عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية للإنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية الجهاز التنفسي القياسات

ملخص

هنا ، نقدم تعديلا لطريقة تم الإبلاغ عنها سابقا تسمح بعزل الميتوكوندريا عالية الجودة والنقية عن كميات أصغر من عضلات الهيكل العظمي للفأر. ينتج عن هذا الإجراء ميتوكوندريا شديدة الاقتران تتنفس بوظيفة عالية أثناء فحوصات ريسبيروميرك القائمة على الصفيحة الدقيقة.

الملخص

مختلة الميتوكوندريا العضلات والهيكل العظمي تلعب دورا في عملية التمثيل الغذائي تغير لاحظ مع الشيخوخة والبدانة ومرض السكري من النوع الثاني. المقايسات respirometric الميتوكوندريا من التحضيرات الميتوكوندريا المعزولة تسمح لتقييم وظيفة الميتوكوندريا، وكذلك تحديد آلية (ق) للعمل الأدوية والبروتينات التي تعدل الأيض. وغالبا ما تتطلب إجراءات العزلة الحالية كميات كبيرة من الأنسجة لانتاج الميتوكوندريا عالية الجودة اللازمة لفحوصات respirometric. الطرق الواردة في هذه الوثيقة تصف كيف عالية الجودة الميتوكوندريا المنقى (~ 450 ميكروغرام) يمكن عزله عن كميات ضئيلة (~ 75-100 ملغ) من الماوس العضلات والهيكل العظمي للاستخدام في قياسات الجهاز التنفسي إنتاجية عالية. توصلنا إلى أن طريقة عزلتنا ينتج 92.5 ± 2.0٪ الميتوكوندريا سليمة من خلال قياس النشاط سينسيز سترات طيفيا. بالإضافة إلى ذلك، أدى تحليل لطخة غربية في الميتوكوندريا المعزولة في التعبير خافت من cytosoالبروتين يسانس، GAPDH، والتعبير القوي للبروتين الميتوكوندريا، COXIV. عدم وجود الفرقة GAPDH بارزة في الميتوكوندريا المعزولة يدل على التلوث القليل من مصادر غير الميتوكوندريا أثناء إجراء العزل. الأهم من ذلك، وقياس معدل استهلاك _O 2 مع لوحة الصغيرة القائمة على التكنولوجيا وتحديد نسبة السيطرة التنفسية (RCR) لفحوصات respirometric المترابطة معارض البالغ الاقتران (RCR؛ <6 لجميع المقايسات) والميتوكوندريا وظيفية. في الختام، إضافة خطوة تنميق منفصلة وسمحت تخفيض كبير بالمواتير سرعة تجانس طريقة عنها سابقا عزلة جودة عالية والميتوكوندريا تنقيته من كميات صغيرة من الماوس العضلات والهيكل العظمي الذي ينتج في الميتوكوندريا بالإضافة جدا أن نتيجة التنفس مع وظيفة عالية خلال صفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometirc.

المقدمة

تتمثل الوظيفة الأساسية للميتوكوندريا في إنتاج ATP من الفسفرة المؤكسدة. ومع ذلك ، فإن الميتوكوندريا لها العديد من الوظائف الخلوية المهمة الأخرى بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر: إنتاج وإزالة السموم من أنواع الأكسجين التفاعلية ، وتنظيم الكالسيوم السيتوبلازمي والميتوكوندريا ، والاتجار بالعضيات ، والتوازن الأيوني ، والتورط في موت الخلايا المبرمج^1،2. لذلك ، ليس من المستغرب أن تلعب الميتوكوندريا المختلة دورا في العديد من أمراض الأمراض ، مثل الشيخوخة والأمراض التنكسية العصبية وأمراض القلب والأوعية الدموية والسرطان والسمنة والسكري^3،4. الأهم من ذلك ، أن الميتوكوندريا العضلية الهيكلية تشارك على وجه التحديد في العديد من هذه الأمراض^3-5.

....

البروتوكول

أجريت الدراسات على الحيوانات في إطار البروتوكول التي وافق عليها رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في معهد البوليتكنيك فرجينيا وجامعة ولاية.

1. إعداد (الوقت: ~ 45 دقيقة)

1. مخازن تجميد ذوبان الجليد من 0.25٪ التربسين، عزل عازلة للالميتوكوندريا (IBM) 1 وIBM2 في حمام مائي 37 ° C.
2. شطف الأواني الزجاجية وأدوات تشريح في الايثانول 70٪ تليها مياه عالية النقاء.
3. إعداد 0.05٪ محلول ال....

النتائج

يخدم النشاط سينسيز سترات كمقياس للسلامة الغشاء منذ سينسيز سترات يقع في غشاء الميتوكوندريا الداخلية، وبالتالي يجب أن لا تكون موجودة في تعليق الميتوكوندريا مع الأغشية سليمة الشكل 1 يمثل النشاط سينسيز سيترات في عينات غير sonicated الميتوكوندريا مقارنة مع sonicated عينات من نفس العزلة. Sonicating نتائج الميتوكوندريا في زيادة ذات دلالة إحصائية في النشاط سينسيز سترات (P <0.01). الأهم من ذلك، كانت 92.5 ± 2.0٪ من الميتوكوندريا سليمة بعد العزلة.

