Abstract
Encefalopathie bij prematuren (EoP) is een term die het centrale zenuwstelsel (CNS) omvat afwijkingen geassocieerd met vroeggeboorte. Om zo goed mogelijk vooraf translationeel doelstellingen en ontdekken van nieuwe therapeutische strategieën voor hersenletsel geassocieerd met vroeggeboorte, moet preklinische modellen van EoP soortgelijke mechanismen omvatten van prenatale algemene schade waargenomen bij mensen en meerdere onderdelen van de maternale-foetale placenta-systeem te betrekken. Idealiter modellen eenzelfde spectrum van functionele tekorten produceren de volwassen dieren en herhalen meerdere aspecten van de pathofysiologie. Menselijke systemische placenta perfusiedefecten, placenta onderperfusie en / of chorioamnionitis geassocieerd met pathogeen-geïnduceerde ontsteking in het begin van vroeggeboorte na te bootsen, ontwikkelden we een model van prenatale voorbijgaande systemische hypoxie-ischemie (Tshi) in combinatie met intra-vruchtwater lipopolysaccharide (LPS). Bij zwangere Sprague Dawley ratten, Tshi via de baarmoeder slagader occlusie on embryonale dag 18 (E18) induceert een gegradeerde placenta onderperfusie defect geassocieerd met toenemende CNS-letsel bij de foetus. In combinatie met intra-vruchtwater LPS injecties, wordt de placenta ontsteking verhoogd en CNS-letsel wordt verergerd met bijbehorende witte stof, gang en imaging afwijkingen. Prenatale Tshi en Tshi + LPS prenatale beledigingen voldoen aan een aantal van de criteria van een EoP model inclusief indient de intra-uteriene belediging, waardoor het verlies van neuronen, oligodendrocyten en axonen, verlies van subplate en functionele tekorten in volwassen dieren die die waargenomen bij kinderen zeer geboren na te bootsen premature. Bovendien is dit model staat voor de dissectie van de ontsteking veroorzaakt door uiteenlopende soorten letsel.
Introduction
Met meer dan 12% van de baby's geboren in de Verenigde Staten vóór 37 weken zwangerschapsduur schatting 1, perinatale hersenletsel (PBI) van prematuriteit is een belangrijke oorzaak van blijvende invaliditeit. PBI van prematuriteit, ook wel encefalopathie van prematuriteit (EoP), beïnvloedt het gehele centrale zenuwstelsel (CNS). CNS schade begint vaak in utero, en wordt verergerd door prenatale processen waaronder chorioamnionitis en postnatale complicaties zoals hypoxie en sepsis. PBI van systemische beledigingen verandert neurodevelopment en leidt tot een hersenverlamming, epilepsie, cognitieve vertraging en tal van neuropsychiatrische aandoeningen die emotionele regulering, geheugen en uitvoerende functie 1,2. Hoewel er veel vooruitgang is geboekt, blijft een beperkt begrip van de manier waarop de cellulaire en moleculaire consequenties van CNS-letsel door vroeggeboorte te vertalen naar de veelheid van neurologische gevolgen bij kinderen die te vroeg geboren. Dit gebrek aan kennis achterpoteners real-time diagnose van CNS letsel ernst en de hoogte doseren van nieuwe interventies. Bovendien, aangepast aan de leeftijd therapeutische strategieën voor deze kwetsbare patiëntengroep blijft ongrijpbaar.
Intra-uteriene ontsteking is heel gebruikelijk in extreme vroeggeboorte en het gaat om een complexe foetale-maternale-placenta inflammatoire 3 cascade. Intra-uteriene infectie is vaak subklinisch. Specifieke placenta bevindingen consistent met acute ontsteking, of histologische chorioamnionitis, zijn belangrijke determinanten van de foetale inflammatoire respons en zijn samenvalt met hersenletsel geassocieerd met vroeggeboorte 3-5. Inderdaad, de foetale ontstekingsreactie heeft verschillende klinische implicaties voor de lange termijn resultaten van vroeggeboorte. Zuigelingen die zijn klein voor de zwangerschapsduur (SGA), of die ervaring infectie zijn buitengewoon kwetsbaar voor neurologische tekorten 3,4. Chorioamnionitis is een typische pathologische diagnose na vroeggeboorte
Menselijke systemische perfusie placenta gebreken en chorioamnionitis geassocieerd met pathogeen-geïnduceerde ontsteking nabootsen, ontwikkelden we een model van prenatale voorbijgaande systemische hypoxie-ischemie (Tshi) in combinatie met intra-vruchtwater lipopolysaccharide (LPS) bij ratten. Ons doel was om ons model van Tshi passen alleen bij ratten 12-16 tot intra-uteriene ontstekingen omvatten,preklinische modellen van CNS-letsel geassocieerd met vroeggeboorte vergemakkelijken. Tshi heeft alleen aanhoudende verlies van oligodendrogliale lineage cellen, corticale neuronen geopenbaard, toegenomen celdood, en verhoogde pro-inflammatoire cytokine niveaus, met progressieve ischemische intervallen leidt tot een gesorteerde patroon van de verwondingen in overeenstemming met prenatale hersenletsel 16. Wijzigingen aan het ischemische onderdelen van dit model hebben ook aangetoond tekorten in het geheugen coderen, korte en lange termijngeheugen en milde musculoskeletale veranderingen in ratten 17-19 ze ouder worden. Inderdaad hebben we eerder aangetoond dat de combinatie van tshi + LPS recapituleert de pathofysiologische kenmerken van EoP, zoals oligodendrocyt en neuronaal verlies, axonale verwonding, ontsteking en cellulaire functionele abnormaliteiten 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutionele Care en gebruik Commissies bij zowel Boston Children's Hospital en de Universiteit van New Mexico Health Sciences Center goedgekeurd alle experimentele procedures.
