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Biology

Medição de Extracelular Ion Fluxos Usando a técnica microeletrodos de auto-referência íon-seletivo

Published: May 3, 2015 doi: 10.3791/52782

Abstract

As células de animais, plantas e células individuais são envolvidas por uma barreira chamada a membrana celular que separa o citoplasma a partir do exterior. Camadas de células, tais como os epitélios também formam uma barreira que separa o interior a partir do exterior ou diferentes compartimentos de organismos multicelulares. Uma característica chave destas barreiras é a distribuição diferencial de íons através das membranas celulares ou camadas de células. Duas propriedades permitem que esta distribuição: 1) membranas e epitélios exibir permeabilidade seletiva de íons específicos; 2) são transportados através de bombas de iões através das membranas celulares e camadas de células. Estas propriedades desempenham um papel crucial na manutenção da fisiologia do tecido e agir como sinalização sinais de avaria, durante o reparo, ou sob condição patológica. A auto-referenciar microeléctrodo selectivo de iões permite medições de fluxos de iões específicos, tais como cálcio, potássio ou sódio em níveis de células e tecidos individuais. O microeléctrodo contém um ionóforo que é cocktailselectivamente permeável a um ião específico. A solução de enchimento interno contém um conjunto de concentração do íon de interesse. O potencial eléctrico do microeléctrodo é determinada pela concentração do ião exterior. À medida que a concentração de ião varia, o potencial do microeléctrodo muda como uma função do log da actividade de iões. Quando mudou-se para trás e perto de uma fonte ou sumidouro de íon (ou seja, em um gradiente de concentração devido ao fluxo de iões) o potencial flutua microeletrodos a uma amplitude proporcional ao fluxo de iões / gradiente. O amplificador amplifica o sinal de microeléctrodos e a produção é registada no computador. O fluxo de iões pode então ser calculado pela lei de Fick da difusão utilizando a flutuação potencial de eléctrodo, a excursão de microeléctrodo, e outros parâmetros, tais como a mobilidade de iões específica. Neste artigo, descreve em detalhes a metodologia para medir fluxos de iões extracelulares utilizando a auto-referência de microeletrodos um íon-seletivod apresentar alguns resultados representativos.

Introduction

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Todas as células animais estão rodeados por uma membrana de bicamada lipídica que separa o citoplasma a partir do ambiente exterior. A célula mantém um potencial de membrana elétrica, negativa no interior, por transporte ativo de íons um. O potencial de membrana é uma fonte de energia que a célula pode utilizar para operar vários dispositivos moleculares na membrana 2. Neurônios e outras células excitáveis ​​têm grandes potenciais de membrana. Rápida abertura dos canais de sódio recolhe o potencial de membrana (despolarização) e produz o potencial de acção que é transportado ao longo do comprimento do neurónio 2. Aparte destas alterações eléctricos rápidos, muitos tecidos e órgãos gerar e manter potenciais eléctricos significativos a longo prazo. Por exemplo, a pele e os epitélios da córnea gerar e manter potenciais trans-epiteliais e correntes eléctricas extracelulares por bombagem de iões direccional (principalmente cloreto de sódio e) 3.

tenda "> Enquanto as medições de corrente eléctrica extracelular endógena utilizando a sonda de vibração 4-6 e medições de membrana ou trans-epitelial potenciais utilizando o sistema de microeléctrodos 7-10 permitem a medição dos parâmetros eléctricos de membranas celulares e camadas de células epiteliais, eles não dão indicação da espécie iónicos envolvidos.

Microeletrodos com ionóforo seletivo pode medir a concentração de íon específico em solução. Gradientes de iões ou de fluxo podia ser medido com dois ou mais eléctrodos em diferentes posições. No entanto, o desvio de tensão intrínseco de cada sonda seria diferente, fazendo medições imprecisas ou mesmo a detecção de um gradiente que não estava presente. Um único eletrodo usado em modo "auto-referência", pelo qual ele se move em baixa frequência entre dois pontos resolve este problema. Agora o fluxo de iões pode ser visto no contexto de um relativamente lento e estável desvio de sinal (veja a Figura 3B). O sistema de medição sensível-ion utiliza microeletrodos de auto-referência de íon-seletivo para detectar pequenos fluxos extracelulares de íons perto de tecidos ou células individuais. O sistema é composto por um amplificador que processa o sinal a partir do microeléctrodos e um motor passo a passo e micro controlador para controlar o movimento do microeléctrodo. O microeléctrodo selectivo de iões e do eléctrodo de referência que fecha o circuito está ligado ao amplificador de andar de entrada por meio de um pré-amplificador (Figura 1A). O software de computador determina os parâmetros do movimento de microeléctrodos (frequência, distância) e também regista a saída do amplificador. O motor de passo controla o movimento através de um microeléctrodo microposicionador tridimensional. A baixa freqüência de vibração de microeletrodos íon-seletivo foi desenvolvido pela primeira vez em 1990 para medir o fluxo de cálcio específica 11. Bem como cálcio, cocktails ionóforos comercialmente acessíveis estão agora disponíveis para fazer microelectrodes sensíveis ao sódio, cloreto, potássio, hidrogénio, magnésio, nitrato, amónio, fluoreto, lítio ou mercúrio.

