דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים

Introduction

xenografts נגזר מטופל הם מודלים ניסיוניים יותר ויותר פופולריים המשמשים לחקר הסרטן. הם יכולים לשמש לאפיון של סמנים ביולוגיים ומסלולים ביולוגיים, הערכה טרום-קלינית של יעילות תרופה, ויצירה של avatars לטיפולים בסרטן אישית ^1,2. בעבר, קבוצות מחקר אחרות פיתחו מודלים PDX או על ידי השתלה או הזרקת השעיות תא הסרטני בודדות או explants כל גידול לעכברים דיכוי חיסוני ^1. PDX אלה מודלים דורשים אוסף כירורגית של גידול מוצק טרי, מיימת הממארת או תפליט פלאורלי ממטופל עובר הליך כירורגי שהוא גם יקר וחושף את המטופל לסיכון מוגבר לתחלואת iatrogenic.

התפתחות האחרונה משמעותית בחקר הסרטן כבר זיהוי, הבידוד ואפיון תאים סרטניים במחזור. תאים הסרטניים אלה לברוח ממסת הגידול הראשונית ולהיכנס במחזורשבו הם משחקים תפקיד קריטי בגרורות ולהרע, הגורם השכיח ביותר של סרטן הקשורים תמותה ^3. ההערכה והאפיון של CTCs מכמה סוגים מוצקים גידול סיפקו מידע קליני לאבחון, פרוגנוזה, וניטור מחלת שייר ^3. מגוון של גישות המשמשות כיום להסתמך על שני מאפיינים הפיזיים, הביטוי של סמנים ביולוגיים, או מאפיינים פונקציונליים של CTCs יכול לשמש כדי לבודד יעילות ⁴ CTCs. שיטות בידוד קיימים macroscale CTC כוללות צנטריפוגה צפיפות שיפוע, סינון פיזי עם נקבוביות מסנן והפרדה נגד מולקולות פני השטח. מתודולוגיות בידוד CTC הנפוצות ביותר מבוססות על לכידה מבוססת נוגדן של CTCs. שתי סלקציה חיובית ושלילית של סמנים פני התא יכולה להיות מועסק כדי לבודד CTCs מהדם היקפי. סלקציה חיובית לCTCs במחזור ההיקפי נפוצה משתמשת סמני אפיתל (למשל, EpCAM) שמחדש הביע בCTCs אבל תאים לא hematopoietic. החסרון של שיטה זו הוא שCTCs עם פוטנציאל גרורתי לעתים קרובות עבר אפיתל לmesenchymal מעבר (EMT), שdownregulates סמני משטח אפיתל ^3. כדי לבודד CTCs עם פוטנציאל גרורתי, מתודולוגיה סלקציה שלילית המעסיקה את סמן משטח הדם, CD45, לרוקן את אוכלוסיית התאים הנורמלית של כדוריות דם לבנות ניתן להשתמש ^5.

סרטן הערמונית הוא הסרטן הנפוץ ביותר שאובחן וגורם עיקרי למקרי מוות הקשורים לסרטן בגברים ^6. המנגנונים של התקדמות גידול ותוקפנות אינם מובנות לחלוטין, ולכן הדור והאפיון של מודלים ניסיוניים כי לשחזר הטרוגניות המולקולרית של סרטן הערמונית הם עניין משמעותי. המודלים PDX של סרטן הערמונית היו נוצר בעבר על ידי קליטתם של תאי סרטן הערמונית אנושיים לimmunocomעכברים הבטיחו ^7,8. עם זאת הדור של מודלים כאלה כבר הקשו על ידי השיעור הנמוך engraftment של סרטן הערמונית בעכברים דיכוי חיסוני, אשר נבע בעיקרו האופי העצל של המחלה. לאחרונה, CTCs כבר השתמש כדי ליצור סרטן השד ^9, סרטן סרטן הריאות וערמונית ^{10 11} דגמי PDX. מחקרי הוכחה של קונספט אלה הציגו את האפשרות של יצירה עצמאי דגמי PDX של הצורך באיסוף דגימה כירורגית. במאמר זה אנו מתארים בפירוט שיטה לייצור מודל ניסיוני הרומן הזה.