LET OP: Voor aanvang van de procedure, seal, steriliseren en autoclaaf alle chirurgische instrumenten en chirurgische gordijnen. Daarnaast bereidt postoperatieve medicatie in steriele flesjes inbegrip 0,125% bipivucaine en 0,1 mg / kg buprenorfine. Ook de voorbereiding van de lipopolysaccharide (LPS) oplossing steriel: 0,04 mg / ml LPS (0111: B4) in steriele zoutoplossing die verdunde blauwe kleurstof Evan's.
1. Anesthesie
- Induceren anesthesie in een embryonale dag 18 (E18) zwangere Sprague Dawley ratten met een mengsel van 3% isofluraan evenwicht 70% stikstof en 30% zuurstof.
- Verwijder rat uit de inductie kamer en plaats de rat liggende op gedrapeerd chirurgische circulerende water deken ingesteld op 37 ° C. Transfer anesthesie neuskegel en vermindering isoflurane niveau 2%.
- Voorzichtig toe te passen oogzalf om elk oog om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen. Tijdens de procedure voortdurend toezicht op de temperatuur, ademhaling en de hartslag van het dier. Moederlijke fysiologie dient gedurende de hele procedure stabiel blijven.
2. Chirurgische Prep en Scrub
- Met behulp van kleine dieren tondeuse verwijder alle haren in de onderbuik. Scheren in een rechthoekig patroon met zorg om te voorkomen inkeping de tepels of genereren scheermes uitslag die kunnen worden irriterend voor toekomstige verpleging levend geboren pups.
- Bereid buikhuid door afwisselende toepassing van povidonjood en 70% ethanol scrub met steriele wattenstaafjes. Herhaal de scrub zodanig dat povidonjood en 70% ethanol zijn elk toegepast 3x afwisselend mode. Laten drogen.
- Bevestigt de diepte van de anesthesie via afwezigheid van teen-snuifje reflex. Bij afwezigheid van reflex en stimuli om pijn te verminderen isofluraan niveau 1%.
- Met behulp van steriele chirurgische handdoeken,draperen het dier. Zorg ervoor dat de gordijnen te plaatsen onder een geschikte hoek zodanig dat de hoeveelheid spoelvloeistof absorberen terwijl niet belemmeren bloedtoevoer naar de baarmoederhoornen maximaliseren.
3. Abdominale Laparotomie
- Met behulp van een scalpel een 3 cm middellijn incisie in de voorbereide buikhuid. Botweg ontleden de huidlaag van de abdominale fascia met een schaar. Met behulp van een tang en chirurgische schaar, verheffen de abdominale fascial laag en een insnijding van de avasculaire linea alba toegang tot de buikholte krijgen.
- Plaats chirurgische gaas aan de buitenkant van de incisie en bevochtigen met steriele zoutoplossing. Met behulp van stompe pincet en externe druk op de buik, verwijder voorzichtig de baarmoederhoorns van de buikholte en leg de bevochtigde gaas.
- Vermijd zorgvuldig verstrengeling en contact met de darmen. Schik foetussen met behulp van een tang door contact alleen het spierweefsel in tussen individuele vruchtwater zakken.Bloot te leggen en te isoleren van de 4 baarmoeder slagaders met stompe dissectie.
OPMERKING: Zorg moet worden genomen om de baarmoeder slagaders ontleden. Omliggende weefsel en de schepen zelf zijn zeer kwetsbaar. Schade aan de moeder schepen kan veroorzaken bloeden, en in ernstige gevallen, foetale en maternale sterfte.