Basicamente, o ião-selectivo técnica de microeléctrodo auto-referenciar converte a actividade de um ião específico dissolvido numa solução para um potencial eléctrico, que pode ser medida por um voltímetro. O coquetel de ionóforo é um líquido imiscível (lipofílico orgânico,) fase com propriedades de permuta iónica. O ionóforo de complexos (se liga selectivamente iões específicos reversivelmente) e transfere-os entre a solução aquosa contida no microeléctrodo (electrólito) e a solução aquosa em que o microeléctrodo é imerso (Figura 1D). Esta transferência de iões leva a um equilíbrio electroquímica e uma variação do potencial eléctrico entre os microeléctrodos e o eléctrodo de referência é medido pelo voltímetro. A tensão é proporcional ao logaritmo da actividade específica de iões de acordo com a Nernst equation permitindo o cálculo da concentração de iões (Figura 2A e B).

Actualmente, vários sistemas de permitir a medição do fluxo de iões utilizando um conceito ou princípio semelhante. Por exemplo, a técnica do eletrodo íon-seletivo Scanning (SIET) 12,13 ou o microeletrodos Ion Flux Estimação (MIFE) técnica desenvolvida por Newman e Shabala 14-16 estão comercialmente disponíveis e amplamente utilizado pela comunidade de investigação a fim de determinar íon específico fundentes ocorrendo a membrana da célula e do tecido através de uma variedade de animais, plantas e modelos de células de estar solteiro. Microeletrodos íon-seletivo têm sido usados ​​para medir hidrogênio, potássio e fluxo de cálcio através de raízes de plantas 17, cloreto de fluxo em artérias cerebrais de ratos 18 e em tubos polínicos 19, fluxo de hidrogênio em células da retina de skate 20, o fluxo de cálcio no osso do rato 21, vário íon fluxos em 22 de hifas fúngicas e no ra córnea 23, e, finalmente, o fluxo de cálcio durante a cura da ferida célula única 12,24. Veja também a seguinte análise para obter informações detalhadas sobre auto-referência microeletrodos íon-seletivo 25.

O artigo a seguir descreve em detalhes como preparar e realizar a medição de fluxos de iões extracelulares endógenos utilizando a auto-referência técnica microeletrodos íon-seletivo no nível da célula única.

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Protocol

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1. íon-seletivo de auto-referência microeletrodos Preparação

