Summary
De immunmodulerende egenskaper av humane stamceller (MSC) synes stadig mer relevant for klinisk anvendelse. Ved hjelp av en co-kultur system av MSC og perifere blodleukocytter pre-farget med fluorescerende fargestoff karboksyfluorescein succinimidylester (CFSE), beskriver vi in vitro vurdering av MSC immunmodulering på effektor leukocytter spredning og spesifikke subpopulasjoner.
Introduction
Humane stamceller (MSC) er somatiske stamceller som kan differensiere til den paraksiale mesodermal linjer av ben, brusk, og fettvev 1-4, så vel som til et par extramesodermal linjene 5. Først isolert fra voksen benmarg, har disse multilineage stamfedre nå blitt funnet i en rekke vev 6-8 og uventet, vist seg å ha sterke immunmodulerende egenskaper som synes svært mottagelig for klinisk anvendelse 9-12. Detalj mekanismene som er involvert i immunmodulerende effekter er aktivt under etterforskning for effektiv anvendelse av spesifikke sykdoms enheter. En av de enkleste måtene å vurdere immunmodulering er ved å vurdere for undertrykkelse av effektor leukocytter spredning 13. De fleste effektorfunksjoner leukocytter som T-lymfocytter og monocytter sprer prodigiously når stimulert eller aktivert. Immunmodulerende funksjon kan vurderes når undertrykkelse avspredning er dokumentert.
Tradisjonelt har effektor leukocytt proliferasjon blitt evaluert ved påvisning av [3H] tymidin inkorporering i DNA. Imidlertid har denne metoden betydelige ulemper på grunn av bekymringer for stråling og etter bruk disposisjon, så vel som komplekset utstyr som er nødvendig. Mens det er ikke-radioaktive prøver for å vurdere celleproliferasjon, har karboksyfluorescein succinimidylester (CFSE) assay andre fordeler som muliggjør identifikasjon av spesifikke cellepopulasjoner, som er spesielt nyttig i ko-kultur-eksperimenter som involverer flere celletyper. CFSE er et fluorescerende fargestoff cellulær som kan vurderes ved strømningscytometrisk analyse. Som celler deler, er intensiteten av denne cellulære etiketten redusert proporsjonalt; Dette ikke bare muliggjør bestemmelse av den samlede cellevekst, men også gjør det mulig for vurdering av antall celledelinger opp til 8 avdelinger før fluorescensen blir vanskelig å DETect mot bakgrunnssignal. Videre er stabiliteten av den fluorescerende CFSE muliggjør in vivo sporing av merkede celler slik som celler kan visualiseres opptil flere måneder 14.
Denne analysen kan også bli variert for å vurdere bestemte typer effektor leukocytter eller immunmodulerende funksjon av spesifikke populasjoner av MSC-indusert immunmodulerende leukocytter, for eksempel interleukin-10 (IL-10) som produserer CD14 + monocytter 15 ved å utføre magnetiske kuler overflatemarkør utvalg cellepopulasjoner av interesse før eller etter ko-kultur etter behov. Vår protokollen beskriver den grunnleggende analyse for å vurdere immunmodulerende effekter av MSC på effektor-leukocytter (flytdiagrammet vist på figur 1), og en variant av denne grunnleggende analyse for vurdering av MSC-indusert leukocytt immunmodulering på allogene CD4 + effektor T-lymfocytter (Flytdiagrammet i figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det må innhentes pasienten informert samtykke som er godkjent av Institutional Review Board for bruk av humane celler.
1. Density Gradient Isolering av human perifere mononukleære blodceller (PBMC)
- Legg 25 ml hepariniserte helt blod inn i et 50 ml rør med en 25 ml pipette.
- Fortynn cellene med 25 ml fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Tilsett 15 ml Ficoll-Paque densitetsgradient inn i et nytt 50 ml rør, og samtidig vipping av røret, meget langsomt og tilsett forsiktig i 25 ml av den fortynnede cellesuspensjon over densitetsgradient, slik at det ikke er noen blanding av helblod med densitetsgradienten, det vil si., ingen forstyrrelse av blod-densitetsgradient-grensesnitt.