Protocol

פרוטוקול זה נערך במוסד שלנו עם אישור מהלוח האתיקה מחקר המוסדי ועומד בכל הנחיות מוסדיות, לאומיות, ובינלאומיות לרווחת אדם.

1. אוסף של דם היקפי מחולים עם סרטן הערמונית מתקדם

הערה: בחר בחולים עם סרטן הערמונית גרורתי. לקבל את הסכמת מטופל בכתב ולתעד את המאפיינים קליניים של חולים, כולל גיל בבידוד וכימותרפיה קודמת וטיפולים הורמונליים. חולים עם מחלה גרורתית יהיו פוטנציאל יש ריכוז הגבוה ביותר של CTCs בדם היקפי.

1. לאסוף דגימות דם לאחר הסכמה מדעת ותחת Institutional Review Board המתאים אושר פרוטוקול. ללבוש כפפות לטקס ומעיל מעבדה לאורך כל ההליך.
2. חבר מחט 25 G פרפר וצינורות לבעל מחט. השתמש בספוגית אלכוהול כדי לנקות שטח שלוריד antecubital בין שריר הזרוע ואמה, ולאחר מכן להחיל חוסם עורקים לזרועו של המטופל.
3. הכנס מחט פרפר לתוך וריד antecubital ולדחוף צינור איסוף דם לבעל מחט להתחיל אוסף. לאסוף כ 10 מיליליטר של דם בצינורות אוסף המכילים חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) כדי למנוע קרישה.
4. הסר מחט פרפר מהמטופל ולהפעיל לחץ עם כרית גזה סטרילית על אתר של ניקור וריד דקות 1. אתר מכסה בתחבושת סטרילית.

2. בידוד של תאי mononuclear

הערה: הדם שנאסף מהשלב 1 יכיל תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) (לדוגמא, לימפוציטים ומונוציטים) בנוסף לCTCs mononuclear.

1. כל דם טפטפת לתוך צינור חרוטי קלקר 50 מיליליטר עם טפטפת סרולוגיות 5 מ"ל ולהוסיף מלח פתרון מאוזן הנקס (HBSS) ביחס של 1: 1. בעדינות תערובת פיפטה homogenize.
2. להוסיף 15 מיליליטר של תמיסה מוכנה מסחרי (Ficoll-Paque) להפריד מרכיבי דם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות מהירות נמוכה לצינור חרוטי 50 מיליליטר קלקר ריק.
3. בעדינות פיפטה כל דם ותערובת HBSS, מהשלב 2.1, לתוך צינור הקלקר מהשלב 2.2, כדי ליצור שכבה עליונה ברורה. פיפטה סט להגדרה הנמוכה ביותר כדי למזער ערבוב של פתרונות, זה יבטיח הפרדה יעילה.
4. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 30 דקות ב RT (25 מעלות צלזיוס). האטה מוגדרת ההגדרה הנמוכה ביותר כדי למנוע ערבוב של פתרונות לאחר הפרדה. ההאצה ניתן להגדיר לכל מהירות.
5. לאחר צנטריפוגה, לזהות את הפס לבן-אפור הדק של שכבת PBMCs וCTCs דחוק בין הפלזמה על פתרון עליון והפרדה בחלק התחתון של הצינור.
6. לאסוף את התאים מהפס הלבן-אפור בשלב 2.5 לתוך צינור קלקר 50 מיליליטר בעזרת פיפטה העברה פלסטיק.
7. להוסיף HBSS 50 צינור חרוטי מיליליטר קלקר עם PBMCs וCTCs וגentrifuge שוב ב 400 XG במשך 10 דקות RT לשטוף.
8. למזוג גלולה נוזלית וגלולה ב 50 מיליליטר של HBSS ו צנטריפוגות שוב ב 400 XG במשך 3 דקות ב RT לשטוף.
9. בטל supernatant, resuspend גלולה שנותר עם 5 מיליליטר של תאי דם אדומים תמוגה חיץ דגירה הפתרון למשך 5 דקות על RT.
10. הסר את מאגר תמוגה תא דם האדום על ידי צנטריפוגה ב 400 XG במשך 3 דקות ב RT.
11. בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מיליליטר PBS 1x בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) כדי לחסום לפני מכתים נוגדן.