  1. Preparação de microeléctrodos selectivo de iões
    1. Calor puxar finas capilares de borosilicato murados sem filamentos (diâmetro externo 1,5 milímetros, 1,12 mm de diâmetro interno), utilizando um extrator de microeletrodos.
      Nota: Isto dá dicas de 3-4 m de diâmetro. Dicas menores têm maior resistência que torna mais microeléctrodos sensíveis ao ruído electrónico e também está associada com uma resposta mais lenta para uma alteração na concentração de iões. Informações úteis pode ser encontrado no artigo publicado por Smith et ai. 26.
    2. Silanizar os eletrodos para tornar o hidrofóbico superfície interna para auxiliar a retenção do cocktail ionóforo lipofílico. Colocar os microeléctrodos em uma cremalheira e do calor do metal O / N num forno a> 100 ° C para secá-las. O rack é uma placa de metal com buracos de 2 mm de diâmetro perfurados parte do caminho. Coloque os eletrodos nos buracos ponta para cima com uma 250 ml gproveta moça sobre eles.
    3. Na parte da manhã, desligar o forno e, enquanto vestindo luvas isolantes, retire cuidadosamente a prateleira de metal com os eletrodos e copo no lugar. Fechar a porta do forno para reter o calor.
    4. Usar luvas de látex ou borracha nitrílica, jaleco e óculos de protecção. Com uma pipeta de Pasteur de plástico, colocar uma gota da solução de silanização I na base de cada um dos eléctrodos (manter o copo no lugar; utilizar o lábio de vazamento para o acesso de pipeta). A solução de silanização é vaporizado por a placa de aquecimento e silanizes o interior dos eléctrodos. Use um exaustor de fumos químicos para esta fase. Coloque o rack / copo / eletrodos de volta no forno quente por algumas horas para permitir que qualquer solução de silanização restante evaporar.
      Nota: Por razões de segurança, não ligue o forno novamente. Coloque uma etiqueta no forno indicando que não tem de estar ligado, pois pode conter vapor nocivo e inflamável.
    5. Após arrefecimento, armazenar as microeletrodos em um frasco insi armazenamento de microeletrodosDe a dessecador de vidro com 400 g de dessecante. Microeletrodos pode ser armazenado assim durante muitas semanas.
      Nota: Um método alternativo de silanização é descrito em Smith et ai 26.
    6. Voltar-encher o microeléctrodo com 50 a 100 mL (um comprimento de cerca de 1 cm) de uma solução contendo 100 mM de ião a ser medido (ver Quadro 1 e Figura 1B). Use uma pipeta de plástico descartável Pasteur calor puxado em um bico de Bunsen a uma multa de filamentos. Enxaguar a pipeta em dH2O depois para impedir o bloqueio.
      Nota: Em alternativa, ajustar a concentração de iões da solução de aterro para coincidir com a concentração de ião na solução externa 27.
    7. Observar o microeléctrodo sob um microscópio de dissecação para assegurar a ausência de bolhas de ar.
      1. Se as bolhas estão presentes torneira de microeléctrodos o levemente com uma unha, mantendo o eletrodo vertical (ponta para baixo) e / ou empurrar a bolhaé a ponta através da aplicação de contra-pressão, utilizando uma seringa modificado com um tubo de silicone de trocar a agulha.
    8. Tip-encher o microeléctrodo com 15 a 20 nl (um comprimento de 30-50 um) de ionóforo cocktail-ião específico (ver Tabela 1). Coloque uma pequena gota de ionóforo cocktail na borda curta de uma lâmina de microscópio. Observe a ponta de microeletrodos sob um microscópio de dissecação e movê-lo em direção a lâmina de microscópio até que a ponta de microeletrodos toca o cocktail ionóforo para apenas cerca de meio segundo. Desenhe o cocktail ionóforo na microeletrodos pela pressão capilar.
      Nota: Evite uma longa coluna de ionóforo cocktail pois isso aumenta a resistência elétrica da sonda, que pode torná-lo suscetível a interferência eletrônica (ruído) e também diminui o tempo de resposta.
    9. Montar o microeléctrodo em um suporte de microeléctrodos linear com um conector macho de ouro de 1 mm e de AgCl (Ag +) fio (Figura 1B). </ Li>
    10. Montar o suporte do microeléctrodo para a fase cabeça montada sobre um microposicionador controlado por computador tridimensional electrónica (Figura 1A).
    11. Colocar a ponta microeléctrodo em solução adequada para a medição da amostra a ser medida (solução fisiológica salina, meio de cultura, etc.) para permitir que o microeléctrodo para estabilizar durante uma hora ou duas, ou mesmo durante a noite.
  2. Preparação do eléctrodo de referência
    1. Eléctrodos de referência (Figura 1C) são as mesmas como acima capilares. Corte o capilar com um lápis de diamante em 5 cm de comprimento e fogo-polido em cada extremidade para 1-2 sec em uma chama de Bunsen.
    2. Encha estes eléctrodos com ~ 200 mL de uma solução de NaCl 3 M, CH 3 CO 2 K (acetato de potássio) ou de KCl com 2% de agarose. Escolha da solução, dependendo do ião a ser medido (o eléctrodo de referência não devem conter o ião a ser medido, ver Tabela 1). Misturara agarose e a solução e aquece-se quase a ferver em um forno de microondas. Mexa para dissolver a agarose (a solução passa claro).
    3. Conecte o eletrodo de referência a um Pasteur pipeta de plástico e chamar a solução quente no capilar.
    4. Gota o eléctrodo em 3 M de NaCl fria, CH 3 CO 2 K ou solução de KCl e armazenar nesta solução 3 M em tubos selados antes da sua utilização. Descarte qualquer eletrodos de referência com bolhas de ar.
    5. Monte o eletrodo de referência em um suporte de microeletrodos em linha reta (pré-preenchido com solução 3 M) com um AgCl (Ag +) pelota dentro e um ouro 2 milímetros conector macho (Figura 1C) e anexar o eléctrodo e titular em um micro-posicionador manual do montado em um suporte magnético.