4. Plaatsing van aneurysmaclips
- Plaats een rat 30 G aneurysmaclip op elke baarmoeder slagader. Zorgen voor stopzetting van de bloedstroom, waaronder proximale en distale pulsen, en verduistering van de baarmoeder schepen met inbegrip van individuele placenta. Bedek de blootgestelde hoorns en volledige chirurgische veld met gaas en spoelen met een steriele zoutoplossing. Zorg ervoor dat het gebied vochtig met irrigatie ongeveer om de 10 minuten te houden.
- Na 60 minuten, verwijder het gaas en irrigeren het veld. Zorg ervoor dat de baarmoeder horens en schepen afdoende worden bevochtigd voor een succesvolle clip verwijderen. Verwijder voorzichtig elke aneurysmaclip behulp van een tang. Zorg dat er geen trauma aan het schip, en maint veroorzakenain weefsel integriteit tijdens het verwijderen.
- Grondig irrigeren de baarmoederhoorns en in het veld, zorg ervoor dat elke verdwaalde draden van gaas te verwijderen uit het vruchtwater zakken.
5. Injectie van Lipopolysaccharide om Vruchtwater Sacs
- Aan de basis van elke afzonderlijke vliezen, anterieure de placenta plaat injecteer 100 gl LPS (4 ug / sac) met blauwe kleurstof verdund Evan in het vruchtwater. Gebruik botte tang te stabiliseren en te roteren elk vruchtzak in een optimale positie voor injectie. Blauwe kleurstof verdunde Evan's is een contrastmiddel dat is nuttig bij de bevestiging van de juiste plaatsing van de spuit en injectie.
OPMERKING: Gebruik alleen een ultrafijne 0,3 ml insulinespuit met aangehechte 8 mm 31 G naald voor de intra-vruchtwater injecties. Het gebruik dikkere naalden leiden tot chronische vruchtwater verlies foetale sterfte en reabsorptie van de zwangerschap. Kleine hoeveelheden vruchtwater lekkage na verwijdering van de spuit kan worden mitigated door directe druk op de vruchtzak. Sommige foetussen rat kan een zekere mate van oligohydramnios tolereren. Echter, acute vruchtwater verlies uit punctie met grote naalden, of toevallige punctie gevolg chronische lekkage, resulteert in verlies van de foetus en in ernstige gevallen, verlies van naburige zwangerschappen. - Irrigeren de baarmoederhoorns 3x met een steriele zoutoplossing.
6. Het sluiten van de Laparotomie
- Met behulp van een tang voorzichtig de baarmoederhoorns terug naar de peritoneale holte. Zorgen voor voldoende ruimte tussen de vruchtwater zakken en de middellijn incisie, opnieuw benaderen de musculofascial laag randen met behulp van een lopende 3-0 zijden hechtdraad. Wees je bewust van de plaatsing van het vruchtwater zakken, terwijl het sluiten van de spier incisie. Wees voorzichtig om niet te hechten in of door een weg.
- Opnieuw benaderen van de huidlaag, met behulp van een lopende 3-0 zijden hechtdraad, het sluiten van de huidlaag.
OPMERKING: De laparotomie moeten twee lagen doorlopende hechtingen te laten sluitenvoor de huid en spieren expansie met toenemende dracht. Continue hechtingen zorgen voor gelijkmatig verdeeld wond spanning. Onderbroken hechtingen minder gewenst als meervoudige knopen zijn irriterend en kan gemakkelijk worden gekauwd door de rat op het herstellen van de anesthesie. Chirurgische nietjes zijn niet gewenst. Staarten van de chirurgische knopen moeten worden gesneden zeer kort (<3 mm). - Injecteer 1 ml van 0,125% bupivacaïne subcutaan rond wond randen met behulp van een 26 G naald. Dien één dosis van 0,1 mg / kg subcutaan buprenorfine bij de nek.
- Schakel isofluraan en handdoek droog rat als dat nodig is. Plaats in schone kooi en monitor herstel van anesthesie. Zorgen rat niet onderkoeld worden.
7. postoperatief herstel en Zorg
- Bewaken van de rat elke 8-12 uur voor 72 uur en daarna dagelijks tot pups worden geboren (ongeveer E22 of E23). Dien extra doses van buprenorfine q8-12 uur / 72 uur of prn zoals gedicteerd door de IACUC.
