Article de méthode
Ce protocole décrit la décellularisation des reins de rat Sprague Dawley par perfusion antérograde de détergents à travers le système vasculaire, produisant des matrices extracellulaires rénales acellulaires qui servent de modèles pour le repeuplement avec des cellules épithéliales rénales humaines. La recellularisation et l’utilisation du test de perfusion de résazurine pour surveiller la croissance sont effectuées dans des bioréacteurs de perfusion spécialement conçus.
Ce protocole détaille la génération de acellulaire, encore, des échafaudages biofonctionnels rénales matrice extracellulaire (MEC) qui sont utiles comme substrats modèles à petite échelle pour le développement du tissu organe échelle. Reins de rats Sprague Dawley sont canulées par l'insertion d'un cathéter dans l'artère rénale et perfuses avec une série de détergents à faible concentration (Triton X-100 et du dodécylsulfate de sodium (SDS)) de plus de 26 heures pour obtenir intactes, des échafaudages entier rénaux avec intact vascularisation perfusable, glomérules et les tubules rénaux. À la suite de la décellularisation, l'échafaudage rénale est placé dans un récipient bioréacteur à perfusion conçu sur mesure, et cathétérisé l'artère rénale est connecté à un circuit de perfusion comprenant: une pompe péristaltique; tube; et en option des sondes pour le pH, l'oxygène dissous et la pression. Après stérilisation du échafaud avec de l'acide peracétique et d'éthanol, et en équilibrant le pH (7,4), l'échafaudage de rein est préparée pour l'ensemencement par perfusion de milieu de culture dans un large-capacité incubateur maintenu à 37 ° C et 5% de CO 2. Quarante millions épithéliales tubulaire cortical (RCTE) les cellules rénales sont injectés dans l'artère rénale, rapidement et perfuses à travers l'échafaudage sous fort débit (25 ml / min) et la pression (~ 230 mmHg) pendant 15 min avant de réduire le débit à un taux physiologique (4 ml / min). Cellules RCTE peuplent principalement le créneau ECM tubulaire dans le cortex rénal, prolifèrent, et forment des structures épithéliales tubulaires plus de sept jours de culture de perfusion. Une solution de résazurine 44 pM dans du milieu de culture est perfusé à travers le rein pendant 1 heure au cours d'échanges moyen pour fournir une évaluation sur la base du métabolisme redox fluorométrique de la viabilité cellulaire et la prolifération pendant tubulogenèse. Le bioréacteur de perfusion rénale permet échantillonnage non invasive pour l'évaluation de milieu biochimique, et de multiples orifices d'entrée permet l'ensemencement rétrograde alternatif à travers la veine rénale ou de l'uretère. Ces protocoles peuvent être utilisés pour recellularize échafaudages de rein avec unegrande variété de types cellulaires, y compris l'endothélium vasculaire, l'épithélium tubulaire, et les fibroblastes du stroma, pour une évaluation rapide au sein de ce système.
Comme le nombre de patients souffrant d'insuffisance rénale terminale continue d'augmenter, il ya une pénurie grave et croissante du nombre de reins de donneurs disponibles pour la transplantation. L'incapacité à répondre à la demande d'un nombre croissant continuellement des candidats en liste d'attente pour une transplantation rénale a incité la recherche en ingénierie d'organe de rein avec le but ultime de développement personnalisé, des greffes de rein implantables sur demande 1,2. Fonctionnement tissu rénal partir des propres cellules d'un patient de construction permettrait d'éliminer la nécessité d'immunosuppressi....
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ÉTHIQUE DECLARATION: Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées conformément aux lignes directrices approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de la Northwestern University.
1. Rein Décellularisation
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Reins séquentiellement perfusés avec de l'eau et des solutions diluées de détergent (1% de Triton X-100, 0,1% de SDS) selon un protocole de décellularisation optimale précédemment établie (voir Figure 1A, B) 7, deviennent progressivement plus transparente sur une période de 26 heures, comme représenté sur la figure 2A. Le rein échafaudage acellulaire résultante est dépourvue de cellules et conserve une ECM rénale cohérent soutenu par une capsule rénale est intacte, ce qui.......
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Le protocole de décellularisation décrit un produit toujours ECM rénale complètement acellulaire qui sert de modèle 3D pour la culture de cellules humaines épithéliales tubulaires rénales corticales (à la fois proximale et distale tubules dérivés), en plus des cellules endotheliales vasculaires 7,17. Le système vasculaire rénale canule sert l'élément clé pour la livraison uniforme des réactifs et des cellules à travers l'échafaud dans un bioréacteur mis en place, permettant ainsi aux perfusion décellu.......
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Les auteurs remercient la Fondation de la Famille Zell pour son soutien. Nous reconnaissons le soutien de l’initiative de subventions de recherche translationnelle Dixon de la Northwestern Memorial Foundation, de la subvention de développement du corps professoral de l’American Society of Transplant Surgeon et d’une subvention de recherche pour le jeune chercheur de la National Kidney Foundation of Illinois. Nous reconnaissons le soutien de la Fondation Robert R. McCormick. Ce travail a également été soutenu par le NIDDK K08 DK10175 à J.A.W. Les carottes d’imagerie et d’histologie utilisées pour cette recherche sont soutenues par le Laboratoire d’histologie et de phén....
