Method Article

RNA 분석을위한 인간의 전립선 상피 세포의 레이저 캡처 이외에 Microdissection

DOI:

10.3791/53405

⸱

November 26th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 2Department of Periodontics, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

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이 프로토콜의 목표는 다운스트림 RNA 분석을 위해 이질적인 전립선 조직에서 세포 유형의 순수한 집단을 분리하는 효과적인 방법으로 레이저 캡처 미세 해부를 사용하는 것입니다.

Abstract

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전립선은 기질, 상피, 신경내분비, 면역 세포 유형의 이질적인 환경을 포함합니다. 건강한 전립선은 별개의 상피 라이닝된 분비 내강을 둘러싼 섬유근육 기질과 매우 적은 수의 면역 및 신경 내분비 세포로 구성됩니다. 대조적으로, 전립선암 부위는 이형성 내강 상피가 증가하여 기질 개체수가 크게 감소하거나 아예 없습니다. 기질 세포 유형과 상피 세포 유형 간의 근본적인 차이를 감안할 때, 모든 유형의 다운스트림 분자 분석을 위해 세포 유형을 분리하는 것이 필수적입니다. 이러한 지식에도 불구하고, 대부분의 유전자 발현 연구는 미세 박리 없이 양성 전립선을 암과 비교하여 양성 샘플에서 기질 편향을 초래합니다. 레이저 캡처 미세박리(LCM)는 표본 절편에서 서로 다른 세포 유형을 물리적으로 분리하는 효과적인 방법입니다. 이 프로토콜의 목표는 RNA가 LCM에서 수집된 인간 전립선 상피에서 성공적으로 분리되어 RT-qPCR 및 RNAseq와 같은 다운스트림 유전자 발현 연구에 사용될 수 있음을 보여주는 것입니다.

Introduction

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전립선은 주로 평활근 1로 구성 fibromuscular 기질에 둘러싸여 샘 꽈리에 배치 분비 상피 세포로 구성된 이종 조직이다. 기저 세포 분비 세포, 신경 내분비 세포, 중계 증폭 세포 및 줄기 세포 2 : 상피 구획 다섯 다르지만 조직 유형의 세포로 구성된다. 내강 상피 세포로부터 발생 전립선 암 (PCA)에있어서, 선암 성장 기질 구획 (3)의 점진적인 하락 분명시킨다. 이러한 이유로, 조직 표본은 PCA의 정도에 기초하여 기질과 상피 세포 유형의 비율 뚜렷한 차이가있을 것이다. 이러한 차이는 원하는 세포 유형의 미세 절제에 관계없이 전체 조직에서 얻은 유전자 발현 데이터의 바이어스 된 가정을 초래할 수있다. 따라서, 이러한 바이어스를 제거하는 것이 종래 RNA 추출 및 세포 유형을 분리하는 것이 필수적이다유전자 발현 분석.

Macrodissection 미세 절제 또는 물리적 주변 기질 4 -6에서 잘 특성화 상피 영역을 분리하기 위해 사용될 수있다. Macrodissection는 일반적으로 해부 현미경 면도날으로 수행하고 큰 PCA는 기질에서 결절 분리 잘 작동하지만, 기질 주변에서 양성 상피를 제거 할 수 없습니다 (그림 1에서

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Protocol

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이 실험에 사용 된 모든 인체 조직은 시카고 일리노이 대학의 임상 시험 심사위원회의 승인을 프로토콜 및 / 또는 면제를 통해 인수했다.

1. 제 냉동 전립선 PEN-슬라이드에와 충전 유리 슬라이드에

  1. 하루 전 또는 몇 시간 샘플을 절편하기 전에, 청소 도구 (즉, 브러쉬, 집게, coplins, 블레이드, PEN-프레임 슬라이드 (그렇지 않으면 이미 된 RNase 무료), ETOH 안전 마커와 연필)과의 내부 스프레이 병 및 실험실 와이프를 사용하여 솔루션을-오염 제거의 RNase와 RT의 저온 유지 장치.
    1. 의 RNase-오염 제거 솔루션, 멀리 닦아 전에 5 분 동안 앉아 솔루션 (depcH 2 0 준비) 70 % EtOH로 최종 헹굼의 RNase가-오염 제거를 통해 왼쪽 제거하려면 depcH 2 0 씻어하도록 허용합니다.
      참고 :이 된 RNase없는 작업 공간을 유지하기 위해 필수적이다. 모든 coplins, 도구, 냉동 장착 매체, 블레이드 및 사용 슬라이드의 RNase 무료 작업에만 사용되어야한다및 표준 비의 RNase없는 환경에서 사용되지 않습니다. 모든 악기는 각 실험 이전의 RNase의 오염 제거 용액으로 처리해야합니다.
  2. -24....