- Monitor ratten tekenen van pijn, ongemak, vaginaal bloeden of bloeden van de operatieplaats. Controleer de hechtingen en incisie en zorg om ervoor te zorgen rat is niet kauwen of voortijdig verwijderen van hun hechtingen. Hoewel uitzonderlijk zeldzaam, ratten die hun hechtingen in gevaar lopen het risico voor wonddehiscentie.
LET OP: soms ratten kunnen grote hoeveelheden beddengoed of non-food items innemen, genaamd pica, als een neveneffect van buprenorfine bestuur. Hoewel zeer ongewoon, moeten ratten worden gecontroleerd op pica en potentiële daaropvolgende darmobstructie.
8. Weefsel Verwerking en cryosectioning
- Voor te bereiden op Hematoxyline & eosine (H & E) kleuring van de postnatale hersenen, verwijder pups van hun huis kooi op postnatale dag 2 (P2). Met behulp van chirurgische schaar onthoofden pups rat en verwijder voorzichtig de hersenen uit de schedel.
- Drop fix hersenen in een 15 ml conische buis met 7 ml van 4% paraformaldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing(PBS). Plaats hersenen bij 4 ° C en vast te stellen voor 72 uur.
- Na 72 uur, overbrengen hersenen een steriele PBS-oplossing bevattende 30% sucrose (w / v) en opnieuw 4 ° C.
OPMERKING: Zodra de hersenen laten vallen in de sucrose oplossing zijn ze klaar om te worden gesegmenteerd op een cryostaat. - Snel hersenen bevriezen en monteren op cryostaat stamper voor de aankoop van bevroren coronale secties. Snijd 20 urn bevroren coronale secties en monteren op dia's. Zorgen secties serieel verzameld.
- Laat slides drogen bij kamertemperatuur. WINKEL glijdt bij -20 ° C.
9. hematoxyline & eosine kleuring
- Neem dia gemonteerd ingevroren secties en warm tot kamertemperatuur.
OPMERKING: Bereid alle oplossingen vers. - Plaats de glaasjes op een dia warmer set tot 50 ° C gedurende 2 uur.
- Transfer schuift een kleuring rek. Dip glijdt 10x in dubbel gedestilleerd gedemineraliseerd water (DDH 2 O).
- Incubeer dia's in 100% hematoxyline gedurende 5 min. Time hematoxyline kan worden geoptimaliseerd afhankelijk van de mate van paarse kleuring.
- Dip slides 4x in leidingwater H 2 O, en laat het staan in schoon leidingwater H 2 O gedurende 1 min.
- Dipslides 15x in zure alcohol (250 ml 70% ethanol + 1 ml geconcentreerd chloorwaterstofzuur).
- Dip slides 4x in leidingwater H 2 O, en laat het staan in schoon leidingwater H 2 O gedurende 1 min.
- Incubeer in 1% lithiumcarbonaat gedurende 2 min.
- Dip slides 4x in leidingwater H 2 O, en laat het staan in schoon leidingwater H 2 O gedurende 1 min.
- Incubeer in 95% ethanol gedurende 1 minuut.
- Dip slides 7x in 100% Eosine. Aantal dips in eosine kan worden aangepast afhankelijk van de mate van roze vlekken.
- Dip slides 5x in 95% ethanol.
- Dip dia 5x in een frisse verandering van 95% ethanol.
- Incubeer dia's in 100% ethanol gedurende 1 minuut.
- Incubeer dia's in een nieuwe wijziging van 100% ethanol gedurende 1 minuut.
- Incubeer dia's in 100% xyleen gedurende 15 min.
OPMERKING: Xyleen stappen enafdekken moet gebeuren in een zuurkast. - Incubeer dia's in verse veranderingen van xyleen gedurende 15 min.
- Dekglaasje met Permount en laten drogen in de zuurkast.
- Beeld schuift met een lichtmicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na tshi + LPS op E18, hematoxyline en eosine kleuring onthult significante histopathologische afwijkingen in zowel de placenta (figuur 1) en in de hersenen (figuur 2). Placenta op E19 en E21 onderzocht zijn schromelijk oedemateus met micro-bloeding en necrose in de hele decidua en labyrint. Significante inflammatoire infiltraat en verhoogde vasculariteit wordt ook waargenomen. Brains op P2 onderzocht onthullen ventriculomegaly, evenals de witte stof en subplaat neuron verlies in vergelijking met Shams. Eerder hebben we gemeld dat Tshi + LPS induceert ontsteking en levert aanhoudende witte stof en axonale afwijkingen gelijktijdig met significante motorische stoornissen bij jongvolwassenen 20. Tshi + LPS ook aanzienlijk vermindert kaliumchloride co-transporter 2 (KCC2) eiwitexpressie een chloride co-transporter centraal bij de ontwikkeling van γ-aminoboterzuur (GABA) erge remming, in de cortex bij P15 (figuur 3 13.
