Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Vann i olje emulsjoner: Et nytt system for Montering Vannløselige Klorofyll bindende proteiner med Hydrofobe Pigmenter

Published: March 21, 2016 doi: 10.3791/53410
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Chemistry, Weizmann Institute of Science, 2Migal-Galilee Research Institute

Summary

Dette manuskriptet beskriver en enkel og high-throughput fremgangsmåte for sammenstilling av vannløselige proteiner med hydrofobe pigmenter som er basert på vann-i-olje-emulsjoner. Vi viser effektiviteten av fremgangsmåten i monteringen av innfødte klorofyll med fire varianter av rekombinant vannoppløselig-klorofyll bindende proteiner (WSCPs) av Brassica planter uttrykt i E. coli.

Abstract

Klorofyll (Chls) og bacteriochlorophylls (BChls) er de primære kofaktorer som utfører foto lys høsting og elektrontransport. Deres funksjonalitet kritisk avhengig av deres spesifikke organisasjon innen store og forseggjorte multisubunit transmembrane protein komplekser. For å forstå på molekylnivå hvordan disse kompleksene lette solenergi konvertering, er det viktig å forstå protein-pigment og pigmentpigment interaksjoner, og deres effekt på glade dynamikk. Én måte å få en slik forståelse er ved å konstruere og å studere komplekser av Chls med enkle vannoppløselige rekombinante proteiner. Imidlertid, som omfatter de lipofile Chls og BChls til vannoppløselige proteiner er vanskelig. Videre er det ingen generell metode, som kan brukes for montering av vannløselige proteiner med hydrofobe pigmenter. Her viser vi en enkel og høy gjennomstrømning system basert på vann-i-olje-emulsjoner, som muliggjør assembly av vannløselige proteiner med hydrofobe Chls. Den nye metoden ble validert ved sammensetting av rekombinante versjoner av det vannoppløselige klorofyll bindende protein av Kors planter (WSCP) med Chl a. Vi demonstrerer vellykket montering av Chl en bruker grove lysates av WSCP uttrykker E. coli-celle, som kan brukes for å utvikle et genetisk system skjerm for nye vannoppløselige Chl-bindende proteiner, og for studier av Chl-protein interaksjoner og monteringsprosesser.

Introduction

Hydrofobe pigmenter som klorofyll (Chls), bacteriochlorophylls (BChls) og karotenoider er de primære kofaktorer i fotosyntesereaksjonssentre og lette høsting proteiner som utfører elektrontransport, og lysenergi fangst og transport. Reaksjonssentre og de fleste av de CHL-bindende lette høsting komplekser er transmembrane proteiner. Den Fenna-Matthews-Olson (FMO) protein av ikke-oxygenic foto grønn-svovelbakterier 1,2, og peridinin-CHL protein (PCP) av dinoflagellater 3 er enestående eksempler på vannløselige lys høsting proteiner. De vannløselige klorofyll bindende proteiner (WSCPs) av Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae og Amaranthaceae planter 4, 5 er en annen unik eksempel, men i motsetning til FMO og PCP, disse er heller ikke involvert i lys høsting eller i en hvilken som helst av de primære fotoreaksjons og deres presise grafisiological funksjoner er ennå uklart 5-8. Deres høy CHL-bindende affinitet har ført til en veiledende funksjon som forbigående bærere av Chls og CHL derivater 9,10. Alternativt, ble det antatt at WSCP spiller en rolle i spyle Chls i skadede celler og beskytter mot CHL-indusert photooxidative skade 7,11-13. I den senere tid ble det foreslått at WSCP virker som en protease-inhibitor, og spiller en rolle i løpet av planteeter motstand samt regulerer celledød under blomsterutvikling 14. WSCPs er delt inn i to hovedklasser i henhold til deres photophysical egenskaper. Den første klassen (klasse I, f.eks. Fra Chenopodium album) kan gjennomgå photoconversion ved belysning. Klasse II WSCPs fra Brassica planter, som ikke gjennomgår photoconversion 5,10, er videre inndelt i klasse IIa (f.eks., Fra kål, Raphanus sativus) og IIb (f.eks., Fra Lepidium virginicum Lepidium virginicum ble løst ved røntgenkrystallografi på 2,0 Å oppløsning 8. Det avslører en symmetrisk homotetramer hvori proteinunderenheter danner en hydrofob kjerne. For hver underenhet binder et enkelt Chl som resulterer i en tett anordning av fire tettpakkede Chls innenfor de core.This enkel alle Chl arrangement gjør WSCPs en potensielt nyttig modellsystem for å studere bindingen og montering av Chl-proteinkomplekser, og virkningene av nærliggende Chls og protein miljøer på de spektrale og elektroniske egenskaper til individuelle Chls. Videre kan det tilveie maler for å konstruere kunstige Chl-bindende proteiner som kan anvendes for lette innhøsting av moduler i kunstige fotosyntetiske enheter.