3. תאי מכתים mononuclear עם CD45-FITC נוגדן לסלולרי קרינה המופעל מיון (FACS)

1. לכמת את מספר תאי קיימא (trypan הכחולים-שליליים) (מצעד 2.11) באמצעות hemocytometer או נגד תא אוטומטי. הכן 10 ⁶ תאי השעיה 1 x / מיליליטר (ב PBS 1x עם 10% FBS) ולמקם אותו על קרח עבור שעה 1.
2. להפיץ לכמתהשעיה תא מהשלב הקודם לשני צינורות. צינורות תווית כשליטה וצביעת CD45.
3. בצינור השליטה, להוסיף IgG1κ-FITC (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) בדילול של 1: 250. בצינור מכתים CD45, CD45 להוסיף FITC נוגדן ראשוני מצומדת (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) בדילול של 1: 250 ודגירת השעיות תא על קרח למשך 30 דקות. תיוג אנטיגן CD45 משמש להוציא תאי hematopoietic.
4. צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 3 דקות ב 4 ° C, וזורקים supernatant.
5. לשטוף את התאים פעמיים, על ידי השעיית כל גלולה עם סטרילי 1 x PBS בתוספת 10% FBS ואחריו צנטריפוגה ב 400 XG במשך 3 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
6. Resuspend תאי פתרון 1 מיליליטר של 1x PBS המכיל 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
7. סנן את הפתרון הסופי באמצעות כמוסות מסננת 35 מיקרומטר לצינורות 12 מ"מ x 75 מ"מ פוליסטירן.

4. בידוד של הערמונית CTCs ידיFACS

הערה: לנצל cytometer זרימה לאסוף CTCs השלילי CD45 החי.

1. בקרות שנקבעו פיצוי באמצעות תאים מהצינור שכותרתו, "שליטה".
2. צור שערים שלא לכלול פסולת ואשכולות של תאים באמצעות פרמטרים קדימה-פיזור וצד-פיזור מתאימים.
3. להקים את שערי FITC באמצעות השעיות תא מהצינור שכותרתו, "CD45-FITC."
4. תאי שער קיימא (DAPI שלילי) באמצעות כחול-ערוץ האוקיינוס ​​השקט.
5. לאסוף אוכלוסייה שלילית CD45 לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר פוליסטירן חרוטי המכיל 2 מיליליטר של רוזוול פרק זיכרון מכון (RPMI) 1,640 בתוספת 10% FBS.
6. צנטריפוגה ההשעיה תא גידול בערמונית מסודרים ב 400 XG במשך 3 דקות, ואז resuspend את כדורים ב200-500 μl של RPMI בתוספת 10% FBS.

5. הזרקה של CTCs לעכברים וניטור של xenograft צמיחה

הערה:לנהל את כל הליכי בעלי החיים בעמידה בפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים המוסדית. פרוטוקול זה נערך במוסד שלנו תחת בעלי חיים משתמשים בפרוטוקול ספציפי שאושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים שלנו בהתאם ועמידה בכל סוכנויות, תקנות רגולציה ומוסדיות הרלוונטיות והנחיות.

1. מערבבים את ההשעיה תא גידול בערמונית מסודרים עם מטריקס ביחס של 1: 1 ומניחים על קרח.
2. הרדימי עכבר לפני ההשתלה תת עורית בתא אספקת 5% (נ נ /) isoflurane בשאיפה בL 1 / דקה של חמצן. להבטיח הרדמה מתאימה על ידי בדיקה לאובדן של רפלקס קרנית ובוהן בעכבר.
3. באמצעות מחט 25 G ומזרק 1 מיליליטר, להזריק 250 μl של תאי גידול ערמונית ותת עורי השעיה תא מטריקס לשני אגפים העליונים של עכבר immunodeficient זכר 8-10 בן שבוע. להזריק 250 μl ללא קשר לריכוז CTC כנפח ההזרקה הוא אניערך mportant. ממשל SQ מרבי בעכבר הוא לא יותר מ 1 מיליליטר.  
4. צג עכברים על ידי ביצוע מישוש שבועי של אתרי הזרקת עכבר לצמיחה של צפיפות קשרי תת עורי ועל ידי מדידת משקל עכברים פעמיים בשבוע.
5. להרדים עכברים בחנק פחמן דו חמצני ואחריו נקע בצוואר הרחם והסרטן xenografts קציר תת עורית ערמונית אנושית כאשר גודל גידול הוא יותר מ -0.5 סנטימטרים ופחות מ 1 סנטימטר הקוטר הגדול ביותר על מנת להבטיח רקמת גידול מספיק לניתוחים מולקולריים והמעבר סדרתי. להרדים עכברים עם סימנים של מצוקה או ירידה במשקל של 15%, למרות גידול לא מוחשי.

