Immunofluorescence de suivi de l'absorption cellulaire de la lactoferrine humaine et de son activité associée antivirale contre le virus de l'hépatite C

Résumé

La lactoferrine humaine (hLF) est un composant du système immunitaire. Dans cette étude, des tests d’immunofluorescence sont utilisés pour démontrer à la fois l’absorption hépatocellulaire de hLF et une réduction qualitative de la réplication du virus de l’hépatite C lors d’un traitement par hLF.

Résumé

L'immunofluorescence est une technique de laboratoire couramment utilisés pour étudier de nombreux aspects de la biologie. Il est généralement utilisé pour visualiser la distribution et / ou la localisation d'une molécule cible dans des cellules et des tissus. Immunofluorescence repose sur la spécificité des anticorps marqués par fluorescence contre leurs antigènes correspondants au sein d'une cellule. Les deux approches directes et indirectes immunofluorescence peuvent être utilisés qui reposent sur l'utilisation d'anticorps liés à un fluorochrome. L'immunofluorescence directe est moins fréquemment utilisé, car il fournit le signal inférieur, implique un coût plus élevé et moins de flexibilité. En revanche, l'immunofluorescence indirecte est plus couramment utilisé en raison de sa haute sensibilité et fournit un signal amplifié depuis plus d'un anticorps secondaire peut se rattacher à chaque anticorps primaire. Dans ce manuscrit, à la fois microscopie à épifluorescence et microscopie confocale ont été utilisés pour contrôler l'internalisation de la lactoferrine humaine, un élément important de la réponse immunitairesystème, dans les cellules hépatiques. De plus, nous avons surveillé le potentiel d'inhibition de la hLF sur la réplication intracellulaire du virus de l'hépatite C par immunofluorescence. Aussi bien les avantages et les inconvénients associés à ces approches sont discutées.

Introduction

L’immunofluorescence est une technique qui utilise un microscope à fluorescence pour visualiser la distribution et/ou la localisation d’une molécule cible dans un échantillon biologique. L’immunofluorescence repose sur la spécificité des anticorps marqués par fluorescence contre leurs antigènes correspondants au sein d’une cellule¹. Il est généralement utilisé sur des coupes de tissus et des lignées cellulaires cultivées afin d’analyser la distribution/localisation de diverses molécules biologiques telles que les protéines, les acides nucléiques et les glycanes. Il convient de noter que l’immunofluorescence est souvent utilisée en combinaison avec d’autres méthodes de coloration fluorescente sans anticorps, telles que les colorants 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) qui sont généralement utilisés pour marquer l’ADN². De plus, cette technique implique la fixation des cellules qui permet l’analyse des cellules à un moment précis.

Différents types de microscopes peuvent être utilisés pour analyser des échantillons d’immunofluorescence. Le plus simple est le microscope à épifluorescence (Figure 1) pour lequel l’excitation du fluorochrome et la détection de la fluorescence se font par le même chemin lumineux³. Étant donné que la majeure partie de la lumière d’excitation est transmise à travers l’échantillon, seule la lumière excitatrice réfléchie peut atteindre l’objectif avec la lumière émise. Cette approche conduit malheureusement à un rapport signal/bruit élevé fréquent. En revanche, la microscopie confocale (Figure 2) offre un avantage certain pour augmenter la résolution optique et le contraste grâce à l’ajout d’un sténopé spatial placé dans le plan confocal de la lentille pour éliminer la lumière floue⁴. Cette approche permet de reconstruire des structures tridimensionnelles à partir des images obtenues. Cependant, comme une fraction importante de la lumière de l’échantillon est bloquée au niveau du sténopé, de longues expositions sont souvent nécessaires.

Il existe deux classes de techniques d’immunofluorescence, primaire (ou directe) et secondaire (ou indirecte). L’immunofluorescence directe implique un anticorps primaire lié à un fluorochrome (Figure 3). Cette méthode est moins fréquemment utilisée car elle fournit un signal plus faible, implique un coût plus élevé et une flexibilité moindre1. De plus, ces anticorps sont généralement plus difficiles à trouver dans le commerce. D’autre part, la fixation directe du fluorochrome à l’anticorps réduit considérablement le nombre d’étapes de la procédure, ce qui permet de gagner du temps et de réduire fréquemment le signal de fond non spécifique. Cela limite également la possibilité de réactivité croisée des anticorps.

