Immunofluorescence de suivi de l'absorption cellulaire de la lactoferrine humaine et de son activité associée antivirale contre le virus de l'hépatite C

Résumé

La lactoferrine humaine (hLF) est un composant du système immunitaire. Dans cette étude, des tests d’immunofluorescence sont utilisés pour démontrer à la fois l’absorption hépatocellulaire de hLF et une réduction qualitative de la réplication du virus de l’hépatite C lors d’un traitement par hLF.

Résumé

L'immunofluorescence est une technique de laboratoire couramment utilisés pour étudier de nombreux aspects de la biologie. Il est généralement utilisé pour visualiser la distribution et / ou la localisation d'une molécule cible dans des cellules et des tissus. Immunofluorescence repose sur la spécificité des anticorps marqués par fluorescence contre leurs antigènes correspondants au sein d'une cellule. Les deux approches directes et indirectes immunofluorescence peuvent être utilisés qui reposent sur l'utilisation d'anticorps liés à un fluorochrome. L'immunofluorescence directe est moins fréquemment utilisé, car il fournit le signal inférieur, implique un coût plus élevé et moins de flexibilité. En revanche, l'immunofluorescence indirecte est plus couramment utilisé en raison de sa haute sensibilité et fournit un signal amplifié depuis plus d'un anticorps secondaire peut se rattacher à chaque anticorps primaire. Dans ce manuscrit, à la fois microscopie à épifluorescence et microscopie confocale ont été utilisés pour contrôler l'internalisation de la lactoferrine humaine, un élément important de la réponse immunitairesystème, dans les cellules hépatiques. De plus, nous avons surveillé le potentiel d'inhibition de la hLF sur la réplication intracellulaire du virus de l'hépatite C par immunofluorescence. Aussi bien les avantages et les inconvénients associés à ces approches sont discutées.

Introduction

L’immunofluorescence est une technique qui utilise un microscope à fluorescence pour visualiser la distribution et/ou la localisation d’une molécule cible dans un échantillon biologique. L’immunofluorescence repose sur la spécificité des anticorps marqués par fluorescence contre leurs antigènes correspondants au sein d’une cellule¹. Il est généralement utilisé sur des coupes de tissus et des lignées cellulaires cultivées afin d’analyser la distribution/localisation de diverses molécules biologiques telles que les protéines, les acides nucléiques et les glycanes. Il convient de noter que l’immunofluorescence est souvent utilisée en combinaison avec d’autres ....

Protocole

1. Les cellules élaboration et au traitement

1. Dans une plaque de 24 puits, mettre un couvercle de verre au fond des puits. Laver chaque puits avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
2. Semences Huh-7 cellules de soutien réplicon sub-génomique du VHC dans chaque puits à une densité de 5 x 10 ⁴ cellules / puits. En l'absence de traitement à faire, les cellules peuvent être ensemencées à une densité plus élevée. Le milieu de culture est du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de Foetal Bovine Serum (FBS), 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM et 250 mg / ml de G-418 (pour maintenir le répli....

Résultats

La capacité de la lignée de cellules Huh-7 hépatique administrée de manière exogène à internaliser hLF a été surveillée en utilisant une immunofluorescence sur Miscroscope confocale. hLF a été ajouté au milieu de culture et l'internalisation a été laissé pendant 24 heures, après quoi, la hLF extracellulaire a été lavée avec du PBS et la membrane résiduel lié hLF a été dégradé avec un traitement à la trypsine 5 min (1 ml). Les cellules ont été réensemencées et autorisés à ré-adhérer pendant 18 heures avant d'immu.......

Discussion

L'épidémie de VHC demeure une menace mondiale, avec 80% des patients nouvellement infectés en développement une infection chronique, les mettant à risque de cirrhose, l'insuffisance hépatique ou carcinome hépatocellulaire. Action directe des agents antiviraux ciblant la réplication du VHC et de la maturation représentent premiers agents anti-VHC, comme l'a récemment démontré par l'approbation réglementaire de deux inhibiteurs de la protéase NS3 extrémité N-terminale (bocéprévir et télaprévir). L'acti.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Solide inflammable, irritant pour la peau, les poumons et les yeux.
PBS	Wisent	311-425-CL	Sans Ca2+ & Mg2+
NGS	Wisent	053-150
Anti-souris marqué AlexaFluor 488	Invitrogen	A11017
Anti-lapin marqué AlexaFluor 568	Invitrogeb	A21069
Agglutinine de germe de blé Alexa Fluor 488 conjugué (WGA)	Invitrogen	W11261
Anti-NS5A de lapin	Abcam	ab2594
Souris anti-hLF	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentiellement  ; mutagènes  ; et cancérigène
hLF	Sigma	L0520
Microscope visible/épifluorescence		TE2000-E
Microscope hélifluorescence/confocal	Olympus	FV1000

potentiellement mutagène Nikon