-676-10K | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher | 1001-824 |
References
- Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism. J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).
- Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil. J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).
- Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine. Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).
- Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).
- Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters. Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).
- Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).
- Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70. J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).
- Casida, L. E., Liu, K. C. Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil. J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).
- Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis. J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).
- Twest, R., Kropinski, A. M. Bacteriophage Enrichment from Soil and Water. Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).
- Fullner, K. J., Hatfull, G. F. Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria. Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).
- Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells. J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).
- Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age. Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).
- MacWilliams, M. P., Liao, M. K. Luria Broth (LB) and Luria Agar, Media and Their Uses Protocol. ASM MicrobeLibrary. , Available from: http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli (2013).