المناقشة

الطرق الواردة في هذه الوثيقة تقدم وصفا مفصلا لإجراء العزلة الميتوكوندريا من كميات ضئيلة (~ 75-100 ملغ) من الماوس العضلات والهيكل العظمي. هذا الإجراء العزلة هي قادرة على تسفر عن أداء عالية، الميتوكوندريا النقي (~ 450 ميكروغرام) كما يتضح من _O 2 معدلات الاستهلاك، والقيم RCR، أقصى النشاط سينسيز سترات وتعبير البروتين من immunoblotting. الأهم من ذلك، الميتوكوندريا المعزولة من هذا الإجراء يمكن أن تستخدم لفحوصات respirometirc متعددة مع صفيحة ميكروسكوبية أساس _O 2 تكنو.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
بشكل أساسي الدهون	سيجما ألدريتش	A6003	N / A
خالية من الأحماض - BSA
تريس / حمض الهيدروكلوريك	Promega	H5123	N / A
KCL	سيجما ألدريتش	P9541	N / A
تريس قاعدة	Promega	H5135	N / A
EDTA	سيجما ألدريتش	E6511	N / A
EGTA	سيجما ألدريتش	E4378	N / A
السكروز	سيجما ألدريتش	S7903	N / A
D-Mannitol	Sigma Aldrich	63559	N / A
Trypsin-EDTA (0.25٪) ، الفينول الأحمر	الحراري العلمي	25200-056	N / A
كلوريد الصوديوم بلورات بيضاء أو مسحوق بلوري & ge ؛ 99.0	فيشر Scientific	BP3581	N / A
كبريتات دوديسيل الصوديوم	Sigma Aldrich	L3771	غير متاح
ديوكسي كولات الصوديوم	سيجما ألدريتش	D6750	غير متاح
بولي أوكسي إيثيلين (12) نونيلفينيل الأثير ، متفرعة	سيجما ألدريتش	238651	N / A
شفرات حلاقة أحادية الحافة	فيشر Scientific	12-640	N / A
Falcon- 100 uM مصافي خلايا النايلون	فيشر Scientific	352360	N / A
وقف البروتياز & كوكتيل مثبط الفوسفات	Thermo Scientific	1861284	N / A
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل مع غطاء لولبي	Thermo Scientific	3474	N / A
حبات أكسيد الزركونيوم	فيشر Scientific	C9012112	N / A
الجسم المضاد GAPDH (1D4)	سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية	sc-59540	N / A
إشارات خلية الأجسام المضادة ل COXIV		4844s	أي بروتين غشاء داخلي للميتوكوندريا يكفي
حمار بيروكسيداز مترافق ، مضاد للأرانب IgG (H + L)	جاكسون ImmunoResearh	711-035-152	N / A
بيروكسيداز مترافق ماعز ، مضاد للفأر IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearh	115-001-003	N / A
Triton-X100	Sigma Aldrich	X100	N / A
Pierce BCA Protein Assay Kit   ;	Thermo Scientific	23225	N / A
حمض البيروفيك ، 98٪	Sigma Aldrich	107360	يخزن في 4 درجات ؛ C ، درجة الحموضة إلى 7.4 مع KOH قبل استخدامها في الفحص
حمض السكسينيك	Sigma Aldrich	S9512	يحفظ في درجة حرارة الغرفة ، درجة الحموضة إلى 7.4 مع KOH قبل استخدامه في الفحص
L (-) حمض الماليك ، BioXtra ، & ge ؛ 95٪	Sigma Aldrich	M6413	يحفظ في درجة حرارة الغرفة ، إلى 7.4 مع KOH قبل استخدامه في الفحص
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251	يحفظ في درجة حرارة الغرفة ، إلى 7.4 مع KOH قبل استخدامه في الفحص التنفسي ، إلى 7.4 مع KOH قبل استخدامه في الفحص
Palmitoyl L-carnitine chloride	Sigma Aldrich	P1645	يحفظ عند -20 درجة مئوية
Oligomycin A ، & ge 95٪ (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Store at -20 & deg ؛ C
Carbonyl cyanide 4- (ثلاثي فلوروميثوكسي)	Sigma Aldrich	C2920	يخزن في 2-8 درجة ؛ ج
فينيل هيدرازون
& جي ؛ 98٪ (TLC) ، مسحوق [FCCP]
Antimycin A من streptomyces sp.	متجر Sigma Aldrich	A8674	عند -20 درجة ؛ C
الأدينوزين 5 & prime ;-ثنائي الفوسفات أحادي البوتاسيوم الملح المجفف [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	يحفظ في -20 & درجة ؛ C ، إلى 7.4 مع KOH قبل استخدامه في الفحص
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	يحفظ في درجة حرارة الغرفة

٪ التنفسي التنفسي التنفسي التنفسي التنفسي