2. íon-seletivo de auto-referência Calibração microeletrodos

  1. Preparar soluções de calibração contendo o ião de interesse como na solução de referência; ver Tabela 1 (por exemplo, meios de cultura, soro fisiológico). Isto é, uma solução de calibração deve conter uma concentração mais baixa do ião do que na solução de medição, e uma mais elevada.
    1. Por exemplo, utilizar soro fisiológico que contém 1 mM de K +. Para esta concentração entre parênteses, dissolver KCl pó em água desionizada a uma concentração de 10, 1 e 0,1 mM em diluições em série. Use essas soluções de calibração. Em alternativa, utilizar, pelo menos, duas destas soluções.
  2. Mergulha-se o microeléctrodo selectivo de iões e do eléctrodo de referência em cada uma das soluções de calibração e deixar que o valor de tensão estabilizar durante 1 a 3 minutos antes de gravar a tensão correspondente utilizando o software dedicado (ver Tabela 1).
  3. Como o software salva os dados de saída (amplificador) como um arquivo txt, copiar os dados para um arquivo de planilha. Traçar a saída de microeletrodos (mV) contra o logaritmoa concentração de ião molar (Figura 2A).
  4. Aplicar uma regressão linear e calcular a inclinação de Nernst, interceptar e R valor 2. Aceite o microeletrodos se a inclinação é de 58 Nernst ± 11 mV / década para íons monovalentes e 29 ± 11 mV / década para íons bivalentes (para cátions, a inclinação de Nernst é positivo, para ânions é negativo). Além disso, deve ter boas microeléctrodos uma correlação linear forte (R2> 0,9; Figura 2B).
    Nota: A saída de mV do amplificador usado aqui dá a leitura mV com um ganho dez vezes. Os valores têm de ser divididos por um factor de dez.
  5. Utilizar a fórmula de regressão linear para converter a saída em mV em bruto do microeléctrodo em concentração de ião real (Figura 2B).

3. Validação da técnica de microeletrodos íon-seletivo

  1. Preparar uma fonte artificial
    1. Capilares fonte artificial são os mesmos como capilaresacima. Calor puxe o capilar usando um extrator de microeletrodos como no passo 1.1.1.
    2. Backfill estes capilares com 200 ul de uma solução de NaCl, KCl 1 M, CaCl2 2 H2O ou tampão de pH 4. Escolha da solução fonte artificial de acordo com o ião a ser medido (veja Tabela 1).
      Nota: Como alternativa, puxe eletrodos com maior diâmetro da ponta (~ 20 mm) e ponta-preencher com as mesmas soluções mas contendo 0,5-1% de agarose (agarose vai impedir que qualquer fluxo de grandes quantidades de solução).
    3. Montar o capilar fonte artificial de um micromanipulador e mergulhá-lo na solução usada para medir o fluxo do ião nas amostras. Deixar a fonte artificial na solução durante 30 min a 1 h para permitir a estabilização do gradiente.
  2. Validação do microeletrodos íon-seletivo
    1. Mergulha-se o microeléctrodo selectivo de iões cerca de um centímetro de distância da fonte artificial capilar na solução usada para measure o fluxo de ião nas amostras e fechar o circuito com o eléctrodo de referência, tal como antes. Que o valor de tensão estabilizar durante 1 a 3 minutos antes de gravar a tensão correspondente utilizando o software dedicado para 1 a 2 min. Este valor corresponde ao valor de tampão (também referida na literatura como referência, o fundo ou valor em branco).
    2. Mover o microeléctrodo selectivo de iões a cerca de 5 mm a partir da origem artificial e deixar que o valor de tensão estabilizar durante 1 a 3 minutos antes da gravação da tensão correspondente, utilizando o software de 1 a 2 min.
    3. Repetir o procedimento acima, colocando o microeléctrodo selectivo de iões 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 e 1280 uM de distância do capilar fonte artificial.
    4. Extrair os dados como um arquivo txt e copie os valores em um arquivo de planilha.
  3. Calcula-se a concentração de iões correspondentes aos valores mV na mesma forma que para os valores de calibração. A partir do valor.
    NãoTE: Se um fluxo de iões está presente, o microeléctrodo detecta uma diferença na concentração de iões entre as duas posições (Figura 3B). Se a fonte artificial contém mais iões da espécie medida que a solução, a concentração deve ser maior próximo da fonte de longe, validando a capacidade do microeléctrodo selectivo de iões para detectar correctamente a direcção de um fluxo de iões (neste caso efluxo; para uma pia artificial, com concentração de iões específica menor do que meio de medição, deve ser influxo).
    1. Calcular o fluxo de iões utilizando a lei de difusão de Fick: J = c μ (dc / dx) em que c é a concentração de iões na solução (mol cm -3), μ é a mobilidade de iões (mol cm N -1 seg -1) e dc é a diferença de concentração ao longo distância dx (cm) (Figura 2C). Dados de fluxo de iões são geralmente apresentados em pmol cm -2 s-1 Ou -2 cm nmol seg -1.
      Nota:.. Um método alternativo para o cálculo de fluxo de iões descrito por Smith et al 26 pode ser usado. As principais diferenças incluem o uso do coeficiente de difusão em vez de a mobilidade iónica e a subtracção do fluxo de iões fundo (também tensão deriva ou factor de correcção), calculado a partir de medições de fluxo de iões na solução salina sem amostra.
    2. Traça-se a média dos fluxos de iões de cada etapa contra a distância a partir da fonte (Figura 2D). Afastando-se da fonte, observar um decréscimo exponencial do valor do fluxo validar a capacidade do microeléctrodo selectivo de iões para detectar diferentes magnitudes de fluxos de iões.
    3. Fazer a validação fonte artificial uma vez para cada íon específico destinado a ser gravadas, a fim de validar as suas medições de direção e magnitude corretas com um grande sinal-nrácio Oise.
      Nota: Medição de fluxo de iões do tampão sem amostras indica o nível de fundo ou ruído. Normalmente, a medição tampão não apresenta qualquer flutuação clara da concentração de íons levando a muito pequeno de fluxo que exibe direcção variável.