L’immunofluorescence indirecte implique un anticorps primaire non marqué spécifique de l’épitope d’intérêt¹. Un anticorps secondaire qui porte le fluorochrome reconnaît ensuite l’anticorps primaire et se lie à lui (Figure 3). Bien que l’immunofluorescence indirecte soit plus complexe et plus longue que l’immunofluorescence directe, elle est fréquemment utilisée en raison de sa grande sensibilité et elle fournit également un signal amplifié puisque plus d’un anticorps secondaire peut se fixer à chaque anticorps primaire. De plus, une vaste gamme d’anticorps secondaires commerciaux est disponible à des prix abordables.

Le virus de l’hépatite C (VHC) est un problème majeur de santé publique avec 130 à 170 millions de personnes infectées de manière chronique dans le monde. Afin d’enrayer l’épidémie, le traitement contre le VHC devra être à la fois efficace et largement disponible. Des études portant sur un produit naturel sûr et abordable actif contre le VHC ont révélé l’activité antivirale de la protéine Lactoferrine humaine (hLF) qui se lie et neutralise le virion circulant⁵. Dans la présente étude, l’étude de l’activité des hLF sur le système de réplicon subgénomique du VHC, qui est indépendant de l’entrée et de l’excrétion virales, a révélé une activité antiréplicative distincte des hLF contre le VHC. Ce manuscrit présente une étude dans laquelle des tests d’immunofluorescence ont été effectués pour surveiller l’internalisation de l’hLF, un composant important du système immunitaire⁶, dans les cellules hépatiques. De plus, nous avons surveillé le potentiel inhibiteur de hLF sur la réplication intracellulaire du virus de l’hépatite C (VHC).

Protocole

1. Les cellules élaboration et au traitement

1. Dans une plaque de 24 puits, mettre un couvercle de verre au fond des puits. Laver chaque puits avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
2. Semences Huh-7 cellules de soutien réplicon sub-génomique du VHC dans chaque puits à une densité de 5 x 10 ⁴ cellules / puits. En l'absence de traitement à faire, les cellules peuvent être ensemencées à une densité plus élevée. Le milieu de culture est du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de Foetal Bovine Serum (FBS), 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM et 250 mg / ml de G-418 (pour maintenir le réplicon).
3. Incuber à 37 ° C et 5% de CO _{2. Le} lendemain, traiter les cellules avec 3 uM de hLF purifiée à partir de lait maternel humain.

2. Paraformaldéhyde / Préparation saccharose (12% PAF et 12% de saccharose)

1. Mettre 500 ml de PBS dans un bêcher et chauffer entre 20 ° C et 30 ° C. Dissoudre 60 g de saccharose dans le PBS. Dissoudre 60 g de Paraformalhyde (PAF) dans le / solution de saccharose PBS. Ajouter lentement NaOH 2N (3 à 7 ml) jusqu'à ce qu'une solution claire est obtenue.
2. Ajuster le pH à 7,4 avec HCl. Complète le volume à 500 ml avec du PBS. Filtrez par gravité sur filtre Whatman. Avant l'emploi, diluer la solution avec du PBS à une concentration finale de 4% et de PAF 4% de saccharose (de stockage 4 ° C pendant 1 semaines maximum).

