Method Article

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

DOI:

10.3791/53183

⸱

November 30th, 2015

 ,  ,  , 
1Program in Genetics & Genome Biology, The Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics, The University of Toronto, 3Program in Genomics of Differentiation, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, 4Departments of Pediatrics and Neurology, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo studio, descriviamo un metodo semplice per eseguire l'analisi del colorante blu di Evans (EBD) sulle larve di pesce zebra. Questa tecnica è un potente strumento per la caratterizzazione dell'integrità del muscolo scheletrico e la delineazione di modelli di distrofia muscolare di zebrafish, ed è un metodo prezioso per lo sviluppo di nuove terapie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il modello del pesce zebra è un sistema emergente per lo studio dei disturbi neuromuscolari. Nello studio delle malattie neuromuscolari, l'integrità della membrana muscolare è un determinante critico della malattia. Ad oggi, numerose condizioni neuromuscolari mostrano fibre muscolari degenerative con integrità anomala della membrana; Questo è più comunemente osservato nelle distrofie muscolari. Il colorante blu di Evans (EBD) è un colorante vitale e permeabile alle cellule che viene rapidamente assorbito nelle cellule degenerate, danneggiate o apoptotiche; Al contrario, non viene assorbito dalle cellule con una membrana intatta. L'iniezione di EBD è comunemente impiegata per accertare l'integrità muscolare nei modelli murini di malattie neuromuscolari. Tuttavia, tali esperimenti EBD richiedono la dissezione e/o il sezionamento muscolare prima dell'analisi. Al contrario, l'assorbimento dell'EBD nel pesce zebra è visualizzato in preparazioni vive e intatte. Qui, dimostriamo una metodologia semplice e diretta per eseguire iniezioni e analisi di EBD in zebrafish vivi. Inoltre, dimostriamo una strategia di co-iniezione per aumentare l'efficacia dell'analisi EBD. Nel complesso, questo articolo video fornisce uno schema per eseguire l'iniezione di EBD e la caratterizzazione in modelli di zebrafish di malattia neuromuscolare.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le distrofie muscolari costituiscono un gruppo di malattie muscolari umane prevalenti ed eterogenee con caratteristiche istopatologiche specifiche1,2. I sintomi tipicamente associati a questo devastante gruppo di malattie includono debolezza muscolare, degenerazione muscolare, perdita di motilità e mortalità precoce1,3. I principali meccanismi patologici delle distrofie muscolari sono la perdita di proteine che stabilizzano il sarcolemma, ancorano i complessi transmembrana e mediano la segnalazione cellulare attraverso la membrana4-6. Ad esempio, la perdita completa della proteina distrofina, una proteina primaria dello scaffold del complesso distrofina-glicoproteina, provoca la destabilizzazione della membrana muscolare nella distrofia muscolare di Duchenne7. A causa del fatto che la maggior parte delle distrofie muscolari deriva da mutazioni nelle proteine che partecipano al legame tra la matrice extracellulare e il citoscheletro sarcolemmale, un'osservazione comune a livello cellulare è la perdita di integrità sacrolemmale8,9. Questa comprensione dei meccanismi patologici primari associati alle distrofie muscolari è il prodotto di numerosi anni di ricerca che impiegano sistemi modello animale2,10-15. Tuttavia, nonostante i progressi nel campo, le opzioni terapeutiche per il trattamento o la gestione della gamma di sottotipi di distrofia sono ancora limitate. Questa limitazione delle terapie praticabili è dovuta a diversi fattori chiave: 1) la difficoltà delle strategie di terapia genica, 2) un'alta frequenza di casi di malattia de-novo e la corrispondente mancanza di modelli animali traducibili, e 3) la mancanza di strategie rigorose per testare le conseguenze fisiologiche di agenti terapeutici putativi con misure di esito chiare e riproducibili.