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Results

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이전 연구에서 우리는 동일한 환자 (4)로부터 냉동 FFPE 전립선 조직에서의 mRNA 및 마이크로 RNA의 RT-qPCR에 의해 발현 프로파일을 비교하는 상피 및 간질 조직을 수집하는 LCM의 사용을 설명했다. LCM은 RNA의 다량 차세대 염기 서열 분석을 위해 수집하는 경우 특히, 시간 소모적이다. 따라서, 작업 공간을 유지하는 것이 중요하며 툴 무연의 RNase. 그것은 (다음 단락에서 자세히 설명) 수집 RNA의 질 및 세포 특이성 제어를 검사하는 것을 권장합니다.도 1은 전과 레이저 캡처 양성 상피 후 현미경 PEN 프레임 슬라이드 염색 전립선 단면을 도시 .

샘플이 수집되어 RNA 신중 추출되면, 표 1에 나타낸 바와 같이 RNA의 질과 양을 평가하는 것이 중요하다. 이것은 낮은 260/280 nm의 비율을 관찰하는 것은 드문 일이 아니다. RNA를합니다 집중260/280 nm의 비율.......

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Discussion

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표본에서 인간 유전자 발현 프로파일 링이 가능 품질 또는 조직의 수량뿐만 아니라, 주어진 조직 표본에 존재하는 다양한 조직 학적 엔티티뿐만 아니라, 도전 일 수있다. 이것은 양성 조직은 주로 간질 조직 및 암 영역이다 기질 결여 된 전립선에 특히 도전적이다. LCM은 두 개의 서로 다른 유형의 세포 (도 1A)의 더 정확한 서명 전립선 상피와 기질 RNA의 물리적 분리를 용이하게한다. macrodissection 또는 전체 조직 처리에 비해, LCM 양성 조직에서 세포 구획을 구분하지만, 훨씬 더 많은 비용과 노동 집약적 인 할 수 있습니다.

어떤 기술에 가능한 함정이있다. 예를 들어, RNA 품질은 초기 표본 조달시 또는 LCM 및 추출 절차를 수행하는 동안 부분적으로 성능이 저하 될 수 있습니다. 첫 번째 경우, 유전자 발현이 상이한 짧은 AMPL 측정을 달성 할 수있다qPCR에 의한 아이콘. 두 번째 경우에는, 모든 도구와 재료의 RNase.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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수년에 걸쳐 이 방법론을 최적화하는 데 도움을 준 Vicky Macias 박사, Angeline Giangreco 및 Avani Vaishnav 박사와 RNA 염기서열 분석을 제공한 일리노이 대학교 어바나-샴페인 캠퍼스의 Yang Zhang 박사와 Jian Ma 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) 및 Prevent Cancer Foundation 보조금(Zhou)의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RNase-AWAY MBP7005-11
PEN-멤브레인 4.0mm 슬라이드 라이카11600289
유리 슬라이드, Superfrost PlusFisherBrand12-550-15
에탄올 200 프루프Decon 실험실.2701
DEPC (디에틸 피로카보네이트)SigmaD-5758
CryostatLeicaCM3050
Coplins (염색 항아리)IHCWORLDM900-12
Coplins (염색 랙)IHCWORLDM905-12
Aperio ScanScopeAperio(Leica)ScanScope®
Toluidine BlueFluka89640-5G
레이저 미세해부 시스템LeicaLMD7000
0.5ml LCM용 얇은 벽 튜브Thermo ScientificAB-0350
RNA수성®-Micro Total RNA 분리 키트AmbionAM1931Thermo Fisher Scientific 브랜드
NanoDropThermo ScientificND-1000
Qubit 2.0 형광측정기Life TechnologiesQ32866Thermo Fisher Scientific 브랜드
고용량 cDNA 역전사 키트Applied Biosystems4368814Thermo Fisher Scientific 브랜드
범용 cDNA 합성 키트 II, 8-64 rxnsExiqon203301
TaqMan microRNA RT kitApplied Biosystems4366597Thermo Fisher Scientific 브랜드
Hematoxylin stain Ricca Chemical Company3536-16
Eosin-YRichard Allan Scientific 7111
CS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schauer, I. G., Rowley, D. R. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 82, 200-210 (2011).
  2. Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-related cancer. 12

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Laser Capture MicrodissectionProstatic EpitheliumRNA IsolationFrozen TissueCryostat SectioningToluidine Blue StainingRNA Free EnvironmentLysis Buffer IncubationRT qPCR AnalysisRNAseq Analysis

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