Representative Results

פרוטוקול זה יוביל לדור של דגמי PDX מCTCs סרטן ערמונית המבודד CD45 שלילי. בהתבסס על שיטת הסלקציה השלילית בשימוש בפרוטוקול שלנו יש צורך להוציא תאים מתים באמצעות כתם DAPI. אחוז התאים השליליים CD45 זוהה על ידי cytometry זרימה משתנה ותלוי בניטל הגידול של המטופל (איור 1 א). מכתים Immunofluorescent של תאים ממוינים באמצעות CD45 וDAPI (לזהות גרעין תא) חושף תאים שליליים CD45, כפי שצוין על ידי החצים הלבנים (איור 1). באיור 1C, ניתן לראות צפיפות קשרי תת-עורי בשני האגפים של העכבר. כל צפיפות קשרי מייצגת צמיחת xenograft ויכולה להיות מוערכת להבדיל מהרקמה בריאה כפי שבולט משרירי הגב של העכבר ומוצק יותר במרקם. מרווח הזמן בין ההשתלה ופיתוח xenograft עשוי להשתנות במידה רבה בהתאם נטל CTC של patieמדגם NT, מספר התאים המושתלים והתוקפנות הביולוגית של CTCs. PDX הערמונית נוצר מCTCs לשחזר גידול בערמונית אנושי כפי שניתן לראות על ידי צביעת Hematoxylin ו Eosin, ועל ידי אימונוהיסטוכימיה לסמנים סלולריים ערמונית ספציפית, כגון קולטן האנדרוגן (AR) ואנטיגן ספציפי לערמונית קרום (PSMA) (1D איור).

איור 1. דור של מודלי סרטן הערמונית PDX מאדם סרטן ערמונית CTCs. () Cytometry זרימת עלילה הממחישה אוכלוסיות תאים ספציפיות מכתים CD45 מהדם היקפי של חולה עם סרטן הערמונית. . תאים עם כתם DAPI חיובי מתים ונשלל על ידי gating כדי להבטיח רק תאי קיימא מבודדים מכתים immunofluorescence (B) CD45 של אוכלוסייה ממוינת מאשר את נוכחות של CD45 ^-. תאים (חיצים לבנים) (ג) in vivo ואחרי קציר גידול (ד ') ניתוח של מודלים CTC PDX באמצעות Hematoxylin הקונבנציונלי וEosin והסמנים הספציפיים לערמונית.; קולטן האנדרוגן (AR) ואנטיגן ספציפי לערמונית קרום (PSMA). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

כתב יד זה מתאר שיטה לייצור המודלים PDX סרטן הערמונית מCTCs. השימוש בCTCs לדור של PDX יש דגמים כמה יתרונות חשובים פוטנציאליים בהשוואה לשיטות קיימות. ראשית, אוסף נגיש של CTCs מהדם היקפי מאפשר את הדור של דגמים ניסיוניים מאותו המטופל בשלבי מחלה שונים. שנית, איסוף דם מייצג שיטה בטוחה יותר וזולה לבודד תאים סרטניים בהשוואה לשיטות קיימות הדורשות הליכים כירורגיים לאוסף של תאים סרטניים.