- Sentrifuger suspensjonen fra trinn 1.2 ved 400 x g i 30 til 40 min i et temperaturkontrollert-svingende spannrotor uten brems ved 20 ° C.
Merk: Tre distinkte lag skulle være klart etter sentrifugering: the øvre laget vesen plasma; bunn klart lag blir Ficoll-Paque tettshetsgradient; og en tynn, midt cellelag blir de PBMCer - Aspirer og kast det øvre laget ved suging med en Pasteur-pipette, med forsiktighet for ikke å forstyrre grenseflaten lag av mononukleære celler (det vil si, lymfocytter, monocytter og blodplater).
- Samle denne mononukleære cellelaget med en 10 ml pipette forsiktig i et nytt 50 ml sentrifugerør.
- Fyll røret med 20 ml PBS, bland godt og sentrifuger ved 300 x g i 10 minutter ved 20 ° C. Fjern supernatanten helt etter sentrifugering.
- Cellepelleten suspenderes i 20 ml PBS og sentrifuger ved 200 x g i 10 til 15 min ved 20 ° C. Fjern supernatanten helt etter sentrifugering.
Merk: Dette trinnet fjerner blodplater-som er uønsket-innenfor PBMCer; Dette trinnet kan bli gjentatt for å sikre fullstendig fjerning av blodplater. - Hvis ingen utvalg av spesifikke populasjoner erønsket, resuspender cellepelleten i leukocytt fullstendig medium (10% føtalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin og 1% penicillin / streptomycin i RPMI-1640 medium) for dyrking etter å ha utført et celletall 16 til å suspendere 1 ml av medium per 10 7 PBMC før du går videre til neste trinn.
2. Magnetic Merking av leukocyttpopulasjoner (Fortsett til TRINN 4 hvis ingen Valg av spesifikke populasjoner er påkrevd)
- Sentrifuger PBMC suspensjonen ved 300 x g i 10 min og supernatanten aspireres helt.
- Resuspender cellepelleten i 80 mL PBS per 10 7 totale celler.
- Tilsett 20 ul av spesifiserte magnetiske kuler (dvs. CD14 magnetiske kuler for isolering av monocytter, CD4 magnetiske kuler for isolering av T-lymfocytter) per 10 7 totale celler.
- Bland godt og inkuber i 15 min ved 2 til 8 ° C i kjøleskap.
- Legg 1-2 ml PBS per 10 7 celler til å vaske, og sentrifugerved 300 x g i 10 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender helt opp til 10 8 celler i 500 ul PBS.
3. Magnetic Valg av Leukocytt subpopulasjoner
Merk: En rekke magnetiske perle separatorer og kolonner er tilgjengelig for isolering av spesifikk populasjon av leukocytter ved celleoverflatemarkør fra en rekke produsenter. Isolasjon kan være av positiv utvelgelse basert på ett eller noen få positive markører eller ved negativ seleksjon etter nedbryting av uønskede populasjoner. En generell tilnærming til å utføre positiv seleksjon ved hjelp av en markør (dvs. CD4 for T-hjelpe lymfocytter, eller CD14 for monocytter) er angitt nedenfor.
- Forberede og prime magnetisk separator inkludert separasjonskolonne i henhold til produsentens instruksjoner.
- Anvende rør som inneholdt prøven av merkede PBMC. Gi to 15 ml sentrifugerør for innsamling av positivt merket og unlabeled cellefraksjoner, etter produsentens anvisninger.
- Telle celle nummer 15 og resuspender positivt selekterte leukocytter (dvs. CD4 + T-lymfocytter eller CD14 + -celler) i leukocytt komplett medium, ved bruk av 1 ml medium pr 10 7 celler.
4. CFSE Farging av Leukocytter for Vurdering av Proliferation
Merk: CFSE har vært mye brukt i immunologiske undersøkelser, både in vivo og in vitro studier. Vår protokollen er optimalisert for in vitro studie av MSC / PBMC (eller andre leukocytter) interaksjoner. Selv om den generelle fremgangsmåten som er involvert i å gjennomføre CFSE in vitro merking er like, kan det være forskjeller i spesifikk dose og tidspunkt for protokollen 14. Dette kan skyldes en rekke faktorer, dvs. den spesifikke celletype som brukes, celletall benyttet-som kan sannsynligvis påvirke intensiteten av CFSE fluorescerende signal.