Per superare alcune di queste limitazioni, numerosi laboratori, incluso il nostro, stanno impiegando il pesce zebra come sistema per modellare e studiare le malattie neuromuscolari umane2. Ad oggi, il pesce zebra si è dimostrato uno strumento prezioso nella ricerca sulle malattie. Il modello di zebrafish è stato utilizzato per identificare e convalidare nuove mutazioni che causano malattie umane16,17, chiarire i meccanismi che causano malattie non caratterizzate17,18 e identificare nuove strategie terapeutiche12,19. Questi progressi sono stati fatti, in parte, dai punti di forza canonici del sistema del pesce zebra, come la loro chiarezza ottica, la facilità di manipolazione genetica e la capacità di riprodursi ingran numero. Il pesce zebra si è inoltre dimostrato modificabile per gli screening farmacologici su larga scala21, un metodo prezioso per l'identificazione di nuove terapie22-24. Per quanto riguarda la ricerca sulle malattie muscolari, questi punti di forza sono integrati dalla capacità di isolare singole fibre muscolari scheletriche di zebrafish tramite dissociazione25 e dalla capacità di esaminare l'organizzazione delle miofibre in vivo utilizzando il fenomeno ottico chiamato birifrangenza26, che collettivamente consente una rapida determinazione dell'integrità muscolare macroscopica. Indipendentemente da queste utilità disponibili, è necessario un ulteriore sviluppo degli strumenti per far progredire le indagini.

Noi, e altri, abbiamo adattato un protocollo per l'iniezione e l'analisi dell'EBD nel modello del pesce zebra. L'EBD è un colorante vitale permeabile alle cellule che viene assorbito dalle cellule danneggiate, degeneranti o apoptotiche e quindi visualizzato sotto fluorescenza27. Ad oggi, l'analisi EBD è stata ampiamente utilizzata per analizzare l'integrità della membrana muscolare in modelli murini di muscolo scheletrico e malattie cardiache8,9,27. Tuttavia, nelle preparazioni dei mammiferi, il muscolo raccolto richiede tipicamente un laborioso sezionamento o dissezione prima dell'analisi. Nel pesce zebra, l'analisi diretta è possibile in numero elevato utilizzando animali vivi e intatti. In questo articolo video, dimostreremo la metodologia per eseguire l'iniezione e l'analisi di EBD in larve di zebrafish vive, con immagini rappresentative dell'assorbimento di EBD nella linea mutante della distrofia di zebrafish sapje15,28. Inoltre, presentiamo una strategia di co-iniezione che consente una maggiore quantificazione dei preparati EBD.

Protocol

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1. Preparazione di piastre di agar iniezione (Tempo: 45 min)

  1. Far bollire 2% al 3% agarosio nei media E3 e lasciare raffreddare la soluzione un po 'sul banco. Nota: Il numero di piatti di iniezione viene preparato determina la quantità di agarosio richiesta. Ciascuna piastra di iniezione deve circa 35 ml della soluzione di agarosio.
  2. Dopo l'ebollizione, lasciare l'agarosio raffreddare fino al raggiungimento della temperatura desiderata (ad es., 45 ° C) secondo le istruzioni del produttore dello stampaggio ad iniezione.
  3. Versare circa 35 ml di agarosio raffreddati in un piatto 100 mm.
  4. Mettere una delle estremità del stampo iniezione preferito in soluzione, quindi copritelo resto di muffe su soluzione di agarosio (questo contribuirà a ridurre la presenza di bolle d'aria).
  5. Lasciare la soluzione di agarosio solidificare sia a RT o 4 ° C per circa 30 min.
  6. Utilizzare una spatola per separare una estremità dello stampo dal agarosio solido. Rimuovere lentamente il resto del m vecchio.

2. Preparazione di Evans blu tipo (EBD) Iniezione Mix (Tempo: 30 min)

  1. Fare un magazzino 1% di EBD in soluzione di 1X Ringer (155 mM NaCl, 5 mM KCl; 2mM CaCl 2; 1 mM MgCl 2; 2 mM Na 2 HPO 4; HEPES 10 mm; glucosio 10 mm; pH a 7.2), che possono essere conservati a temperatura ambiente.
  2. Ottenere una soluzione stock di isotiocianato di fluorescina (FITC) -dextran MW 10.000 kDa a 25 mg / ml in soluzione di Ringer 1X e conservare a -20 ° C.
  3. Preparare mix iniezione diluendo EBD al 0,1% direttamente in soluzione madre di FITC-destrano magazzino (cioè, per un volume finale di lavoro di 100 microlitri. Miscelare 10 ml di 1% DEB in 90 ml di destrano FITC magazzino).
  4. Mescolare bene iniezione vortice (dovrebbe diventare verde), e tenere fuori dalla luce diretta avvolgendo tubo mix di iniezione in un foglio di alluminio.

3. EBD iniezione Preparazione (Tempo: circa 30 min)

ent "> Nota: Protocollo funziona meglio con larve da 3-7 giorni dopo la fecondazione (DPF).