4. Preparação de medição Câmara

Nota: antes de experiências, considere a amostra a ser medida e como a amostra é para ser montado e imobilizado para medições de microeléctrodos.

  1. Para Xenopus laevis medições de ovócitos corte de 1 cm quadrado de uma malha de 800 mm de nylon (malha Nitex) e colá-lo em uma placa de Petri de plástico (Figura 1E).

5. Ion Flux Medição

  1. Medir a concentração de iões presentes no tampão usado para realizar as medições na amostra da mesma maneira que para a solução de calibração. X. oócitos laevis exigem modificação da campainha de Mark (MMR). Dissolve de NaCl, KCl, CaCl, e MgCl HEPES em água desionizada de modo a atingir uma concentração final de (mM): NaCl 100, KCl 2, CaCl 2, MgCl 1 e 5 HEPES. Ajustar o pH do tampão a 7,5 usando NaOH.
  2. Colocar a amostra na câmara de medição e trazer o microeléctrodo selectivo de iões perto da amostra (cerca de 10 um de distância) usando o microposicionador para definir a posição perto do microeléctrodo (Figura 3A).
  3. Iniciar a excursão de baixa frequência (0,3 Hz) (100 uM) do microeléctrodo entre a posição próxima e uma posição de distância a partir da amostra (distância) usando o software dedicado. Certifique-se de que o movimento do microeléctrodo é perpendicular à superfície da amostra.
    Nota: A excursão do microeletrodos podem ser definidas no software. Excursão grande aumenta o gradiente de ler permitindo uma mais fácil detecção de pequenos fluxos durante a medição enquanto prolonga o intervalo de amostragem e diminui a resolução temporal. Vejo
  4. Inicie a gravação usando o software. O microeléctrodo pausa em cada posição e o potencial eléctrico em mV é registada no computador. Obter medições durante pelo menos 2 minutos, permitindo que a estabilização do sinal. Para experiências de lapso de tempo curtos, as variações potenciais recorde na posição de interesse para todo o curso do tempo.
  5. Extrair os dados como um arquivo txt e copie os valores em um arquivo de planilha.
  6. Calcula-se a concentração de iões correspondentes aos valores mV na mesma forma que para os valores de calibração. A partir do valor.
    Nota: Se um fluxo de iões está presente, o microeléctrodo detecta uma diferença na concentração de iões entre as duas posições (Figura 3B).
  7. Calcular o fluxo de iões utilizando a lei de Fick da difusão, como anteriormente (passo 3.3.1).
  8. Repita a medição tampão antes de medir uma nova amostra e repita o procedimento de medição e cálculo de fluxo para cada novoamostra.

6. Análise Estatística e Dados Apresentação

  1. Testar os efeitos independentes da posição e / ou do tempo nos fluxos iônicos sob a condição de controle usando um modelo de ANCOVA com efeitos mistos 28.
    Nota: Análise de covariância (ANCOVA) é um modelo linear geral que mistura ANOVA regular e regressão, permitindo que tanto as medidas categóricas e contínuos para serem utilizadas como variáveis ​​independentes. Além disso, na presença de erros correlacionados induzidas por medidas repetidas por efeitos aninhados individuais e eventuais, modelos de efeitos mistos são utilizados para modelar estimativas precisas de ambos os efeitos fixos e aleatórios.
  2. Calcule comparações de pares usando teste t Student entre os níveis de grupo com correção de Bonferroni para múltiplos testes 28.
  3. Gerar boxplots para resumir medições de fluxo de iões de acordo com a posição ea hora. Incluem os valores de p do t de Student pares descritoacima (Figura 3D) e indicam níveis de significância de p valores como se segue: *: p <0,05; **: P <0,01; ***: P <0,001 29

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Representative Results

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Temos anteriormente demonstrado que o influxo de cálcio aparece depois de uma única célula ferindo 24. Nós, portanto, perguntado se outros fluxos de iões ocorrer após ferimento única célula. Utilizou-se o X. laevis oócito, um modelo bem estabelecido para única célula a cicatrização de feridas 30-34 e gravação eletrofisiológico 24,35-39. Curiosamente, íons de potássio são mais concentrados dentro X. oócitos laevis (cerca de 110 mM) de 40 na solução extracelular utilizado (em MMR 1x: 1 mM), sugerindo um efluxo de potássio em cima do ferimento. A fim de confirmar a hipótese de que, medida que o fluxo de potássio durante o curso de X. laevis cura membrana celular de ovócitos utilizando a auto-referência de microeletrodos íon-seletivo.