Strenge studier av innfødte WSCPs er ikke gjennomførbart fordi kompleksene renset fra planter alltid inneholde en heterogen blanding av tetramers med ulike kombinasjoner av CHL enog Chl b 9. Således kreves en fremgangsmåte for sammenstilling av rekombinant uttrykt WSCPs med Chls in vitro. Dette er utfordret av ubetydelig vannløselighet Chls som gjør det umulig å montere komplekset in vitro ved ganske enkelt å blande de vannoppløselige apoproteiner med pigmenter i vandige oppløsninger. In vitro-sammenstillingen ved å blande de apoproteiner med thylakoid membraner 15 ble påvist, men denne metoden er begrenset til den native Chls stede i thylakoids. Schmidt et al. rapportert om montering flere CHL og BChl derivater med WSCP fra blomkål (CaWSCP) ved rekombinant uttrykker en histidin-merket protein i E. coli immobilisere det på en Ni-affinitetskolonne og innføring av CHL-derivater oppløst i vaskemidler 11. Vellykket rekonstituering av rekombinante WSCPs fra A. thaliana 6, og rosenkål (BoWSCP), japansk vill reddik (RshWSCP) end Virginia pepperweed (LvWSCP) ved en lignende metode ble også rapportert.

Her presenterer vi en ny, generell, grei metode for montering Chls med WSCP som ikke krever merking eller immobilisering proteiner. Det er avhengig av å fremstille emulsjoner fra deres vandige oppløsninger av de vannoppløselige apoproteiner i mineralolje. Proteinene blir således innkapslet i vann-i-olje (W / O) mikrodråper med svært høy overflate til volum-forhold 16. De hydrofobe kofaktorer blir deretter oppløst i oljen og kan lett innføres i dråpene fra oljefasen. Vi rapporterer om bruk av metode for montering av flere varianter av WSCP apoproteiner rekombinant uttrykt i E. coli med Chl a. Vi viser sammenstillingen fra rått lysat fra WSCP-overuttrykkende bakterier som kan anvendes som et screening-system for å utvikle nye CHL-bindende proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Klar Chl en aksje Solutions

  1. KRITISK STEP: Utfør alle trinnene i klorofyll forberedelse i en kjemisk hette under grønt lys (520 nm) eller i mørket for å minimere photodamage. legger alltid nitrogen eller argon før frysing pigmentene for lagring. Sørg for at alle løsemidler er analytisk kvalitet.
  2. Veie omtrent 5 mg lyofiliserte Spirulina platensis celler eller andre cyanobacterium celler inneholdende bare Chl en i thylakoid membraner og knuse den ved hjelp av en morter og pistill.
  3. Last knuste celler på en glasskolonne og vasking med ca. 50-100 ml av 100% aceton for å fjerne karotenoider. Kast elueres oransje / grønn fraksjon.
    Merk: Hvis orange fraksjonen ikke elueres med 100 ml aceton fortsetter vasking av cellene med aceton inntil grønne fraksjonen begynner å elueres.
  4. Utveksling aceton med 100% metanol og samler den grønne fraksjonen inneholdende Chl a. Volumet av eluert desimalplasser du skal brukeion kan variere mellom 50-100 ml. Til å begynne med har den eluerte fraksjon en mørk grønn farge, som endres til blek grønn ved slutten av elueringen. Når fargen på eluerte fraksjon blir til blek grønn stoppe eluering.
  5. Fordamp metanol ved anvendelse av en rotasjonsfordamper inntil ekstraktet er fullstendig tørr. Ikke påfør varme til løsningen; sikre at fordamperen er vannbad temperaturen ikke overstiger 30 ° C.
    Merk: Tidspunktet for fordampning er avhengig av volumet av metanolfraksjonen fordampes og kan variere mellom 10-60 min. Det er viktig å tørke ekstrakten fullstendig.
  6. Oppløs pigmentene fra det tørkede ekstrakt i et lite volum av dietyleter (ca. 5-10 ml), og filtreres gjennom vatt. Pass på at pigmentene er fullstendig oppløst i eter før filtrering.
  7. Fordamp dietyleter inntil pigmentene er helt tørr (10-30 min).
    Merk: De tørre pigmenter kan spyles med og holdt under nitrogen eller argon på -20 ° C, i mørket inntil videre behandling.
  8. Løs opp de tørre pigmenter i minst mulig på 100% metanol (ca 1 ml) volumet, selv om ikke alt er helt suspendert. Tilsett 4 ml aceton til oppløsningen, og flick glasset forsiktig for å fullstendig oppløse pigmentene.
  9. Ved hjelp av en Pasteur pipette, laste prøven forsiktig på en kolonne av DEAE sepharose likevekt i 100% aceton.
  10. Elueres karotenoider (en oransje-gul band) med 100% aceton. Deretter elueres Chl en (grønn band) med 3: 1 volum / volum aceton / metanol-blanding.
    Merk: Volumet av aceton og aceton / metanol blanding er tilnærmet lik volumet av DEAE sepharose lastet på kolonnen.
  11. Verifisere Chl en renhet ved tynnsjiktskromatografi ved anvendelse av en 68: 25: 5: 2 diklormetan / n-heksan / isopropanol / metanol (v / v) blanding som elueringsmiddel 17.
  12. Fordamp løsningsmidlet ved anvendelse av en rotasjonsfordamper inntil Chl a er helt tørr (10-60 min).
    Merk: Det tørre Chl en kan spylt med nitrogen eller argon og lagret under en argonatmosfære ved -20 ° C i mørket.
  13. Forbered Chl en stamoppløsning ved å re-oppløsning av det tørre Chl en i 2-4 ml av 100% etanol.
    Merk: ekstinksjonskoeffisient på Chl en ved 663 nm er 74,400 cm -1 -1 M (83,3 cm -1 (mg / ml) -1) i etanol. En typisk stamløsning bør ha en OD på 1,860 tilsvarer en konsentrasjon på 25 mM (23 mg / ml). Å tilsette 20 ul av denne lager til en emulsjon inneholdende 5 ml av organisk fase, og 1 mg av WSCP i 1 ml av vandige fase resulterer i en blanding med 10 gangers molart overskudd av Chl en vs. WSCP.