  1. Piastra iniezione Preriscaldare a RT.
  2. Istituito apparato iniezione disponendo micromanipolatore su lastra di metallo e stare accanto al microscopio in uso per l'iniezione. Accendere l'aria guidato controllore microiniezione. Nota: Il sistema di iniezione preferito varierà da laboratorio e non dovrebbe cambiare risultato dell'analisi.
  3. Torna riempire ago per iniezione con circa 2-4 ml di mix EBD.
  4. Calibrare volume di iniezione a circa 5 nl di mix EBD. Nota: la calibrazione Volume di iniezione dipenderà dal metodo di calibrazione. Una iniezione pistone guidato può direttamente essere impostato su un dato volume di iniezione che iniettori pressione del gas dovranno il volume di iniezione tarato tramite il volume di bolo con l'uso di un micrometro.
  5. Piastra iniezione bagnato con la soluzione di Ringer 1X e rimuovere l'eccesso dai pozzi.
  6. Pre-treat larve con 0,04% di etile 3 amminobenzoato methanesulfonate salt (tricaine) diluito in soluzione di Ringer 1X per immobilizzare larve prima dell'inizio dell'iniezione. Nota: Assicurare le larve sono completamente immotile è importante in quanto l'iniezione corretta è difficile con qualsiasi movimento residuo.
  7. Posizionare larve anestetizzato nei pozzetti delle piastre di agar iniezione utilizzando una pipetta di vetro. Assicurarsi che le larve sono completamente all'interno del pozzo, che giace su un fianco. Nota: Il numero di larve per bene è fino allo sperimentatore.
  8. Dopo le larve sono messi nei pozzetti, rimuovere la soluzione in eccesso di Ringer per ridurre al minimo il movimento larve all'interno del pozzo. Lascia un importo residuo di soluzione in modo che le larve non si disidrata.

4. Iniezione pericardico di Zebrafish larve con EBD (Tempo: A seconda del numero di larve per via parenterale, stimato 1-3 ore)

  1. Posizionare la piastra di iniezione contenente le larve in un ambito dissezione dove verranno eseguite le iniezioni.
  2. Posizionare l'ago pipetta di iniezione contenenteil EBD mix su un larve di pesce zebra.
  3. Riposizionare la piastra di iniezione facendolo ruotare in modo che l'ago iniezione è vicino il cuore del larve e circa 45 ° ventralmente dal asse anteriore-posteriore.
  4. Inserire l'ago di iniezione nella vena cardinale comune (CCV) nella regione della vena in corrispondenza della porzione anteriore del tuorlo cui la vena è inizialmente ruota nella direzione dorsale (Figura 1). Nota: Un ingrandimento di fino a 40x può essere utile per vedere chiaramente il CCV.
  5. Iniettare 5 nl del mix di EBD e tenere ago per iniezione in posizione per 5-8 secondi per ridurre al minimo la perdita immediata di mix EBD. Nota: Una buona iniezione avrà colorante colorazione visto nelle camere cardiache (Figura 1). Se mix EBD non si osserva nel cuore, poi iniettando un ulteriore 5 nl dell'impasto EBD può essere sufficiente per indurre l'assorbimento di colorante. In alternativa, l'embrione può essere scartato.
    Nota: In alcune situazioni, il cuore potrebbe smettere di battere. Se questo occurs, continuerà a monitorare le larve per 20-40 secondi. Tipicamente, il cuore riprende battere come il colorante si muove attraverso il sistema circolatorio.
  6. Passare al prossimo larve e ripetere.
  7. Identificare embrioni iniettati con successo osservando la presenza di FITC-destrano nella vascolatura immediatamente dopo l'iniezione (Figura 2).

5. Incubazione e EBD Assorbimento (Tempo: 4-6 ore)

  1. Dopo il numero desiderato di larve vengono iniettati, ritorno iniettato larve soluzione 1X Ringer senza tricaine a 100 mm piatti.
  2. Tenere piatti avvolti in un foglio di alluminio. Nota: Mantenere larve iniettato nel buio aumenta in modo significativo i tassi di sopravvivenza e garantisce la massima coerenza nella potenza del segnale. Involucro in alluminio è particolarmente importante per il periodo di tempo in cui le larve sono al di fuori del termostato.
  3. Lasciare che le larve di incubare a 28,5 ° C per 4-6 ore per garantire EBD sufficienti assorbimento.

