La creazione di microtessuti funzionali all'interno di dispositivi microfluidici richiede la stabilizzazione dei fenotipi cellulari adattando le tecniche tradizionali di coltura cellulare alle limitate dimensioni spaziali dei microdispositivi. La modifica del collagene consente la deposizione strato per strato di assemblaggi di collagene ultrasottili in grado di stabilizzare le cellule primarie, come gli epatociti, come modelli di tessuto microfluidico.
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Articolo metodologico
Layer-by-layer collagene Deposizione nel Microfluidic Dispositivi per microtessuto Stabilizzazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Sebbene la microfluidica fornisca un controllo squisito del microambiente cellulare, la coltura di cellule all'interno di dispositivi microfluidici può essere challenging. 3D la coltura di cellule in gel di collagene di tipo I aiuta a stabilizzare la morfologia e la funzione cellulare, necessaria per la creazione di modelli di tessuto microfluidico nei microdispositivi. La traduzione delle tradizionali tecniche di coltura 3D per piastre di coltura tissutale in dispositivi microfluidici è spesso difficile a causa delle dimensioni limitate dei canali. In questo metodo, descriviamo una tecnica per modificare il collagene nativo di tipo I per generare soluzioni di collagene policationico e polianionico che possono essere utilizzate con la deposizione strato per strato per creare assemblaggi di collagene ultrasottili sopra le cellule coltivate in dispositivi microfluidici. Questi sottili strati di collagene stabilizzano la morfologia e la funzione cellulare, come dimostrato utilizzando gli epatociti primari come cellula di esempio, consentendo la coltura a lungo termine di microtessuti in dispositivi microfluidici.
Introduzione
Sebbene la microfluidica consenta un controllo squisito del microambiente cellulare, la coltura di cellule, in particolare cellule primarie, all'interno di dispositivi microfluidici può essere impegnativa. Molte tecniche tradizionali di coltura cellulare sono state sviluppate per sostenere e stabilizzare la funzione cellulare quando vengono coltivate in piastre di coltura tissutale, ma tradurre tali tecniche in dispositivi microfluidici è spesso difficile.
Una di queste tecniche è la coltura di cellule sopra o inserite tra gel di collagene come modello dell'ambiente cellulare 3D fisiologico. 1 Il collagene di tipo I è una delle ....
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Protocollo
1. Preparazione della soluzione nativa Solubile Collagene
- Preparare o acquistare 200 mg di acidificato, solubile, collagene di tipo I da code di ratto a 1-3 mg / ml utilizzando i protocolli di isolamento standard, come riportato da Piez et al. 15
- Scalare la quantità di materiale di partenza in base al volume finale desiderato soluzioni collagene modificati. Circa fare 25-30 ml di metilato e 25-30 ml di soluzione di collagene succinilate, ciascuno a 3 mg / ml, da 200 mg di collagene nativo solubile.
2. Collagene metilazione
- Diluire 100 mg del, acidificata (pH 2-3) soluzione di colla....
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Risultati
Collagene nativo può essere modificato con metilazione e succinilazione per creare soluzioni di collagene policationici e polianionici per l'uso in strato per strato di deposizione. Succinilazione modifica i gruppi ε-amino di collagene nativo con gruppi succinil e metilazione modifica i gruppi carbossilici di collagene nativo con un gruppo metilico (Figura 1A). Queste modifiche alle catene laterali di aminoacidi della proteina collagene alterano le curve di titolazione del pH per le soluzioni. Succi.......
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Discussione
Ultrasottili assiemi collagene puro possono essere depositati su cellule caricate o superfici dei materiali utilizzando deposizione layer-by-layer di collageni modificati. I risultati di questo studio dimostrano che la metilazione e succinilazione di collagene nativo creare soluzioni collagene policationici e polianionici (Figura 1) che può essere utilizzato con la tecnica layer-by-layer depositare assiemi matrice di collagene ultrasottili sulle cellule (Figura 2) o altro addebitate sup.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health, tra cui una sovvenzione del consorzio di sistemi microfisiologici dal National Center for Advancing Translational Sciences (UH2TR000503), una borsa di studio post-dottorato Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (F32DK098905 per WJM) e un premio pathway to independence (DK095984 per AB) dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| collagene di tipo I, coda di ratto | Life Technologies | A1048301 | opzione per collagene concentrato di coda di ratto |
| collagene di tipo I, coda di ratto | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | opzione per collagene concentrato di coda di ratto |
| collagene di tipo I, coda di ratto | EMD Millipore | 08-115 | opzione per collagene concentrato di coda di ratto |
| collagene di tipo I, coda di ratto | R%D Systems | 3440-100-01 | opzione per anidride |
| succinica | Sigma-Aldrich | 239690-50G | reagente di succinilazione |
| metanolo anidro | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | reagente di metilazione |
| idrossido di sodio | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Reagente di precipitazione del pH |
| cloridrico | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | Reagente per precipitazione del pH |
| collagene di ratto di tipo I ELISA | Chondrex | 6013 | opzione per rilevare il contenuto di collagene |
| kit di dosaggio dell'idrossiprolina | Sigma-Aldrich | MAK008-1KT | opzione per il rilevamento del contenuto di collagene |
| kit di dosaggio dell'idrossiprolina | Quickzyme Biosciences | QZBtotcol1 | opzione per il rilevamento del contenuto di collagene |
Riferimenti
- Pedersen, J. A., Swartz, M. A. Mechanobiology in the third dimension. Ann Biomed Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
- Glowacki, J., Mizuno, S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers. 89 (5), 338-344 (2008).
- Vescio, R. A., et al.
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Ristampe e permessi