5. Co-kulturen i MSC'er med Leukocytter og aktivering av leukocytter
- Pre-varm MSC fullstendig medium (10% FBS (testet for optimal vekst MSC), 1% L-glutamin og 1% penicillin / streptomycin i DMEM-medium lav glukose) til 37 ° C i ikke mer enn 30 min.
- Seed MSC på 50.000 celler i 1 ml av MSC komplett medium i 24-brønners plater (MSC tetthet: 25.000 celler / cm 2) for feste O / N i en 37 ° C inkubator, slik at for stamcellene for å nå 80% konfluens.
- Aspirer medium, og basert på seeded MSC tall, legge CFSE merkede PBMC (tidligere merket-henvises til protokollen Trinn 4 ovenfor) til kultur MSC (seeded forrige dag i 24-brønners plater) i 1 ml leukocytter komplett medium på en 01:10 (celle ratio) co-kultur forholdet mellom MSC til PBMC.
- Tilsett mitogenet fytohemagglutinin (PHA), en ikke-spesifikk leukocytt-aktivator, til en sluttkonsentrasjon på 10 ug / ml i et totalt volum på 1 ml leukocytt fullstendig medium per brønn.
- AlternativEly, for å stimulere for aktivering av T-lymfocytter som spesifikt: bruke a-CD3 / 28 mikroperler og legge til den to-cell co-kulturen for å oppnå en perle-til-T-lymfocytt-forhold på 1: 1.
- For negativ kontroll, plate 500000 PBMC / brønn (eller en bestemt effektor leukocytt-populasjon, celletetthet: 250000 leukocytter / cm 2) i en 24-brønns plate med en leukocytt ml fullstendig medium bare; for positiv kontroll, i tillegg til plettering av samme antall av PBMC / brønn, tilsett PHA til en sluttkonsentrasjon på 10 ug / ml.
- På den tredje og femte dagen av co-kultur eksperiment, vurdere spredning av CFSE-merkede leukocytter (plassert i runde-bunn rør) ved flowcytometrisk analyse 17 med 488 nm eksitasjon og emisjonsfiltre passende for fluorescein.
Note: Intracellulær cytokin farging for flowcytometrisk analyse kan også utføres på disse CFSE-merkede leukocytter på dette punktet for å vurdere for endringer i leukocytt cytokin ekspresjon profil som modulated av MSC. Siden CFSE evalueres med et filter egnet for fluorescein, antistoffene er valgt for å vurdere forskjellige cytokiner må være konjugert til andre enn fluorescein eller lignende spektrum fluorokromer (dvs., fykoerytrin, peridinin klorofyll-proteinkomplekset (PerCP)).
6. Variasjon: Effector Suppression analysen Magnetic Bead-valgt, MSC-indusert Immunmoduler Leukocytter på Aktivert CFSE merkede Effector CD4 + T celler
- Seed MSC på 250.000 celler i 3 ml av MSC komplett medium i 6-brønners plater (MSC tetthet: 25.000 celler / cm 2) for feste O / N i en 37 ° C inkubator, slik at for stamcellene for å nå 80% konfluens. Minst 3 til 6-brønns plater er nødvendig for å sikre tilstrekkelig MSC-cocultured PBMC for subpopulasjon valg.
- Aspirer medium, og legge PBMCer skilt som per trinn 1, men i seks-brønns plater på 2,5 x 10 6 celler / brønn (celletetthet: 250.000 leukocytes / cm 2) med 3 ml av leukocytt komplett medium. Co-kultur i 48-72 timer i en 37 ° C inkubator.
- Magnetiske kuler-velge bestemt populasjon av MSC-induserte immunmoduler leukocytter (dvs. CD14 + celler) som per §§ 2-3.