6. Visualizzazione dei DEB nel muscolo (Time: A seconda del numero di larve iniezione e del tipo di microscopio, previsto per 0,5-3 ore)

  1. Prima di imaging, anestetizzare le larve con 0,04% tricaine per impedire il movimento.
  2. Vista sotto larve fluorescenza rossa per determinare se EBD assorbimento si verifica nel muscolo scheletrico (Figura 3).

Results

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Il mix di iniezione EBD è stato iniettato nel CCV di mutanti omozigoti sapje e wild-type fratelli a 3 dpf. Iniezioni che riempiva camere cardiache (Figura 1B) sono stati poi analizzati per iniezione di successo visualizzando FITC-destrano nella vascolatura sotto fluorescenza verde (Figura 2).

Dopo un periodo di incubazione di 4 ore, EBD assorbimento è stata esaminata a livello somite usando la microscopia a fluorescenza. Fratelli di tipo selvatico esposti alcuna fluorescenza EBD entro eventuali fibre muscolari visibili (Figura 3a), mentre i mutanti omozigoti sapje mostrato EBD assorbimento, che indica un danno alla membrana muscolo 15 (Figura 3B).

figure-results-1
Figura 1. Iniettare EBD mix iniezione nella vena cardinale comune (CCV) di un Embry zebrafisho. (A) uninjected embrione. Freccia indica il luogo ideale per l'iniezione CCV. (B) iniezione di successo nella CCV. Il colorante entra nelle camere cardiache (freccia) e inizia ad essere pompato attraverso il sistema vascolare. (C) Un'iniezione CCV senza successo si tradurrà in alcuni o tutti del colorante entrare nel sacco vitellino dell'embrione (freccia). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2. Gli embrioni possono essere ordinati per la iniezione di successo osservando distribuzione FITC-destrano sotto fluorescenza verde per tutto il sistema vascolare immediatamente dopo l'iniezione e prima EBD assorbimento.Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: EBD sarà ripreso da fibre con membrane danneggiate fratelli (A) di tipo selvatico che mostrano alcuna fluorescenza EBD nelle fibre muscolari.. (B) Sapje ​​mutante omozigote con fluorescenza EBD entro fibre muscolari multipli (frecce). Tutte le larve sono stati iniettati con il mix iniezione EBD e analizzato dopo un periodo di incubazione di 4 ore a 3 dpf. Fratelli e mutanti sono stati ordinati per muscolo distacco fibra prima dell'iniezione CCV. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebrafish stanno emergendo come un potente strumento per lo studio delle malattie neuromuscolari 2,29 malattia. Ad oggi, il sistema di zebrafish è stato utilizzato per convalidare nuovi muscoli che causano malattie mutazioni 16,17,30, chiarire nuovi meccanismi patogenetici 18, e di identificare potenziali nuovi farmaci terapeutici 12,24. Questi sforzi collettivi hanno stabilito l'utilità del zebrafish per modellare malattie neuromuscolari umane. Tuttavia, nonostante i progressi compiuti con modelli zebrafish e mammiferi, ci sono limitate opzioni di trattamento per i pazienti all'interno del vasto spettro di condizioni neuromuscolari. Pertanto, esiste una forte domanda di sviluppo di terapie per questo gruppo di malattie devastanti. Parallelamente questa richiesta di terapie è la corrispondente necessità di continua innovazione sperimentale, così come l'analisi rigorosa per verificare nuovi modelli animali e putativi strategie terapeutiche.

Analisi EBD è comunemente utilizzato in modelli murini pertessuto studio e danno cellulare nel cervello, cuore, e scheletrico 27,31 muscolare. In particolare, EBD sono ampiamente usate in modelli murini di vari sottotipi distrofia muscolare di mostrare la gravità del muscolo membrana instabilità e danneggiare 8. L'uso di EBD per rivelare danni membrana muscolare è un parametro di supporto che stabilisce analogie del modello animale per lo stato di malattia umana 9. Il potere di EBD nel topo ha condotto numerosi laboratori, compreso il nostro, per sviluppare e applicare EBD ai modelli zebrafish di malattie neuromuscolari. A causa della applicabilità di analisi EBD, questa tecnica è attivamente in corso di attuazione per corroborare modelli zebrafish allo stato di malattia umana 11,15,22,24,32. Larve con membrane muscolari danneggiate avrà EBD assorbimento e fluorescenza, pertanto rosso all'interno fibre muscolari. Fluorescenza osservato nello spazio inter-fibra, ma non all'interno singole fibre muscolari possono anche essere informativo di fibre si staccano dalla membrana basale in tegli assenza di danno alla membrana, fornendo utili dettagli diagnostico. Analisi EBD ha un potenziale di applicazione al di là di validazione dei modelli animali. Gli sforzi del nostro laboratorio hanno recentemente dimostrato che l'analisi EBD è utile nel convalidare potenzialmente nuovi farmaci terapeutici 24. Determinare se i potenziali trattamenti terapeutici ridurre o abolire EBD assorbimento in modelli di malattia neuromuscolare può significare rilevanti azione terapeutica 8. Questo tipo di analisi può aiutare a stabilire il meccanismo (s) di terapie ed espande l'applicazione dell'analisi EBD.