Figuur 1:. Tshi + LPS induceert significante histologische abnormaliteiten in de placenta Na voorbijgaande utero hypoxie-ischemie en intra-amniotische LPS toediening op embryonale dag 18 (E18), placenta van E19 tshi + LPS foetussen (B) zijn grove oedemateus met bloeding (pijlen), necrose en verhoogde ontstekingsinfiltraat in vergelijking met placebo (A, schaal bar = 100 pm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Tshi + LPS induceert significante histologische afwijkingen in de hersenen Na voorbijgaande utero hypoxie-ischemie en intra-amniotische LPS toediening op embryonale dag 18 (E18), postnatale ventriculomegaly, onderplaat neuron en verlies witte stof wordt waargenomen bij pups onderworpen aan dual Tshi + LPS (B) in vergelijking met placebo (A) acuut op P2. (Schaal bar = 100 micrometer; Sp = subplate; WM = witte stof; LV = laterale ventrikel) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Tshi + LPS vermindert KCC2 uitdrukking Western blots uitgevoerd vanaf mem.braan preparaten van micro-ontleed corticale weefsel getoond in utero voorbijgaande systemische hypoxie-ischemie en intra-amniotische LPS toediening op embryonale dag 18 (E18) vermindert expressie van KCC2, een neuron-specifieke kaliumchloride co-transporter centraal bij de ontwikkeling van geïntegreerde schakelingen en cerebrale inhibitie op postnatale dag 15 (n = 6-10, gemiddelde ± SEM, t-toets, * P <0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Encefalopathie bij prematuren is moeilijk te modelleren bij dieren als gevolg van de complexe interactie van de etiologie, neurologische tijdsverloop, ingewikkeldheid van cerebrale vorming van menselijk netwerk, overlappende mechanismen van de schade en de diverse fenotypes van CNS beledigt manifesteren in de mens te vroeg geboren baby. EoP is geassocieerd met specifieke celtype kwetsbaarheden (dwz onvolwassen oligodendrocyten) 21, alsmede diverse ontwikkelingsgebied geregelde trajecten (dwz aansluitplaat, membraan transporters en receptorsubeenheden) 12,13,22. Echter, kan aanzienlijke vooruitgang worden geboekt bij diermodellen repliceren de menselijke conditie zo goed mogelijk. Hier hebben we een model ontwikkeld van een prenatale belediging dat de heterogeniteit van de mechanismen van CNS-letsel waargenomen in de vroeggeborenen bevat, waardoor voor latere evaluatie van zowel de grijze en witte schade en herstel materie. Bij de mens, oplopend bacteriële infecties verzwakken de amnion en precipitate langdurig gebroken vliezen. Daarnaast placenta perfusiedefecten benadrukken de interface placenta en verstoren placenta homeostase. Zo placenta onderperfusie verbindingen CNS letsel door een intra-uteriene infectie. Ontegenzeggelijk is het een uitdaging om het model van de gemeenschappelijke klinische scenario van oplopende bacteriële infecties die chorioamnionitis voorafgaan bij knaagdieren als ze een duplex baarmoeder. Elke baarmoeder hoorn heeft zijn eigen cervix en meerlingzwangerschappen zijn uitgevoerd in een keer. Ondanks deze uitdagingen, hebben preklinische modellen aangepast aan meerdere onderdelen van de maternale-foetale placenta-eenheid te betrekken en op te nemen in de baarmoeder ontsteking in verschillende mate. Hoewel er geen individuele preklinisch model is ideaal voor elke specifieke hypothese te testen, de hierin beschreven model bevat de cellulaire en moleculaire afwijkingen, gedrags- en functionele beperkingen, de moeder-foetale placenta-systeem, en de intra-uteriene infectie en placenta ontsteking component gebruikelijk om zo many vroeg geborenen 20,23.