Merknader: Intracellulær cytokin farging for flowcytometrisk analyse kan bli utført ved dette punktet for å vurdere endringer i leukocytt cytokin ekspresjon profil, dvs. ekspresjon av interleukin-10-som moduleres av MSC. - Legg CFSE-merkede allogene CD4 + T-celler ble generert i henhold til avsnitt 2-4 i 24-brønners plater i en ml av leukocytt komplett medium (T-celle-densitet: 250.000 celler / cm 2) i kule-valgte MSC-induserte leukocytter i forskjellige forhold , det vil si, 1:10, 1: 5, 1: 2 og 1: 1 (celle til celle) forholdstall.
- For å stimulere CD4 + T-celler, tilsett a-CD3 / 28 konjugerte mikrokuler for å få en kule-til-celle-forhold på 1: 1.
- For en negativ kontroll, plate 500000 CD4 + T-celler / brønn i en 24-brønns plate (T-celle-densitet: 250.000 celler / cm 2) med 1 ml fullstendig medium leukocytt bare; for positiv kontroll, i tillegg til plettering av samme antall CD4 + T-celler / brønn, tilsett a-CD3 / 28 konjugerte mikrokuler for å få en kule-til-celle-forhold på 1: 1.
- På 3. dagen av co-kultur, vurdere spredning av CFSE merkede CD4 + T-celler (plassert i rundbunnede rør) ved flowcytometrisk analyse 16 med 488 nm eksitasjon og emisjonsfiltre passende for fluorescein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 angir den generelle skjema av eksperimentet, og figur 2 viser utseendet av de forskjellige cellekulturbetingelser som visualisert ved fasekontrastmikroskopi invertert. MSC er adherente celler med en fibroblastiske, spindelformet morfologi, mens PBMC og leukocytter er små runde ikke-adherente celler. Disse to morfologisk forskjellige celletyper kan tydelig ses i ko-kulturen. Ved slutten av forsøket, da PBMC (eller leuckotyes) suges for flowcytometrisk analyse, selv om adherente MSCer er utilsiktet inkludert (dvs. på grunn av dårlig feste eller løsner ved kraftig aspirasjon), bør det ikke være noen problemer med å vurdere PBMC / leukocyttfraksjonen siden disse cellene vil være merket med CFSE. Når det ikke er spredning, er histogram resultater for CFSE-merkede celler sett på som en svært positiv og skarp topp; men når aktiveringen har funnet sted, vil være åpenbare proliferasjon som manifest by flere mindre topper med en tap og venstre-forskyvning av fluorescens intensitet (figur 3). Når undertrykkelse av spredning har skjedd, altså., Med co-kulturen i MSC, vil flere mindre topper avta med en samtidig økning av fluorescerende intensitet som gjenspeiles av skiftende av toppene til høyre og øker i skarpheten i høyre- . mest topp som representerer de ikke-delende celler Figur 4 betegner den generelle skjema av en variant av forsøket: vurdere effektor undertrykkelse av MSC-induserte immunmodulerende leukocytter på aktiverte effektor allogene CD4 + T-celler. Resultatene av for eksempel en variant av eksperimentet er lik den opprinnelige analysen, med den ytterligere informasjon om doseavhengig suppresjon av proliferasjon sett (figur 5).