Come per molte tecniche, analisi EBD l'ha diversi avvertimenti da osservare durante la progettazione e la pratica sperimentale. Ad esempio, può essere difficile identificare la causa del CCV ispessimento del tessuto con l'età. Inoltre, è facile danneggiare larve in preparazione prima e durante l'iniezione pericardico, riducendo il numero sperimentali e aumentando la necessità di preparare un gran numero di larve.Inoltre, il danno fisico fatto per le larve durante la movimentazione e l'iniezione può causare falsi positivi come muscolo danneggiato può richiedere fino EBD. Per superare alcuni di questi ostacoli, abbiamo descritto una strategia di co-iniezione in questo articolo video che permette l'identificazione semplice e affidabile di larve con successo infusione colorante immediatamente dopo l'iniezione e prima della successiva analisi. La FITC-destrano controlli co-iniezione per iniezione di successo consentendo conferma dei DEB nel sistema vascolare prima del suo assorbimento da parte delle fibre muscolari. Questo può essere particolarmente utile come EBD fluorescenza diventa altamente diffuso in larve dopo alcune ore se non raccolti nelle fibre muscolari; come tale, può essere difficile da rilevare. Inoltre, manca il CCV e iniettando EBD nel tuorlo o corpo cavità può, dopo incubazione, comportare diffusa fluorescenza rossa simile a controllare gli embrioni, ma con la minore probabilità di assorbimento da fibre muscolari danneggiate. Collettivamente, questi grottaats suggeriscono iniezione EBD richiede pazienza e pratica al fine di ottenere risultati coerenti e affidabili.

In tutto, si descrive un metodo pratico e semplice per eseguire analisi EBD su larve di zebrafish. Ad oggi, l'uso di zebrafish come sistema modello, in particolare come un modello di malattia umana, è in rapida espansione. Questa espansione è in parte dovuto al continuo sviluppo e modifica di tecniche sperimentali che migliorano sugli attuali vantaggi del sistema zebrafish. La tecnica di iniezione EBD fornisce uno strumento aggiuntivo e potente per l'arsenale di un ricercatore per la validazione e lo studio di modelli di malattie muscolo zebrafish. L'attuazione in corso e la modifica di questa tecnica ha il potenziale per aiutare a scoprire nuove strategie terapeutiche, nonché i meccanismi che provocano la malattia.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno interessi finanziari in competizione o altri conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Trent Waugh per la sua assistenza tecnica. Riconosciamo inoltre il Dipartimento di Pediatria presso l'Hospital for Sick Children e cura distrofia muscolare congenita (CMD) per il loro generoso finanziamento per questo progetto.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fluoresceina isotiocianato-destrano MW 10.000SigmaFD10S
Evan's Blue DyeSigmaE2129
Etile 3-amminobenzoato metanosolfonato saleSigmaA5040
100 mm Piastra di PetriFischerbrandFB0875712Base per stampo ad iniezione
Capillari in vetro a parete sottileWorld Precision InstrumentsTW100F-4Per ago per iniezione
AgarosioBioshopAGA001Stampo ad iniezione
Stampo a microiniezioneAdaptive Science ToolsTU-1Stampo ad iniezione
Cloruro di sodioBioshopSOD001Soluzione di Ringer
Cloruro di potassioBioshopPOC888Soluzione di
Ringer Cloruro di magnesio esaidratoSigmaM2670Soluzione di Ringer
Sodio fosfato monobasico monoidratoSigmaS9638Soluzione di Ringer
HEPESSigmaH4034Soluzione di Ringer
GlucosioBioBasicGB0219Soluzione di Ringer
Cloruro di calcioSigmaC1061Soluzione di Ringer

References

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