décrit ici un protocole pour isoler et approfondir l’étude des leucocytes infiltrants de la décidua basalis et de la decidua parietalis - l’interface mère-fœtus humaine. Ce protocole maintient l’intégrité des marqueurs de surface cellulaire et produit suffisamment de cellules viables pour les applications en aval, comme le prouve l’analyse par cytométrie en flux.
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Article de méthode
Isolement des leucocytes à partir de l'interface humaine materno-fœtale
Dans cet article
Résumé
Résumé
La grossesse est caractérisée par l'infiltration de leucocytes dans les tissus reproducteurs et à l'interface materno-fœtale (caduque basale et caduque pariétale). Cette interface est le site anatomique de contact entre la mère et de tissus foetaux; par conséquent, il est un site d'action immunologique au cours de la grossesse. Infiltrant leucocytes à l'interface materno-fœtale jouent un rôle central dans l'implantation, l'entretien de la grossesse, et le calendrier de livraison. Par conséquent, les caractérisations phénotypiques et fonctionnelles de ces leucocytes fourniront des renseignements sur les mécanismes qui conduisent à des troubles de la grossesse. Plusieurs protocoles ont été décrits dans le but d'isoler leucocytes infiltrant des caduque basale et parietalis caduque; Cependant, le manque de cohérence dans les réactifs, les enzymes, et les temps d'incubation, il est difficile de comparer ces résultats. Décrit ici est une nouvelle approche qui combine l'utilisation de diss mécaniques et enzymatiques doucestechniques de ociation de préserver la viabilité et l'intégrité des marqueurs intracellulaires et extracellulaires dans les leucocytes isolés à partir de tissus humains à l'interface materno-fœtale. Mis à part l'immunophénotypage, culture cellulaire, et le tri de cellules, les applications futures de ce protocole sont nombreuses et variées. À la suite de ce protocole, les leucocytes isolés peuvent être utilisés pour déterminer la méthylation de l'ADN, l'expression de gènes cibles, de fonctionnalité in vitro de leucocytes (par exemple, la phagocytose, la cytotoxicité, la prolifération des cellules T, et de la plasticité, etc.), et la production d'espèces réactives de l'oxygène à l'interface materno-fœtale. En outre, en utilisant le protocole décrit, ce laboratoire a été en mesure de décrire les leucocytes nouvelles et rares à l'interface materno-fœtale.
Introduction
La grossesse est caractérisé par trois phases distinctes: une immunologiques) implantation et la placentation précoce associée à une réponse pro-inflammatoire (par exemple, implantation ressemble à un «plaie»); 2) le deuxième trimestre et la plupart du troisième trimestre de la grossesse, lorsque l'homéostasie immunitaire est atteint grâce à un état majoritairement anti-inflammatoire à l'interface materno-fœtale; et 3) la parturition, un état pro-inflammatoire 1-7. Les cellules immunitaires jouent un rôle important dans la régulation de la réponse inflammatoire à l'interface materno-fœtale où leur abondance et le changement de locali....
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Protocole
Ce protocole est approprié pour l'isolement des leucocytes des caduque basale et parietalis caduque en préparation pour l'immunophénotypage par cytométrie de flux. En outre, les cellules isolées peuvent être utilisées pour le tri cellulaire, culture cellulaire, l'isolement de l'ARN, et la cytologie. Avant de travailler avec les échantillons mentionnés dans le présent protocole, l'approbation éthique humaine doit être obtenue auprès du Comité d'éthique de la recherche locale et Institutional Review Board. La collecte et l'utilisation d'échantillons humains à des fins de recherche ont été approuvés par les Institutional Review Board de l....
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Résultats
. La dissection de tissus humains à l'interface materno-fœtale (caduque basale et caduque parietalis) est représenté en figure 1 Cette procédure comprend la dissection de la plaque de base, qui comprend les caduque basale (Figure 1A - D). Le basalis caduque est obtenue en enlevant la villosités placentaires (côté fœtal) à partir de la plaque de base (Figure 1C). Le parietalis caduque est recueilli par grattant doucement la membrane chorionique
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Discussion
Caractérisation des propriétés fonctionnelles et phénotypiques de l'infiltration des leucocytes à l'interface materno-fœtale humaine est essentielle pour la compréhension des mécanismes immunitaires qui conduisent à des troubles de la grossesse. Plusieurs techniques ont été décrites pour isoler les leucocytes de l'interface materno-fœtale humaine pendant la grossesse 10,14,25,28,37,42,43. Cependant, chacune de ces techniques est distinct, met en oeuvre des enzymes ou des combinaisons d'enzymes.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne divulguent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par l'Eunice Kennedy Shriver Institut national de la santé infantile et le développement humain, NIH / DHHS. Ce travail a également été soutenue, en partie, par l'Initiative de l'Université Wayne State périnatale en maternelle, périnatale et santé de l'enfant. Nous tenons à remercier Maureen McGerty (Wayne State University) pour ses lectures critiques du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Dissection | |||
| Outils de dissection stériles : ciseaux chirurgicaux, pinces et pince à épiler à pointe fine ; | Tout fournisseur | 20012-027 | |
| 1X solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Boîtes de Pétri grandes et petites | N’importe quel fournisseur | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (solution de détachement cellulaire) |
| Tubes coniques stériles de 2 ml à verrouillage sûr | N’importe quel | ||
| 50 ml tubes à centrifuger coniques | Tout fournisseur | ||
| 100 & micro ; Filtres à cellules m | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 ml tubes à essai en polystyrène à fond rond | Tout fournisseur | ||
| Pipettes de transfert | Tout fournisseur | ||
| Tubes C | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI milieu de culture 1640 ; | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10 % FBS et 1 % P/S) |
| Lames de chambre en plastique | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubateur | Thermo Scientific Corporation | HEPA Classe 100 | |
| Bain-marie | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| Compteur de cellules | Nexelcom | Cellomètre Auto2000 | |
| Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Séparation cellulaire | |||
| MS colonnes | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Séparateur de cellules | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30 &mu ; m filtres de pré-séparation | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml safe-lock tubes coniques | Tout fournisseur | ||
| Tampon MACS ; | (0,5 % d’albumine sérique bovine, 2 mM d’EDTA et 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
| Anticorps antigéniques antigéniques de surface des cellules humaines ; | BD Biosciences | (Tableau 1) | |
| Albumine sérique bovine ; | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD viability colorant | BD Biosciences | 564406 | |
| Lyse/Fix buffer ; | BD Biosciences | 346202 | |
| tampon FACS ; | (0,1 % BSA, 0,05 % d’azoture de sodium et 1X PBS, pH = 7,4) | ||
| Tampon de coloration ; | BD Biosciences | 554656 | |
| Trypan Blue solution 0,4 | %Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Milieu à gradient de densité de 20 % (1,077 + 0,001 g/ml) |
| Additional Instruments | |||
| Incubateur avec agitateur | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Cytomètre en flux | Centrifugeuse BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| ; | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| Système d’aspiration | Tout fournisseur | ||
| Dissociateur automatique des tissus ; | Miltenyi Biotec | gentleDissociateur |
Références
- Kelly, R. W. Inflammatory mediators and parturition. Rev Reprod. 1 (2), 89-96 (1996).
- Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta. 24, Suppl A. S33-S46 (2003).
- Romero, R., et al.
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Réimpressions et autorisations