De keuze van de soort gebruikt voor het modelleren EoP invloed op de interpretatie van experimentele gegevens in het kader van de inherente beperkingen die uitgaat van de soort. In de eenvoudigste termen, is de geboorte niet gelijk aan gelijkaardige punten van CNS ontwikkeling in alle dieren 24. De hier beschreven model kan worden uitgevoerd in zowel zwangere muizen en ratten, hoewel neonatale sterfte bij muizen significant verlaagd in onervaren of gestrest dammen. In overeenstemming met onze eerdere rapporten, verlies van de foetus bij ratten bij de geboorte (P0) wordt verhoogd in Tshi + LPS dieren (ongeveer 40%) in vergelijking met placebo, LPS en Tshi alleen, maar overlevende pups geen significante verschillen in gewicht vertonen door middel van P28 20. Soortgelijke verschillen tussen soorten, het tijdstip van verwonding tijdens de dracht een cruciale rol in de neurologische traject van het nageslacht. De spatiotemporele regeling van neurale cel ontwikkelingsstadia van proliferatie, migratie en differentiation verschilt tussen de verschillende zoogdieren 24-26. Deze cel-specifieke ontwikkelingsprogramma's invloed op de kwetsbaarheid voor letsel. Bijvoorbeeld, de overlap van de timing van oligodendrocyt lineage en GABAerge neuronale ontwikkeling met de timing van vroeggeboorte maakt deze cellen bijzonder gevoelig voor perinatale beledigingen 27-29. Aldus was dit model ontwikkeld in E18 ratten (en succesvol vertaald naar E17 muizen op een C57BL / 6 achtergrond) als deze timing komt overeen met de intra globale prenatale insult die in menselijke zuigelingen vóór zeer vroegtijdige geboorte bij 23-25 weken zwangerschap 20 . We eerder lieten O4-immunoreactieve onvolwassen oligodendrocyten worden het meest getroffen in dit stadium van ontwikkeling 16. Hun verlies correleert met verminderde overleving en rijping 14, waarbij de meest opmerkelijke verlaging O4 + en O1 + stadia van de lijn 16, in overeenstemming met eerdere rapporten door andere onderzoekers 30. Bovendien, Hebben we voortijdig verlies van de aansluitplaat, verminderde KCC2 uitdrukking, lagere drempel voor epileptische aanvallen en verstoorde gang 12,13,15 consistent met ontregelde GABAergic signalering in prematuren 31 aangetoond.
De hier beschreven model biedt tal van voordelen ten opzichte van vorige modellen bij knaagdieren gebruikt om perinatale hersenletsel van vroeggeboorte 23 bestuderen. Het omvat het hele systeem van de moeder-placenta-foetale en veroorzaakt zowel de hersenen en placenta letsel. We hebben eerder gepubliceerd vergelijkingen tussen sham, Tshi alleen LPS alleen en Tshi + LPS en verschillen in functionele resultaten en biochemie 20 en verschillen met gesorteerde Tshi 16. Terwijl eerdere onderzoeken van eenzijdige carotis ligeringen en systemische hypoxie in neonatale ratten mechanistisch inzicht hebben vergoten in talrijke pathofysiologische processen (dwz de gevoeligheid van onvolwassen oligodendrocyten ischemie), directe translationeel en klinisch RELEVAnvu voor dergelijke modellen is minder robuust. Naast de beschreven toepassingen kan de hier beschreven model informatieve hulpmiddel voor het onderzoek van andere orgaansystemen invloed van prematuriteit, zoals necrotiserende enterocolitis (NEC), hart, long, nier en hypothalamus-hypofyse-as dysfunctie. Vanwege de complexiteit van LPS farmacologie en verschillen in maternale en foetale farmacodynamiek, intraperitoneale LPS injecties in moederdieren minder waarschijnlijk dezelfde foetale ontstekingsreactie hier getoonde opleveren. Verder, LPS niet de placenta betrouwbaar 20,32 passeren. Eerder hebben we geprobeerd directe cervicale toepassing van LPS en intra-uteriene injectie vergelijkbaar met wat is beschreven in andere muismodellen 33. Echter, we vonden dat de sterfte en de inconsistentie van CNS letsel aanzienlijk tussen pups werd verhoogd binnen hetzelfde nest. Hier is de dosering van 4 ug / sac geoptimaliseerd met behulp dosis-respons experimenten. Toenemende doses LPS toegediend aan de amniotic compartiment resulteert in een verhoogde foetale sterfte. LPS heeft het voordeel boven directe infectie met typische intra gramnegatieve bacteriën, dat deze inflammatoire signalering door toll-like receptor 4 activeert zonder dat actieve bacteriële infectie en de bijbehorende risico van verspreiding pathogeen. Echter kan dit model worden aangepast om gemeenschappelijke ziektekiemen en organismen geïsoleerd uit menselijke placenta, inclusief groep B streptococcus, die abnormaliteiten placenta en neuropathologische oorzaken, en autistische-achtig gedrag bij ratten 34 omvatten. Op soortgelijke wijze kunnen meerdere Ureaplasma lipoproteïne-banded antigen Ureaplasma species infectie simuleren. Aangezien Ureaplasma is de meest voorkomende oorzaak van menselijke chorioamnionitis 35, kan dit ook een weg voor toekomstig onderzoek. Naarmate er meer geïnactiveerd-infectieuze middelen beschikbaar komen, zal het informatief zijn om te bepalen hoe ze differentieel invloed neurologische ontwikkeling en de effectiviteit van neuro-herstellende interventies.