שיטות מרובות של העשרת CTC תוארו אולם רב אינם נגישים לכל מעבדה בשל מגבלות מימון ומשאבים. אנחנו ביקשנו לפתח assay במעבדה שלנו שיכולים לנצל בשימוש בFACS, המתודולוגיה נוחה, זולה ונגישה למעבדות רבות. הגבלת פוטנציאל של מתודולוגיה זו היאהרגישות מספקת לזיהוי של תאים נדירים שיכול להגביל את השימוש בפרוטוקול זה לחולים עם נטל גבוה של גידול. מספר טכנולוגיות נוספות שמעסיקות תכונות פיזיות או ביולוגיות של תאי אפיתל יכולים לשמש מעל לצמצום מגבלה זו ולהגדיל את זיהוי ובידוד של אוכלוסיית תאים נדירה זה ^4. השיטה להעשרת CTC המתוארת בפרוטוקול זה מעסיקה סלקציה שלילית; לויקוציטים CD45 ⁺ מבוטלים וCD45 ^- CTCs נשמרים. חשוב להסיר את פוטנציאל זיהום CD45 ^- אלמנטים מהשעיות התא בעת המיון על ידי cytometry זרימה (למשל, תאים שאינם בר-קיימא.). בפרט, השימוש במאגר תמוגה תא דם אדום והמחדל של תאים ברים-חיות על ידי מכתים DAPI שיקולים קריטיים. בעוד צעדים אלה לא יכולים לערוב לכך שגורמים לא CTC לא לזהם את CD45 ^- אוכלוסייה, המחקרים הקודמים שלנו מצביעים על כך שp התא הרצויopulation מועשר מספיק עם שיטות אלה ^11. ייתכן שטוהר אוכלוסיית CTC יכול להיות שיפור באמצעות סלקציה חיובית, באמצעות נוגדנים לתא סמני משטח ייחודיים לתאי סרטן הערמונית ^3. בנוסף, ההטרוגניות CTC ומספר תאי האפיתל בדגימה ניתן לבדוק באמצעות EpCAM או כתמים מתאימים אחרים. עם זאת עיבוד נוסף של דגימת הדם ההיקפית עשוי סופו של דבר להגדיל את טוהר תוך הפחתת תשואה כוללת.

בפרוטוקול זה ביצענו הזרקה תת עורית של CTCs המבודד המאפשר להשתלה קלה וניטור של הגידול המתפתח. עם זאת, יש לי דגמים תת עורית אספקת תזונה לקויה שעלולות לסכן engraftment גידול ואובדן אוכלוסיות תאים סרטניים. אתרי הזרקה אלטרנטיביים כגון ערמונית העכבר (orthotropic), המקדמת את המיקרו-סביבת ערמונית, והזרקת קפסולה subrenal, אשר משפרת succengraftment essful ושומר ההטרוגניות גידול, יכולה להתבצע על בסיס העדפת חוקר ^1,2. בצורה אופטימלית, יש להשתמש במודלים של עכברי NOD / SCID / null IL2λ הקולט (NSG) כדי להגדיל את שיעור engraftment xenograft ^12, לעומת זאת זנים אחרים של עכברי מדוכאי חיסון (NOD / SCID או, עירום, SCID / בז ') יש גם שימשו בהצלחה בדור של גידולים מוצקים נגזר מודלים PDX ^1. מודלים PDX שנוצרו ניתן passaged סדרתי ויציבות של מאפייני גידול מקוריים במעקב תוך שימוש בשיטות גנטיות הוקמו ^9-11,13.

ההתאוששות של מספרים גבוהים של סרטן ערמונית קיימא CTCs תלויה בשלב מחלה. הדור המוצלח של דגמי PDX הוא הטוב ביותר ובטוח כאשר CTCs מבודדים מהדם של חולים עם נטל גרורתי גבוה. יש לנו נוצרו בהצלחה דגמי PDX מדגימות דם לטווח של 100 עד 10,000 CTCs. מניסיוננו, יש צורך לעבודה מאומן היטבאנשי atory לבצע פרוטוקול לעתים קרובות כדי להבטיח את הבידוד המוצלח של CTCs ערמונית מדגימות דם. אנו ממליצים שאנשי מעבדה תחילה הוכשרו בפרוטוקול זה על ידי שימוש בדגימות דם מאנשים בריאים רגילים ממוסמר עם תאים משורות תאי גידול. ההיעדרות או המספר נמוך של CTCs בסרטן הערמונית ראשוני עלולה להגביל את השימוש במתודולוגיה זו לסרטן הערמונית גרורתי.

השיטה לייצור CTC נגזרת מודלים PDX המתוארים בפרוטוקול זה יכול להיות מועסק לאחר מכן ביישומים רבים, כולל מחקר אפיון מולקולרי של סרטן הערמונית, הקרנת סמים, תגובת טיפול ניטור, פיתוח סמן ביולוגי, והתקדמות אחרת בטיפולים בסרטן אישית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2 x 2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 G needle
1 ml syringe