Une alternative simple à injection stéréotaxique pour Brain Knockdown spécifique de miARN

Summary

Les microARN jouent un rôle crucial dans le cerveau et sont des cibles potentielles pour la modélisation de la neurodégénérescence. Cependant, il est difficile de perturber les niveaux de miARN en raison de la courte longueur des miARN et de l’inaccessibilité du tissu cérébral. Cette vidéo présente une méthode de conception d’antagomir et d’administration spécifique au cerveau à l’aide d’un neuropeptide chez la souris.

Abstract

Les microARN (miARN) sont des régulateurs clés de l’expression des gènes. Dans le cerveau, les processus vitaux tels que le neurodéveloppement et les fonctions neuronales dépendent de l’expression correcte des microARN. La perturbation des microARN dans le cerveau peut être utilisée pour modéliser les maladies neurodégénératives en modulant la mort cellulaire neuronale. Actuellement, l’injection stéréotaxique est utilisée pour administrer des agents d’inhibition des miARN à un endroit spécifique du cerveau. Ici, nous discutons des stratégies de conception d’antagonmirs contre les miARN avec des modifications nucléotidiques verrouillées (LNA). Décrire ensuite une méthode d’administration d’antagomirs spécifique au cerveau, uniformément dans différentes régions du cerveau. Cette méthode est simple et largement applicable puisqu’elle permet de surmonter la chirurgie, les blessures associées et la limitation de l’administration locale dans les injections stéréotaxiques. Nous avons préparé un complexe de glycoprotéine du virus de la rage (RVG) peptidique neurotrope pénétrant dans les cellules avec de l’antagomir contre le miARN-29 et injecté à travers la veine de la queue, pour l’administrer spécifiquement dans le cerveau. La conception de l’antagomir incorporait des caractéristiques qui permettent un ciblage spécifique du miARN et la formation de complexes non covalents avec le peptide. L’inactivation du miARN dans les cellules neuronales a entraîné la mort des cellules apoptotiques et des défauts de comportement associés. Ainsi, la méthode peut être utilisée pour des modèles aigus de neuro-dégénérescence par perturbation des miARN.

Introduction

Les microARN ont émergé comme de nouvelles cibles thérapeutiques en raison de leur rôle universel dans la régulation de l'expression des gènes et de preuve directe de l'implication dans la maladie. MiRNAs sont activement explorées pour leur potentiel en tant que médicament cible ^1,2. En outre, dans l'expression des miARN altérations sont associées à plusieurs maladies ^{3 et} simulation de ces changements par une perturbation artificielle d'expression des miARN peuvent être utilisées pour étudier les voies cellulaires impliquées dans la manifestation de la maladie. Livraison spécifique tissulaire de médicaments ciblant miARN est act....

Protocol

Remarque: Tous les sujets y compris la procédure d'animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel Animaux éthique (AIVE) à l'Institut de Génomique et biologie intégrative, New Delhi (IGIB / AEC / 10/2013). Ce protocole est particulièrement adaptée pour l'administration ciblée de antagomir-29 dans le cerveau et knock-down de miR-29.

1. Stratégie de conception antagomir

1. Récupérer la séquence miARN mature à partir miRBase ¹¹ (http://www.mirbase.org/).
2. Récupérez les séquences de membres de la famille liés miRNA en utilisant le lien "Gene famille" dans le....

Results

En utilisant la procédure présentée ici, des complexes d'oligonucléotide 50microgram marqué par fluorescence (FLO) et ~ 850microgram RVG peptide de 1:15 rapport de charge molaire (FLO: peptide) ont été préparés et injectés qu'une seule fois par veine de la queue. Complexe de non-neurotrope virus de la rage Matrix (RVM) peptide et FLO a été utilisé comme un contrôle de livraison. Le jour suivant, les souris cerveau et le foie ont été isolés et des suspensions cellulaires simples ont été préparées. Les cellules ont été ob.......

Discussion

Nous présentons ici une méthodologie largement accessible pour étudier les effets de la modulation des miARN. À l’heure actuelle, la plupart des tentatives de caractérisation in vivo des fonctions des miARN impliquent la création de souris knock-out ou d’un transgénique qui exprime une éponge à miARN. La plupart des miARN, même ceux spécifiques au type de cellule, sont exprimés dans plus d’un organe. Par exemple, les miARN que l’on pensait initialement spécifiques du système hématopoïétique sont également exp.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vortex
Resrestraint ou Decapicone
Piste étroite ~			70 cm de long, ~5 cm de large avec des murs de ~5 cm de haut.
Réactifs
Oligonucléotides marqués par fluorescence (siGLO)	GE Healthcare Dharmacon INC	D0016300120
10 % D-glucose
Antagomir-29	Exiqon	synthèse personnalisée
	Exiqon	synthèse
Neuropeptide RVG	G.L.Biochem ( Shanghai) Ltd.	synthèse sur mesure	>Neuropeptide de pureté 98 %
RVM	G.L.Biochem (Shanghai) Ltd.	synthèse personnalisée	>98 % de pureté
Autre
Coton
Seringues d’insuline
Feuilles absorbantes
Encre
Pinceau
Antiseptique