Ce protocole décrit une méthode de fabrication de nanoparticules de polymères conducteurs mélangées à du fullerène. Ces nanoparticules ont été étudiées pour leur utilisation potentielle en tant que photosensibilisateurs de nouvelle génération pour la thérapie photodynamique (PDT).
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Article de méthode
La thérapie photodynamique avec Blended polymère conducteur / Fullerene nanoparticules photosensibilisants
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans cet article, une méthode de fabrication et d’évaluation in vitro reproductible de nanoparticules de polymères conducteurs mélangées à du fullerène en tant que photosensibilisants de nouvelle génération pour la thérapie photodynamique (PDT) est présentée. Les nanoparticules sont formées par interaction hydrophobe du polymère semi-conducteur MEH-PPV (poly[2-méthoxy-5-(2-éthylhexyloxy)-1,4-phénylènevinylène]) avec le fullerène PCBM (ester méthylique de l’acide phényl-C 61-butyrique) en présence d’un solvant non compatible. MEH-PPV a un coefficient d’extinction élevé qui conduit à des taux élevés de formation de triplets et à un transfert efficace de charge et d’énergie vers le PCBM à fullerène. Ces derniers procédés améliorent l’efficacité du système PDT grâce à la formation de triplets et de radicaux assistés par le fullerène, et à la désactivation ultrarapide de MEH-PPV excité. Les résultats rapportés ici montrent que ce système de sensibilisation PDT nanoparticulaire est très efficace et présente une spécificité inattendue pour les lignées cellulaires cancéreuses.
Introduction
En thérapie photodynamique (PDT) photosensibilisants sont administrés à un tissu cible, et lors de l'exposition à la lumière du photosensibilisant génère Reactive Oxygen Species (ROS). ROS espèces tels que l'oxygène singlet et superoxyde peuvent induire un stress oxydatif et les dommages structurels à la suite de cellules et de tissus 1-4. En raison de sa facilité d'application de cette méthode a été activement étudiée et des essais cliniques ont eu lieu de 5,6. Cependant, des problèmes importants tels que la toxicité dans l'obscurité des sensibilisateurs, la sensibilité du patient à la lumière (en raison de la distribution non-s....
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Protocole
1. Lignes de culture de cellules
- (Cellules humaines ovariennes tumorales) en maintenant les flacons de cryogène dans l'eau chaude pour les moins de 2 min Thaw TE 71 (cellules épithéliales thymiques Souris), MDA-MB-231 (cellules de cancer du sein humain), de A549 (cellules de cancer du poumon humain) et OVCAR3 . Ajouter 10 ml de milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS à chaque lignée cellulaire et centrifuger pendant 6 min à 106 x g.
- Aspirer la suspension et ajouter des médias 3ml au culot. Mélanger les cellules correctement par pipetage à plusieurs reprises. Ajouter cette solution à la cellule préchauffé 7 ml de milieu DMEM supplémenté avec 1....
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Résultats
L'absorption et la cytotoxicité intrinsèque de nanoparticules
Les 50% en poids de nanoparticules mélangées MEH-PPV / PCBM ont été incubées avec TE 71, MDA-MB-231, A549 et des lignées cellulaires OVCAR3. Le niveau PCBM de mélange a été choisi comme 50% PCBM, qui a été montré pour fournir des propriétés de charge et de transfert d'énergie idéale entre les polymères et les fullerènes 14 conjugués. Images de fluorescence de nanoparticules absorption sont présentés dans
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Discussion
Pour atteindre nanoparticule absorption, il était nécessaire de maintenir certaines mesures critiques tout en fabrication des nanoparticules. Une solution IM 10 -6 MEH-PPV (mélangé avec 50% en poids PCBM) dans du THF a été préparé pour l'injection dans de l'eau DI, comme il a été observé que la concentration de cette solution joue un rôle important dans la détermination de la taille des nanoparticules est formée. La concentration a été vérifiée par spectroscopie UV-vis. Notez que dans l'étape de p.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient la National Science Foundation (NSF) pour le soutien financier de ce travail par le biais d’une bourse CAREER (CBET-0746210) et d’une bourse CBET-1159500. Nous tenons à remercier le Dr Turkson (Centre de cancérologie de l’Université d’Hawaï) et le Dr Altomare (Collège de médecine de l’Université de Floride centrale) pour leur aide avec la culture cellulaire.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Poly[2-méthoxy-5-(2-éthylhexyloxy)-1,4-phénylènevinylène] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | moyenne Mn/nbsp ; 150 000-250 000 |
| [6,6]-phényle C61 ; ester méthylique d’acide butyrique (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | >99.5 % |
| Tétrahydrofurane (THF) | EMD | TX0284-6 | Drisolv |
| 1 ml seringue | National Scientific Company | 37510-1 | Pour la filtration de la solution MEH-PPV |
| Filtre à seringue | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0.2 µ ; m, Seringue en PTFE |
| 1 ml | Hamilton Company | 81320 | Pour l’injection d’une solution MEH-PPV dans l’eau pour fabriquer des nanoparticules |
| Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium/Ham’s F-12 50/50 Mix (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution sans rouge de phénol (HBSS) | Qualité biologique (VWR) | 10128-740 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco, 1x sans calcium ni magnésium (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Sérum fœtal de bovin, régulier (inactivé par la chaleur) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Trypsine EDTA 1x 0,25 | Corning (VWR) | 45000-664 | Trypsine/2,21 mM EDTA dans HBSS sans bicarbonate de sodium, calcium et magnésium Parvovirus porcin testé |
| 16 % Paraformaldéhyde | Sciences de la microscopie électronique ; | 15710 | 16 % de paraformaldéhyde est dilué à 4 % par ajout de PBS |
| DAPI& | nbsp ; Biotium VWR | 89139-054 | Coloration nucléaire |
| Pipettes 5 ml | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 Flacon de culture | VWR | 82050-856 | pour l’élevage |
| de cellules Plaques à 96 puits | VWR | 82050-771 | pour essais MTT |
| Boîtes de culture tissulaire avec évents | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Iodure de propidium | Sondes moléculaires | P3566 | |
| Annexine V FITC | Colorant Invitrogen | A13199 | pour l’apoptose |
| Celltiter 96 non-R 1000 dosages | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, pour la détection du stress oxydatif | Invitrogen | C10444 | Pour ROS Spectromètre |
| UV-vis | de détection Agilent 8453 | ||
| Spectromètre de fluorescence | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| Diffusion dynamique de la lumière | PD2000DLS, Détecteur | ||
| Incubateur | NuAir DH Microscope confocal à flux | ||
| Zeiss Axioskop2 | 63X lentille d’objectif à immersion dans l’huile | ||
| Microscope à épiluminescence | Olympus IX71 | 60X objectif à immersion dans l’eau, Andor Zyla caméra sCMOS | |
| Simulateur solaire | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| Référence cellule solaire | Oriel ; | VLSI Standards Incorporated | |
| Lecteur de microplaques | BioTek Ex808 | ||
| Hémocytomètre | Hausser Scientific Partnership | 3200 | Pour le comptage de cellules |
Références
- Dolmans, D., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. J Natl Cancer Inst. 90 (12), 889-905 (1998).
- Ferrari, M.
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Réimpressions et autorisations