Para ferir o oócito, primeiro puxar um eletrodo capilar com um grande tamanho da ponta (~ 50 mm). Fixe o eletrodo para um suporte do eletrodo em linha reta e montar em um micro-posicionador manual. Ferida o oocyte tocando a membrana com a ponta do eletrodo 24. Logo após ferindo nós detectamos uma grande efluxo de potássio (até 250 nmol cm -2 s-1; Figura 3B - D). À medida que a membrana ferida curada, este fluxo reduzido, o retorno a valores de fluxo não ferida visto na membrana intacta (~ 5 nmol cm-2 s-1) quando a ferida cicatrizada (até 16 min após o ferimento; Figura 3B - D). ANCOVA revelou um efeito significativo de tempo após o ferimento em medições de fluxo de potássio (p <0,001). Análises posteriores mostraram um aumento significativo no efluxo de potássio de 1-2 min (p ​​<0,001) e em 5-6 minutos (p <0,05), mas não em 15-16 min após o ferimento quando comparado com o estado da membrana celular intacta (Figura 3D). Concluiu-se que, após ferimento célula única, um efluxo de potássio aparece ao nível da ferida que diminuem dutocar o curso de cura.

Íon Ionóforo cocktail Solução eletrolítica (100 mM) Solução de referência (3 M) Solução fonte artificial (1 H)
Ca 2+ Cálcio Ionóforo I Cocktail A (cat # 21048) CaCl 2 2H 2 O KCl CaCl 2 2H 2 O
Na + Sódio Ionóforo II Cocktail A (cat # 71178) NaCl KCl NaCl
Cl - Cloreto Ionóforo I Cocktail A (cat # 24902) NaCl CH 2 CO 2 K (Acetato de potássio) NaCl
K + Potássio Ionóforo I Cocktail A (cat # 60031) KCl NaCl KCl
H + Hydrogen Ionóforo I Cocktail A (cat # 95291) pH 7,0 KCl pH 4,0

Tabela 1:. Exemplos de cocktails ionóforos comumente usados ​​Também são mostradas as soluções adequadas para colocar nas microeletrodos, pois a fonte artificial e para realizar a calibração. Números de catálogo são da Sigma-Aldrich.

Figura 1
Figura 1:. Microeléctrodos selectivo de iões (A) Representação esquemática do sistema de microeléctrodos auto-referenciar selectivo de iões. Microeletrodos (B) íon-seletivo. (C) do eletrodo de referência. (D) A troca iônica entre a solução externa ea microelectrode através do ionóforo. (E) Esquema da câmara de medição utilizado para X. laevis oócito.

Figura 2
Figura 2: microeletrodos íon-seletivo de calibração, de origem artificial e de cálculo de fluxo (A) Calibração curva.. (B) A equação da curva de calibração e cálculo da concentração de iões. (C) Cálculo do fluxo de iões. Fluxo (D) Ion medidas a distâncias específicas da fonte artificial (KCl 1 M).

Figura 3
Figura 3: Evolução do fluxo de potássio em X. laevis ferida oócito durante a cicatrização. (A) fotografia e ilustração da excursãodo microeléctrodo selectivo de iões na medição da concentração de iões X. laevis ferida ovócito; a linha tracejada entre '' a '' e '' V '' representa o eixo animal vegetal. (B) Ilustração da variação da concentração de ião potássio em X. laevis ferida oócito durante a cicatrização. (C) Dispersão (XY) gráfico que mostra a média e o erro padrão da medição de potássio fluxo ao nível da ferida em diferentes tempos durante X. laevis cicatrização de feridas oócito. (D) Boxplot medição de fluxo que mostra o nível de potássio no da ferida em diferentes tempos durante X. laevis oócito cicatrização de feridas (n = 16; valores de p indicadas as seguintes: *: p <0,05; ***: p <0,001).

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Discussion

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Os passos mais críticos para a medição de fluxos de iões bem sucedida extracelulares in vivo são os seguintes: a redução do ruído, o fabrico correcto do micro-eléctrodos selectivos de iões e do eléctrodo de referência, e o posicionamento da amostra e ambos os eléctrodos.