Beperkingen van dit model zijn onder vruchtwater verlies uit de intra-vruchtwater injecties. Hoewel er geen effect wordt opgemerkt met intra-amniotische injecties van steriele zoutoplossing, de meter van de naald wordt gebruikt om de injecties te voeren is een cruciaal technisch element. Zorg moet worden genomen niet om naalden te gebruiken die groter zijn dan 31 G. chirurgische complicaties bij de moeder rat met betrekking tot de laparotomie zijn uiterst zeldzaam, waaronder wonddehiscentie, darmobstructie, peritonitis en volledig verlies van de zwangerschap, met moedersterfte minder dan 5%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs zijn dankbaar Dan Firl, Chris Corbett en Jesse Denson, PhD. De financiering werd verstrekt door de NIH NINDS R01 NS060765 naar SR, de P30 Cobre Pilot Programma om LJ en de Child Health Handtekening Programma om LJ aan de Universiteit van New Mexico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline Solution, 0.9% | Sigma | S8776 | |
| LPS 011B4 | Sigma | L2630 | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Surgical gloves | Biogel | 40870 | |
| OR Towels | Cardinal Health | 287000-008 | Sterile |
| PDI Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Mini Arco Rechargeable Clippers | Kent Scientific Corp. | CL8787 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Eye Lubricant | Refresh Lacri Lube | 00023-0312 | |
| Blunt Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Scissors | Roboz | RS-6808 | |
| Surgical Scissors | Roboz | RS-5880 | |
| Surgical Scissors | F.S.T. | 14002-16 | |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml |
| Needle | BD | 305122 | 25G 5/8 |
| Needle | BD | 305128 | 30G 1 |
| Cotton-tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | Small, 6 inch sterile |
| Cotton Gauze Sponge | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| Needle Holders | Kent Scientific Corp. | INS600109 | 12.5 CM STR |
| Vessel Clips | Kent Scientific Corp. | INS600120 | 30G Pressure |
| 3-0 Perma Hand Silk Sutures | Ethicon | 1684G | Black braided, 3-0 (2 metric), 18", non-absorbable, PS-1 24 mm needle, 3/8 circle |
| Insulin Syringes | BD | 328438 | 0.3 cc 3 mm 31G |
| Pentobarbital | |||
| Buprenorphine | |||
| Bupivacaine | |||
| Isoflurane | |||
| Lithium Carbonate | Acros Chemicals | 554-13-2 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Hematoxylin | Leica | 3801521 | Surgipath Gill II Hematoxylin |
| Eosin | Leica | 3801601 | Surgipath Eosin |
| Xylenes | Fisherbrand | X3S-4 | Histological Grade |
| Permount | Fisherbrand | SP15-100 | |
| Coverglass | Fisherbrand | 12-548-5P | Fisher Finest Premium Coverglass |
References
- Blencowe, H., et al. Preterm birth associated neurodevelopmental impairment estimates at regional and global levels for 2010. Pediatr Res. 74, Suppl 1. 17-34 (2013).
- Mwaniki, M. K., Atieno, M., Lawn, J. E., Newton, C. R. Long term neurodevelopmental outcomes after intrauterine and neonatal insults a systematic review. Lancet. 379, 445-452 (2012).
- Dammann, O., Leviton, A. Intermittent or sustained systemic inflammation and the preterm brain. Pediatr Res. 75, 376-380 (2014).
- Leviton, A., et al. Microbiologic and histologic characteristics of the extremely preterm infant's placenta predict white matter damage and later cerebral palsy. the ELGAN study Pediatr Res. 67, 95-101 (2010).
- Redline, R. W. Inflammatory responses in the placenta and umbilical cord. Semin Fetal Neonatal Med. 11, 296-301 (2006).
- Lee, J., et al. Chronic chorioamnionitis is the most common placental lesion in late preterm birth. Placenta. 34, 681-689 (2013).
- Lee, S. M., et al. Acute histologic chorioamnionitis is a risk factor for adverse neonatal outcome in late preterm birth after preterm premature rupture of membranes. PloS one. 8, e79941 (2013).
- Pappas, A., et al. Chorioamnionitis and early childhood outcomes among extremely low gestational age neonates. JAMA Peds. 168, 137-147 (2014).
- Gaillard, R., Arends, L. R., Steegers, E. A., Hofman, A., Jaddoe, V. W. Second and third trimester placental hemodynamics and the risks of pregnancy complications the Generation R Study. Am J Epidemiol. 177, 743-754 (2013).
