pile Sertoli sono necessari per lo studio testicolo-immunitario privilegio, trasduzione del segnale durante l'infiammazione o infezione, e l'utilizzo delle loro proprietà immunoprotettivi. Qui si descrive un protocollo a base di enzimi per l'isolamento delle cellule di Sertoli primaria altamente purificate e cellule peritubulari da testicoli di ratto.
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Articolo metodologico
Isolamento delle cellule di Sertoli e peritubulari cellule da Rat testicoli
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il testicolo, ed in particolare il gamete maschile, sfida il sistema immunitario in modo unico perché differenziato spermatozoi appaiono prima al momento della pubertà - più di dieci anni dopo l'istituzione della tolleranza immunitaria sistemica. cellule spermatogeniche esprimono un certo numero di proteine che possono essere visti come non-self dal sistema immunitario. Testicolo deve quindi essere in grado di stabilire tolleranza a questi neo-antigeni da un lato ma comunque in grado di proteggersi dalle infezioni e sviluppo tumorale dall'altro. Pertanto il testicolo è uno dei pochi siti privilegiati immunitarie del corpo che tollerano antigeni estranei senza evocare una risposta immunitaria infiammatoria dannosa. cellule di Sertoli svolgono un ruolo chiave per il mantenimento di questo ambiente privilegiato immunitario del testicolo e anche prolungare la sopravvivenza delle cellule cotransplanted in un ambiente straniero. Pertanto cellule di Sertoli primarie sono uno strumento importante per lo studio del privilegio immunitario del testicolo che non può essere postaasily sostituito da linee cellulari stabilizzate o altri modelli cellulari. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato e completo per l'isolamento delle cellule di Sertoli - e le cellule peritubulari se lo si desidera - da testicoli di ratto in un solo giorno.
Introduzione
Testicoli producono gameti maschili e ormoni sessuali, cioè, gli androgeni. L'organo è composto di due compartimenti. Nel vano interstiziale, che rappresenta circa il 10-12% del volume testicolare totale 1, steroidogenesi avviene all'interno delle cellule di Leydig. Il vano tubolare rappresenta circa il 60-80% del volume testicolare 1 e contiene le cellule germinali e due tipi di cellule somatiche - cellule peritubulari e cellule di Sertoli. Il testicolo è diviso da setti di tessuto connettivo in 250-300 lobuli, ciascuna contenente 1-3 altamente contorte tubuli seminiferi. Questi tubuli sono racchiusi da una membrana basale, un ....
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Protocollo
Dichiarazione 1. Animal Ethics
Gli esperimenti qui descritti sono stati eseguiti secondo le linee guida del Regierungspräsidium Giessen, in Germania, in qualità di autorità locale e confermano il codice tedesco di condotta per la cura e l'uso di animali a fini sperimentali (permesso. No: GI 20/23 Nr A 31 / 2012).
2. Preparazione di media, soluzioni di enzimi e animali
- Preparare 1% di alcool iodio sciogliendo 1 g di iodio in 100 ml di etanolo.
- Preparare 2x 500 ml Dulbecco's tampone fosfato (PBS) senza Ca 2+ e Mg 2+ integrato ciascuno con 7,5 ml di D-glucosio (100 g / L) e 5 ml 100x p....
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Risultati
La procedura descritta permette l'isolamento di circa 12 x 10 7 cellule del Sertoli da 10 testicoli di ratto. 3 x 10 6 cellule sono placcati per pozzetto su una piastra da 6 pozzetti in modo tale che da sei a sette 6 pozzetti sono disponibili per esperimenti sulla giorno 7. La digestione tripsina-DNasi I è la fase più critica durante l'isolamento delle cellule di Sertoli. Se la digestione, a questo punto avanza troppo lontano, il rapporto tra cellule germina.......
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Discussione
I tubuli seminiferi sono delimitati da uno strato circolare di cellule peritubulari e da una lamina basale sul lato luminale. Le cellule di Sertoli poggiano sulla lamina basale, stabiliscono la barriera sanguigno del testicolo attraverso la formazione di giunzioni occlusive tra cellule adiacenti e forniscono la struttura strutturale per l'organizzazione dell'epitelio seminifero. Le cellule di Sertoli e le cellule spermatogeniche adiacenti mantengono contatti intimi durante lo sviluppo delle cellule germinali, fornendo co.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Guido Verhoeven e Ludo Deboel, Leuven, che erano estremamente utile per stabilire l'isolamento delle cellule di Sertoli primarie in laboratorio Meinhardt a Giessen. Monika Fijak, Gießen, è riconosciuto per il suo aiuto con la figura 1A e consigli. Gli studi sono stati sostenuti dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft attraverso concessione BH 93 / 1-1 (SB) e il finanziamento della ricerca internazionale laureato JLU Giessen (Germania) / Monash University (Melbourne, Australia) GRK 1871 (SB). Il sostegno è stato ottenuto anche da un contributo dello Stato di Hessen nell'ambito del programma "Landes-Offensive zur Entwicklung Wiss....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Clone di anticorpi di actina (muscolo liscio) 1A4 | Dako | M0851 | Anticorpo monoclonale di topo anti umano. Utilizzare la diluizione 1:100 per l'immunofluorescenza. |
| Albumina frazione bovina V Serva | 11930.04 | liofilizzato Filtro (0,45 &; micro; m) Soluzioni di BSA utilizzate per l'immunofluorescenza. | |
| Filtri per celle Corning 70 µ m | Corning | 431751 | Colore bianco |
| Collagenasi A da Clostridium histolyticum | Roche | 10103586001 | |
| DAPI mountant ProLong Gold Antifade | Life technologies | P-36931 | |
| D-glucosio | Sigma | G8644 | 100 g/L |
| Dulbecco´ s PBS senza Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14190-094 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Microscopio elettronico | Zeiss | EM 109S | |
| Microscopio a fluorescenza | Zeiss | Axioplan 2 | |
| Ialuronidasi da testicolo bovino | Sigma | H3506 | |
| Luce invertita microscopio | Olympus | CKX41 | Microscopio per colture cellulari di routine |
| Mouse IgG / IgM (H+L) policlonale secondario Anticorpo | Life technologies | A-10684 | Alexa Fluor 488 coniugato |
| Olio Rosso O | Sigma | O0625 | Ha sostituito Sudan III e Sudan IV a causa del colore più brillante. |
| Paraformaldeide | Sigma | P6148 | |
| Penicillina (5.000 U/ml)/ Streptomicina (5.000 µ g/ml) | Gibco | 15070-063 | 100x soluzione |
| RPMI-1640 | Gibco | 21875-034 | Contiene 300 mg/L di L-glutammina |
| Tripsina da pancreas suino | Sigma | T5266 | |
| Trypan Blue Stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Inibitore della tripsina da soia | Sigma | T6522 | Il prodotto Sigma è notevolmente più economico del BPTI (Aprotinina) precedentemente utilizzato di Roche. |
| Anticorpo vimentina (V9) | Sigma | V6630 | Anticorpo monoclonale di topo anti vimentina maiale. Utilizzare la diluizione 1:100 per l'immunofluorescenza. |
| Wistar WU ratti | Charles River | Dovrebbe avere 19 giorni il giorno dell'esperimento. |
Riferimenti
- Andrology. Male Reproductive Health and Dysfunction. Nieschlag, E., Behre, H., Nieschlag, S. , 3rd ed, Springer. (2010).
- Esaki, S. Über Kulturen des Hodengewebes der Säugetiere und über die Natur des interstitiellen Hodengewebes und der Zwischenzellen. Z. Mikros....
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Ristampe e permessi