A fim de minimizar o ruído, o sistema de gravação deve estar em uma ligação à terra (aterrada) gaiola de Faraday de preferência com um (isolamento de vibração) mesa com tampo de metal que também está ligado à terra. Além disso, o chassis de microscópio também deve ser ligada à terra. As fontes de ruído eléctrico incluem a fonte de luz. Uma fonte de luz 'sem ventoinha "de fibra óptica faz com que o ruído elétrico mínima. Finalmente, manter o fio de prata e o sedimento em microeléctrodo detentores clorada também minimiza o ruído (imersão em hipoclorito de sódio e lixívia enxaguar em dH2O) .A presença de bolhas de ar no microeléctrodo ião-selectivo ou no eléctrodo de referência irá resultar na medição fracasso como ocondutividade da microeletrodos será nula ou comprometida. Assim, é crucial para verificar os eléctrodos sob o microscópio antes de montá-los nos suportes. Veja o protocolo para procedimento detalhado para remover bolhas de ar. O posicionamento correcto, tanto da amostra e os microeléctrodos são necessários a fim de garantir resultados fiáveis ​​e reprodutíveis. A medição do fluxo de iões é dependente da excursão do microeléctrodo e a sua posição em relação à amostra. É importante identificar precisamente a zona de interesse que irá ser medido na amostra e posicionar o microeléctrodo para ter um movimento perpendicular a partir da amostra. Qualquer excursão dos microeléctrodos de uma forma que não é perpendicular à amostra irá resultar em medir o fluxo de iões alterada e maior variabilidade entre as amostras.

Cocktails ionóforos dedicadas a medir iões específicos, por exemplo de potássio, também podem detectar a presença de outros iões, tais como sódio.No caso em que a solução de medição contém uma elevada quantidade de um ião concorrente para o cocktail de ionóforo, é importante para determinar a selectividade do coquetel ionóforo usando o experimento fonte artificial. Aqui, a solução utilizada para a cultura X. oócitos laevis (MMR) contém uma elevada concentração de sódio. Assim, é importante avaliar se o cocktail ionóforo de potássio utilizada também detecta sódio. Ao utilizar o microeléctrodo ionóforo de potássio cocktail cheio, podemos tentar medir um fluxo de sódio utilizando uma fonte artificial que contém elevada concentração de sódio (1 M NaCl; ver Tabela 1) mantendo a mesma solução de medição. O gradiente químico favorece o efluxo de sódio, mas de preferência sem fluxo de sódio deve ser detectado pelo ionóforo cocktail específicos de potássio. Se um fluxo significativo é medido, a condição experimental deve ser optimizado. Por exemplo, a concentração do ião concorrente pode ser reduzido até ao ponto de a microelectrode não sentir mais isso, enquanto isso pode afetar o fluxo de sódio através da membrana plasmática que leva a potenciais interferências durante as medições de fluxo de potássio. Idealmente, um factor de correcção calculado a partir do experimento de origem artificial pode ser aplicada aos dados, ou outro cocktail ionóforo pode ser testado. Ion fluxo medições usando os microeletrodos de auto-referência de íon-seletivo permitir a medição de fluxos de iões ocorrendo em células e tecidos em solução aquosa. As medições de fluxos de iões em células ou tecidos que estão normalmente em contacto com um ambiente de ar exige a presença de uma solução que não está naturalmente presente no seu ambiente e que podem alterar o fluxo de iões e de troca que ocorre em condições normais. Atenção especial tem de ser feita para definir o conteúdo de tal solução e minimizar o desvio do ambiente original, fisiológica. O espectro de iões que pode ser medido pelas microele auto-referenciar selectivos de iõesctrode técnica depende da disponibilidade e existência de cocktails ionóforos específicas seletivo para o íon de interesse.

As medições de fluxo de iões realizadas com o auto-referenciar microeléctrodo selectivo de iões são feitas em solução, geralmente próximo da superfície de células ou tecidos, permitindo a medição não invasiva de fluxos de iões extracelulares. Este método não permite a medição de fluxos de iões dentro de tecidos, células e entre o espaço intercelular. A auto-referência de microeletrodos íon-seletivo não é o único método que permite a medição de fluxos de iões in vivo. Um novo método alternativo usa repórteres bioeletricidade fluorescentes 41, que permite a medição de fluxos de iões que não são possíveis usando microeletrodos. Estes corantes permitem medições de fluxos de iões dentro de tecidos e células e pode conseguir a localização subcelular. Esta técnica pode adquirir informação espacial do fluxo de iões dentro de tecidos e células, mas não de iões exalterar entre o tecido e o espaço extracelular. Além disso, os repórteres bioeletricidade fluorescentes normalmente geram dados semi-quantitativos. O uso de tecnologia baseada em microeletrodos para medir fluxos de iões ainda é válida e necessária e traz informações adicionais para o uso da bioeletricidade repórteres fluorescentes, tornando-os mais complementares do que concorrentes técnicas. Além disso, os desenvolvimentos recentes interessantes incluem detectores de auto-referência amperométricos de oxigênio, óxido nítrico e neurotransmissores dopamina e glutamato 42,43. Detecção amperométrica baseia-se numa reacção química na ponta do sensor. Novos microeléctrodos de fibra óptica ("optrodes") têm sido desenvolvidos para medir de forma não invasiva fluxo de oxigênio metabólica 34,35 e pH 44 com alta seletividade e sensibilidade 45,46. Há agora também uma sonda revestidos por nanopartículas à base de enzimas sensíveis à glicose 47.