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactifs | |||
| TRITON X-100, Qualité Protéomique, AMRESCO | VWR | M143-4L | |
| Solution de dodécylsulfate de sodium, BioUltra, pour la biologie moléculaire, 20 % dans H2O | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Solution d’acide peracétique, purum, ~ 39 % dans l’acide acétique (RT) | Sigma-Aldrich | 77240 | Le peracétique est inflammable et corrosif. Préparez-vous à l’intérieur d’une hotte à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié (p. ex. gants, lunettes de protection). |
| Éthanol 200 proof | VWR | V1001TP | |
| Sigmacote, réactif de siliconation pour le verre et autres surfaces | Sigma-Aldrich | SL2 | Pour le traitement des réservoirs de bioréacteurs. Appelé réactif de siliconation dans le texte. |
| DMEM/F12 media | Life Technologies | 11320-033 | |
| Corning cellgro Sérum de veau fœtal premium, Mediatech | Corning | 35-010-CV | |
| Pénicilline-Streptomycine Solution, 100X 10 000 I.U. Pénicilline 10 000 & micro ; g/mL Streptomycine | Corning | 30-002-CI | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Life Technologies | 12605-028 | Appelée enzyme de dissociation cellulaire dans le texte. |
| Trypan Blue Stain (0.4 %) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Resazurin | salt Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Équipement : | |||
| Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC | Cole-Parmer | EW-07522-20 | |
| Masterflex L/S grandes cartouches pour têtes de pompe 07519-05 et -06. | Cole-Parmer | EW-07519-70 | Désigné dans le texte comme une grande cartouche de pompe. |
| Tête de pompe à cartouche Masterflex L/S 8 canaux, 4 rouleaux. | Cole-Parmer | EW-07519-06 | |
| Pince à échantillon droite de 6 ", dentelée | VWR | 82027-438 | |
| *Bioréacteur à perfusion rénale | WilMad Labglass | conçus sur mesure | sont produits comme décrit par WilMad Labglass. Les conceptions ont été décrites en détail dans une publication précédente. |
| du circuit de perfusion | |||
| 24 g x 0,75 po Cathéter IV blindé BD Insyte Autoguard (0,7 mm x 19 mm) en biomatériau BD Vialon. A une aiguille crantée. (50/PC, 200/CA) | BD Biosciences | 381412 | Désigné dans le texte comme cathéter de calibre 24. |
| Tube Masterflex PharMed BPT, L/S #14, 25'Cole-Parmer | HV-06508-14 | Désigné dans le texte comme tube de pompe péristaltique. | |
| Tube en silicone durci au peroxyde, 1/16 » ID x 1/8 » OD, 25 pi/paquet | Cole-Parmer | HV-06411-62 | Désigné dans le texte comme tube en caoutchouc de silicone 1/16 » ID. |
| Tube en silicone durci au platine Masterflex, L/S 14, 25 pi | Cole-Parmer | HV-96410-14 | Désigné dans le texte comme un tube en caoutchouc de silicone à paroi épaisse de 1/16" de diamètre intérieur. |
| Tube en silicone VWR, 1/4 » ID x 0,5 » OD | VWR | 89068-484 | |
| Filtres d’évent Acro 50, Pall Life Sciences | VWR | 28143-558 | Désigné dans le texte comme filtre d’évent de 0,2 micron |
| Cole-Parmer Adaptateurs Luer, Luer Lock mâle à 1/8 » ID, Nylon, 25/pqt | Cole-Parmer | T-45505-11 | Désigné dans le texte comme Luer lock mâle à adaptateur barbelé 1/8 ». |
| Cole-Parmer Luer Accessoire, Mâle Luer Plug, Nylon, 25/pqt | Cole-Parmer | EW-45505-58 | |
| Adaptateur Luer femelle x Luer femelle, Nylon, 25/pqt | Cole-Parmer | EW-45502-22 | Désigné dans le texte comme Luer femelle x adaptateur Luer femelle. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Femelle Luer Cap, Nylon, 25/pqt | Cole-Parmer | EW-45502-28 | |
| Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L - Robinet d’arrêt Hi-Flo à 3 voies avec Luer Lock mâle étendu, Formulation sans DEHP, Sans latex (LF), Résistant aux lipides, Non-PVD, 50/cs | Careforde Healthcare | 10254821 | Le numéro de catalogue de Smiths Medical (fournisseur) est #MX4311L. |
| Seringue | |||
| jetable BD Luer-Lok de 5 ml avec embout BD Luer-Lok&trade ;. | BD Biosciences | 309646 | |
| Plat de culture facile à saisir de 35 mm x 10 mm | BD Biosciences | 353001 | Utilisé pour aspirer une suspension cellulaire dans une seringue pour l’ensemencement cellulaire. |
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Demander une autorisationAn erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.
The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line. Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).