Figur 1. Flytskjema for vurdering av immunmodulerende effekter av mesenchymale stamceller (MSC) på allogene effektor leukocytter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Celle morfologi MSCer, leukocytter, og ko-kultur av to cellepopulasjoner. Fasekontrastmikroskopi fotografier av enkeltcellekultur av MSC eller leukocytter, og MSC-leukocytt-ko-kulturen. Scale bar, 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. MSC undertrykkende effekt på formerende leukocytter. Strømningscytometrisk histogram av karboksyfluorescein succinimidylester (CFSE) -merket leukocytt-proliferasjon (A) dyrket alene ikke-stimulert, (b) ko-kultur med MSC, (C) dyrket med anti-CD3 / CD28 mikroperle stimulering (α-CD3 / CD28) alene, (D) og med MSC. Prosentene som vises i histogrammet betegne andelen proliferating leukocytter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Flytskjema for vurdering av MSC-indusert leukocytt immunmodulering på allogen CD4 + effektor T-lymfocytter.laste / 53265 / 53265fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Undertrykkende kapasitet på MSC-ko-dyrkede CD14 monocytter på voksende CD4 lymfocytter. Spredningsdiagram og flowcytometrisk histogram av undertrykkende kapasitet på MSC-ko-dyrkede CD14 + monocytter (M-CD14 +) på anti-CD3 / CD28 mikro stimulert, CFSE-merkede CD4 + effektor T-lymfocytter (S-CD4 +). Co-kulturen forholdet mellom S-CD4 + til M-CD14 + er vist. CD4 + T-lymfocytter ble gated (R1) og vurderes for CFSE intensitet. Prosentene som vises i histogrammet betegne andelen proliferende CD4 + T-celler. Klikk her for å se en større versjon av ther figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) |
| Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) | Life Technologies | V12883 | Cellular label for detection of cell division |
| Phytoagglutinin (PHA) | Sigma | L8902 | Activation of human PBMCs |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc. |
| autoMACS™ Separator | Miltenyi Biotec | autoMACS™ Separator | Magnetic based cell separator |
| autoMACS® Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | separation columns |
| CD14 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs |
| CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | Human PBMC/leukocyte culture medium |
| DMEM, Low glucose, pyruvate | Life Technologies | 11885 | Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Supplementation for MSC complete medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | 1) Hyclone, for MSC culture 2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations) | 1) SH30070.03M 2) 10091-148 | Pre-test lots for support of MSC in vitro culture |
| 24-well cell culture plate | Corning | COR3524 | Co-culture plate |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430291 | Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS |
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430766 | Collection of the labeled and unlabeled cell fractions |
| Round-bottom tubes | BD Falcon | 352008 | Collection of cells for flow cytometric analysis |
References
- Friedenstein, A. J. Precursor cells of mechanocytes. Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7, 211-228 (2001).
- Yen, B. L., et al. Isolation of multipotent cells from human term placenta. Stem Cells. 23, 3-9 (2005).
- Erices, A., Conget, P., Minguell, J. J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br J Haematol. 109, 235-242 (2000).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30, 42-48 (2002).
- Chang, C. J., et al. Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma. Stem Cells. 24, 2466-2477 (2006).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8, 726-736 (2008).
- Chen, P. M., Yen, M. L., Liu, K. J., Sytwu, H. K., Yen, B. L. Immunomodulatory properties of human adult and fetal multipotent mesenchymal stem cells. J Biomed Sci. 18, 49-59 (2011).
- Muul, L. M., et al. Measurement of proliferative responses of cultured lymphocytes. Curr Protoc Immunol. , Wiley & Sons, Inc. (2011).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
- Chen, P. M., et al. Induction of immunomodulatory monocytes by human mesenchymal stem cell-derived hepatocyte growth factor through ERK1/2. J Leukoc Biol. 96, 295-303 (2014).
- Oughton, J. A., Kerkvliet, N. I. UNIT 18.8 Immune cell phenotyping using flow cytometry. Curr Protoc Toxicol. Costa, L. G., Davila, J. C., Lawrence, D. A., Reed, D. J., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. 18.8.1-18.8.24 (2005).
- Phelan, M. C., Lawler, G. APPENDIX 3A Cell counting. Curr Protoc Cytom. Robinson, J. P., et al. , Wiley & Sons, Inc. A.3A.1-A.3A.4 (2001).
- Gebler, A., Zabel, O., Seliger, B. The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells. Trends Mol Med. 18, 128-134 (2012).
- Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet. 371, 1579-1586 (2008).
- Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307, 1169-1177 (2012).
- Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex. Scand J Immunol. 57, 11-20 (2003).
- Li, X. Y., et al. Long-term culture in vitro impairs the immunosuppressive activity of mesenchymal stem cells on T cells. Mol Med Rep. 6, 1183-1189 (2012).
- Moll, G., et al. Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties? Stem Cells. 32, 2430-2442 (2012).
- Ho, P. J., Yen, M. L., Tang, B. C., Chen, C. T., Yen, B. L. H2O2 accumulation mediates differentiation capacity alteration, but not proliferative decline, in senescent human fetal mesenchymal stem cells. Antioxid Redox Signal. 18, 1895-1905 (2013).