- Trivedi, S., et al. Fetal placental inflammation but not adrenal activation is associated with extreme preterm delivery. Am J Obstet Gynecol. 206, 236 (2012).
- Yanowitz, T. D., et al. Hemodynamic disturbances in premature infants born after chorioamnionitis association with cord blood cytokine concentrations. Pediatr Res. 51, 310-316 (2002).
- Jantzie, L. L., Corbett, C. J., Firl, D. J., Robinson, S. Postnatal Erythropoietin Mitigates Impaired Cerebral Cortical Development Following Subplate Loss from Prenatal Hypoxia Ischemia. Cereb Cortex. , (2014).
- Jantzie, L. L., et al. Erythropoietin attenuates loss of potassium chloride co transporters following prenatal brain injury. Mol Cell Neurosci. 61, 152-162 (2014).
- Jantzie, L. L., Miller, R. H., Robinson, S. Erythropoietin signaling promotes oligodendrocyte development following prenatal systemic hypoxic ischemic brain injury. Pediatric Res. 74, 658-667 (2013).
- Mazur, M., Miller, R. H., Robinson, S. Postnatal erythropoietin treatment mitigates neural cell loss after systemic prenatal hypoxic ischemic injury. J Neurosurg Peds. 6, 206-221 (2010).
- Robinson, S., et al. Developmental changes induced by graded prenatal systemic hypoxic ischemic insults in rats. Neurobiol Dis. 18, 568-581 (2005).
- Delcour, M., et al. Neuroanatomical sensorimotor and cognitive deficits in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Brain Pathol. 22, 1-16 (2012).
- Delcour, M., et al. Impact of prenatal ischemia on behavior cognitive abilities and neuroanatomy in adult rats with white matter damage. Behav Brain Res. 232, 233-244 (2012).
- Delcour, M., et al. Mild musculoskeletal and locomotor alterations in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Intl J Devel Neurosci. 29, 593-607 (2011).
- Jantzie, L. L., et al. Complex pattern of interaction between in utero hypoxia ischemia and intra amniotic inflammation disrupts brain development and motor function. J Neuroinflam. 11, 131 (2014).
- Back, S., et al. Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia ischemia. J Neurosci. 22, 455-463 (2002).
- Jantzie, L. L., et al. Developmental Expression of N Methyl d Aspartate (NMDA) Receptor Subunits in Human White and Gray Matter Potential Mechanism of Increased Vulnerability in the Immature Brain. Cereb Cortex. 25, 482-495 (2015).
- Jantzie, L. L., Robinson, S. Preclinical Models of Encephalopathy of Prematurity. Devel Neurosci. , (2015).
- Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33, 7368-7383 (2013).
- Herlenius, E., Lagercrantz, H. Development of neurotransmitter systems during critical periods. Exper Neurol. 190, S8-S21 (2004).
- Kelsom, C., Lu, W. Development and specification of GABAergic cortical interneurons. Cell Biosci. 3, 19 (2013).
- Kinney, H., Back, S. Human oligodendroglial development Relationship to periventricualr leukomalacia. Semin Pediatr Neuro. 5, 180-189 (1998).
- Robinson, S., Li, Q., DeChant, A., Cohen, M. Neonatal loss of gamma amino butyric acid pathway expression after human perinatal brain injury. J Neurosurg Peds. 104, 396-408 (2006).
- Xu, G., et al. Late development of the GABAergic system in the human cerebral cortex and white matter. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 841-858 (2011).
- Segovia, K. N., et al. Arrested oligodendrocyte lineage maturation in chronic perinatal white matter injury. Ann Neurol. 63, 520-530 (2008).
- Robinson, S., Li, Q., Dechant, A., Cohen, M. L. Neonatal loss of gamma aminobutyric acid pathway expression after human perinatal brain injury. J Neurosurg. 104, 396-408 (2006).
- Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior a review of findings from animal models. Brain Behav Immun. 24, 881-897 (2010).
- Burd, I., Brown, A., Gonzalez, J. M., Chai, J., Elovitz, M. A. A mouse model of term chorioamnionitis unraveling causes of adverse neurological outcomes. Repro Sci. 18, 900-907 (2011).
- Bergeron, J. D., et al. White matter injury and autistic like behavior predominantly affecting male rat offspring exposed to group B streptococcal maternal inflammation. Devel Neurosci. 35, 504-515 (2013).
- Uchida, K., et al. Effects of Ureaplasma parvum lipoprotein multiple banded antigen on pregnancy outcome in mice. J Reprod Immunol. 100, 118-127 Forthcoming.