3. immunofluorescence

1. Au moment voulu (0 h, 2 h ou 24 h de traitement), laver deux fois les cellules (1 min) avec du PBS et on fixe avec du PBS / 4% PAF / 4% de saccharose pendant 20 min à température ambiante. Les cellules sont généralement à 30-40% de confluence et de 1,5x10 ⁵ cellules sont utilisées.
2. Perméabiliser les cellules avec 0,15% de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min à température ambiante et le bloc de 10% de sérum de chèvre normal (NGS) dans du PBS pendant 20 min.
3. Diluer l'anticorps primaire de la protéine d'intérêt dans 10% de NGS (exemple: souris anti-anticorps primaire hLF dilué à 1: 1000). Appliquer l'anticorps primaire pour les cellules.
4. Après 4 heures à température ambiante ou O /N à 4 ° C, laver les cellules trois fois pendant 5 min avec 10% de NGS. Colorer les cellules avec un anticorps secondaire marqué avec un fluorochrome dilué dans 10% de NGS (exemple: fluorochrome avec la longueur d'onde d'excitation de 488 nm lié à un anticorps anti-souris 1: 1000) pendant 1 heure à température ambiante dans l'obscurité.
5. Laver les cellules une fois pendant 5 min avec du PBS et colorer les cellules avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (1 ug / ml) pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
6. Laver les cellules deux fois pendant 5 min avec du PBS. Placer le couvercle sur les verres SlowFade milieu de montage avant la visualisation au microscope. Les cellules sont maintenant prêts pour l'analyse par épifluorescence ou microscopie confocale.
7. Utiliser différentes commandes pour assurer la spécificité de la détection. Par exemple, tous les anticorps peuvent être omis dans le but de détecter autofluorescence. L'anticorps primaire peut être omis afin de déterminer la coloration non spécifique par l'anticorps secondaire. Enfin, si possible, contrôle de cellules ou de tissus qui ne sont pasexprimer la molécule d'intérêt peut également être utilisé.
8. Visualisez les échantillons en utilisant un microscope à fluorescence appropriée (à épifluorescence ou confocale) et jeux de filtres appropriés pour le marqueur fluorescent utilisé. Diapositives peut également être stocké dans une boîte de diapositives à <-20 ° C pour un examen ultérieur.

4. microscopie à fluorescence

1. Conserver les échantillons dans l'obscurité pour éviter photoblanchiment. Allumez la source de lumière du microscope choisi (épifluorescence ou confocale).
2. Allumez le microscope. Allumez l'appareil photo pour le microscope. Mettez la lame sur le microscope pour la visualisation. Ajouter de l'huile d'immersion sur le tiroir pour augmenter l'ouverture numérique de la lentille d'objectif.
3. Sélectionnez les filtres appropriés. Ajuster le focus et l'objectif approprié. Ajustez les volets afin de détecter le fluorochrome approprié, mais éviter photoblanchiment. Gardez plafonniers hors de minimiser fond clair quand on regarde l'échantillon.
4. Changer efiltres électroniques de visualiser différents fluorochromes (par exemple DAPI et pour une longueur d'onde d'excitation de 488 nm). Prenez des photos avec l'appareil photo.

Résultats

La capacité de la lignée de cellules Huh-7 hépatique administrée de manière exogène à internaliser hLF a été surveillée en utilisant une immunofluorescence sur Miscroscope confocale. hLF a été ajouté au milieu de culture et l'internalisation a été laissé pendant 24 heures, après quoi, la hLF extracellulaire a été lavée avec du PBS et la membrane résiduel lié hLF a été dégradé avec un traitement à la trypsine 5 min (1 ml). Les cellules ont été réensemencées et autorisés à ré-adhérer pendant 18 heures avant d'immu...

Discussion

L'épidémie de VHC demeure une menace mondiale, avec 80% des patients nouvellement infectés en développement une infection chronique, les mettant à risque de cirrhose, l'insuffisance hépatique ou carcinome hépatocellulaire. Action directe des agents antiviraux ciblant la réplication du VHC et de la maturation représentent premiers agents anti-VHC, comme l'a récemment démontré par l'approbation réglementaire de deux inhibiteurs de la protéase NS3 extrémité N-terminale (bocéprévir et télaprévir). L'acti...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Solide inflammable, irritant pour la peau, les poumons et les yeux.
PBS	Wisent	311-425-CL	Sans Ca2+ & Mg2+
NGS	Wisent	053-150
Anti-souris marqué AlexaFluor 488	Invitrogen	A11017
Anti-lapin marqué AlexaFluor 568	Invitrogeb	A21069
Agglutinine de germe de blé Alexa Fluor 488 conjugué (WGA)	Invitrogen	W11261
Anti-NS5A de lapin	Abcam	ab2594
Souris anti-hLF	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentiellement  ; mutagènes  ; et cancérigène
hLF	Sigma	L0520
Microscope visible/épifluorescence		TE2000-E
Microscope hélifluorescence/confocal	Olympus	FV1000

potentiellement mutagène Nikon