Vimos que the íon-seletivo de auto-referência de microeletrodos permite medições de fluxos de iões extracelulares in vivo. Íons não são apenas trocadas entre as células / tecidos e espaço extracelular, mas também entre as células e tecidos dentro de organismos vivos. É importante combinar esta técnica com outros, tais como repórteres fluorescentes bioeletricidade, a fim de apreciar a resolução espacial dos fluxos de iões dentro de tecidos para além das medições reais dos fluxos de iões próximos à sua superfície. Além disso, os fluxos de iões representam uma parte importante do estado bioeléctrico que define as células e os tecidos em conjunto com o potencial de membrana celular, o potencial trans-epitélios ou correntes eléctricas extracelulares. É importante, para além da medição de fluxos de iões, para medir, em combinação, membrana celular e potencial trans-epitélios bem como extracelulares correntes eléctricas 24.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
IonAmp   BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA none amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
IonAmp32   BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA none software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Headstage pre-amplifier  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA INA116 BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
MicroStep Driver  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA none three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Manual micropositioner   World Precision Instruments  Model KITE-R Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Magnetic stand    World Precision Instruments Model M10 Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Vibration isolation table   Newport Inc.      Model VW-3036-OPT-023040 Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces Newport Inc.      Model 360-90 Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table
Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel Newport Inc.      460PD-X none
Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel Newport Inc. 460A-XY none
Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament  World Precision Instruments  TW150-4 none
Electrode puller  Narishige  PC-10 none
Metal rack Made in-house none Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel
Oven QL Model 10 Lab Oven none
Silanization solution I  Sigma-Aldrich 85126 Hazardous, handle as recommended by provider 
Glass Petri dish; Pyrex Fisher Scientific 316060 none
Electrode/micropipette storage jar World Precision Instruments  E215 none
Glass dessicator Fisher Scientific 08-595E Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight.
Plastic Pasteur pipette  Fisher Scientific 11597722 none
Bunsen burner Fisher Scientific S97329 none
Microscope slide Sigma-Aldrich S8902 none
Straight microelectrode holder Warner Instruments QSW-A15P with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire
Straight microelectrode holder  World Precision Instruments MEH3S with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector 
6 cm Petri dish VWR 60872-306 none
Nitex mesh Dynamic Aqua-Supply Ltd. NTX750 none
Glue; Loctite epoxy VWR 500043-451 Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing
Deionized water  Sigma-Aldrich 99053 none
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653 none
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9333 none
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016 none
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266 none
Hepes Sigma-Aldrich H3375 none
Sodium Hydroxyde Sigma-Aldrich S8045 none
Potassium Acetate Sigma-Aldrich P1190 none
Agarose Sigma-Aldrich A9539 none

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References

  1. Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
  2. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
  3. Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
  4. Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
  5. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
  6. Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. (2011).
  7. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  8. Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
  9. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. (2008).
  10. McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
  11. Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
  12. The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. Springer-Verlag. 235-252 (1999).
  13. Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 109-137 (2006).
  14. Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
  15. Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
  16. Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
  17. Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
  18. Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
  19. Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
  20. Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
  21. Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
  22. Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
  23. Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411 (2011).
  24. Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
  25. Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. H. (2007).
  26. Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
  27. Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
  28. Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D. Ch. 48. Compstat. Momirović, K., Mildner, V. Physica-Verlag HD. 317-321 (1990).
  29. Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. Graphical methods for data analysis. Wadsworth & Brooks/Cole. (1983).
  30. Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
  31. Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
  32. Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
  33. Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
  34. Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
  35. Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
  36. Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
  37. Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. London, England, 491-497 (1982).
  38. Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
  39. Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
  40. Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
  41. Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
  42. Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
  43. McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
  44. Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
  45. Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
  46. McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
  47. McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).
Medição de Extracelular Ion Fluxos Usando a técnica microeletrodos de auto-referência íon-seletivo
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Luxardi, G., Reid, B., Ferreira, F., Maillard, P., Zhao, M. Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique. J. Vis. Exp. (99), e52782, doi:10.3791/52782 (2015).More

Luxardi, G., Reid, B., Ferreira, F., Maillard, P., Zhao, M. Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique. J. Vis. Exp. (99), e52782, doi:10.3791/52782 (2015).

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