A pesquisa translacional do câncer depende da extração de tecidos humanos. Muito trabalho foi feito para otimizar os métodos de extração para análise ex vivo. Aqui, descrevemos os métodos de processamento de tecidos que permitem a saída máxima de dados de amostras limitadas.
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Artigo de método
Trabalhando com tecidos humanos para Translational Cancer Research
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A pesquisa médica para benefício humano é muito prejudicada pela necessidade de tecidos e sujeitos humanos. No entanto, ao obter o consentimento para amostras humanas, amostras preciosas devem ser manuseadas com o maior cuidado, a fim de garantir a integridade dos órgãos, tecidos e células ao mais alto grau. Infelizmente, o processamento de tecidos, por definição, requer a extração de tecidos do hospedeiro, uma mudança que pode causar grande estresse celular e ter grandes repercussões nas análises subsequentes. Essas tensões podem fazer com que a amostra não seja mais representativa do local de onde foi recuperada. Portanto, um protocolo rigoroso deve ser respeitado durante o processamento dessas amostras para garantir a representatividade. O(s) ensaio(s) desejado(s) também deve(m) ser considerado(s) para garantir que uma técnica ideal seja usada para o processamento da amostra. Aqui está descrito um protocolo para recuperação, processamento e várias análises de tecidos que podem ser realizados em tecidos processados, a fim de maximizar a produção a jusante a partir de amostras limitadas de tecidos.
Introdução
A investigação médica tem beneficiado imensamente com o estudo de ambas as linhas de células humanas e modelos animais. As linhas celulares que permitam um melhor controlo dos componentes de um sistema, bem como a utilização de células a partir do próprio organismo. Trabalhando com células humanas, enquanto mais representativo, apresenta um instantâneo simplificado drasticamente de mecanismos que podem ser responsáveis pela saúde e doença, porque as linhas celulares podem não recapitular o impacto de outras células do estroma, componentes e órgãos que podem afectar as respostas 1. Por outro lado, os modelos animais, embora não totalmente precisos em repr....
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Protocolo
Declaração de ética: Este protocolo é aprovado pela University of Texas MD Anderson Cancer Center.
1. Espécime Procurement
- Coletar amostras de tecido de tumor pesquisa excesso e tecido normal relacionada 10-12. Conservar as amostras em gelo triturado, para evitar autólise.
- Enviar todos os tecidos, dispositivos médicos e corpos estranhos removidas durante um procedimento cirúrgico para o Departamento de Patologia para exame necessário, a fim de facilitar um diagnóstico patológico.
- Lidar com tecido alocados para a pesquisa de acordo com a investigação e as políticas aplicáveis e os procedimentos bancários tecido.
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Resultados
Os resultados apresentados abaixo mostram o fluxo de estratégia de citometria de gating para ampla fenotipagem imune em um tumor melanoma processado. O dia da coloração, amostra de tecido foi digerido com colagenase e homogeneizada I e ADNase I de incubação durante 60 min, a 37 ° C sob rotação 225 rpm. Após a digestão, a suspensão de células foi filtrada através de um filtro de células de 70 um para eliminar os detritos e as células foram coradas com fluxo marcado com fluorescência citometria de anticorpos para fe.......
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Discussão
Em última análise, os métodos de processamento deve ser ditada pela hipótese desejado e antecipado ensaios técnicos para ser executada (Figura 1). A secção que se segue serve como uma visão geral para descrever os ensaios potenciais que podem ser executadas em tais secções de tecido. É de nenhuma maneira uma visão geral exaustiva, mas destina-se a ajudar a orientar os métodos de processamento de amostras e escolha de ensaios a jusante, descrevendo técnicas e listando seus pontos fortes e fracos.
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelas contribuições filantrópicas da John G. e Maria Stella Kenedy Memorial Foundation (Grant # 0727033) ea Research Alliance Melanoma. Os autores gostariam de agradecer à Universidade de Tissue Texas MD Anderson Cancer Center Institucional Bank (ITB) para coordenar a distribuição de tecidos e recolha e facilitar a investigação translacional, bem como Dr. Ignacio Wistuba, Dr. Victor Prieto, o Departamento de MD Anderson Cancer Center Patologia e do Programa de Melanoma do chute Lua. Por fim, os autores gostariam de agradecer todos os pacientes e famílias afetadas por melanoma.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agulhas | BD | 305167 | |
| Bisturis descartáveis de aço inoxidável | Miltex | 4-410 | |
| Placa de cultura de tecidos | de biópsia Corning 353003 | ||
| Thermo Fisher | 58931 | ||
| Solução estabilizadora de RNA | Ambion | AM7021 | |
| 1,5 ml Eppendorf tubos | Phenix | MAX-815 | |
| Tubos de 50 ml | Corning | 430290 | |
| 10% Neutro Tamponado Formalina | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Recipientes de Formalina | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Solução de temperatura de corte ideal (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I Roche | 11088793001 | ||
| 70μ filtros de células m | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 placas de fundo redondas de 96 poços | Corning | 3799 | |
| Solução de coloração viva/morta | Life Technologies | L34957 |
Referências
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Cell Biology. Fixing problems with cell lines. Science. 346, 1452-1453 (2014).
- van der Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies. , PLoS Med. 7, e1000245 (2010).
- McCabe, P. M., et al.
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Reimpressões e permissões