2. Forbereder Organisk fase i emulsjonen

Merk: Den organiske fase av emulsjonen består av mineralolje inneholdende 4,5% (v / v) Span 80, og 0,4% (v / v) Tween 80.

  1. Veie i et 50 ml rør 0,2 g av Tlom 80, 1,8 g Span 80, og 38 g mineralolje. Bland godt alle komponenter og kjøle seg ned på isen.
    Merk: Den organiske fase kan lagres i 4 ° C opp til en uke.

3. fremstilling av den vandige fase i emulsjonen

Merk: Den vandige fase av emulsjonen kan være sammensatt av enten renset WSCP, eller råekstrakt av bakterier overekspresjon WSCP.

  1. Forbereder en vandig fase som inneholder renset WSCP.
    1. Dyrke E. coli BL21-bakterier som inneholder plasmidet WSCP 12 i 1 liter LB-medium ved 37 ° C inntil OD på 0,3-0,6.
    2. Fremkall protein uttrykk ved å legge en mM IPTG. Etter induksjon vokse bakterier ved 30 ° C i 12-16 timer.
    3. Høste bakteriene ved sentrifugering ved 5000 x g i 10 min ved 4 ° C.
    4. Oppløs pelleten i bindingsbuffer og sonikere på is (30 sekunder på, 15 sekunder av, fem ganger). Bruk 10 ml buffer for pellet oppnådd fra sentrifugering av 250 mlLB medium med celler som overuttrykker proteinet.
      Merk: Avhengig av rensemetode, kan bindingsbuffer bestå av 100 mM fosfatbuffer, pH 7,2 eller 50 mM Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA.
    5. Spinne ned cellelysatet ved 12.000 xg i 30 min ved 4 ° C.
    6. Rens WSCP ved affinitetskromatografi. Avhengig av taggen kondensert til WSCP, rense rekombinante proteiner ved anvendelse av hensiktsmessig kommersielt tilgjengelig affinitetskromatografi system for proteinrensing å følge produsentens instruksjoner.
    7. For emulsjonen til bearbeiding, bruke renset WSCP i 50 mM fosfatbuffer, pH 7,8. Sikre at det endelige protein beløpet som brukes for tilberedning er 0,5-1,0 mg per 1 ml buffer.
  2. Forbereder en vandig fase som inneholder rå bakterielysatet med WSCP.
    1. Dyrke E. coli BL21-celler inneholdende plasmid-uttrykk WSCP i 250 ml LB-medium ved 37 ° C inntil OD 0,3-0,6.
    2. Fremkall protein uttrykk med1 mM IPTG og vokse bakterier over natten ved 30 ° C.
    3. Feiebakterieceller ved sentrifugering ved 5000 x g i 10 min ved 4 ° C.
    4. Oppløs pelleten i 1-2 ml 50 mM natriumfosfatbuffer pH 7,8, sonicate (30 sek på, 15 sekunder av, tre ganger) og sentrifuger ved 12 000 xg i 30 min ved 4 ° C.
    5. Fremstille den vandige fase av emulsjonen ved å blande 0,125 ml av supernatanten med 0,875 ml 50 mM natriumfosfatbuffer pH 7,8.

4. Montering av WSCP med Chl en i Emulsion

  1. Transfer 5 ml olje-overflateaktiv blanding inn i et hetteglass og avkjøle den på is. Før pipettering, kontrollere at alle komponentene i den organiske fase blandes grundig, og det er ingen faseseparasjon mellom tensider og mineralolje.
  2. Tilsett 1 ml iskald, vandig fase fremstilt som i avsnitt 3 til 5 ml av organisk fase.
  3. Bland begge faser ved hjelp av en vev-homogenisator i 2 minutter ved 9500 omdreininger per minutt på is.
  4. KRITISK STEP: Fra dette stadiet på, utføre alle ytterligere trinnene under grønt lys (520 nm) for å minimere photodamage. Tilsett 20 pl av 25 mM Chl en stamoppløsning (se kapittel 1.13) til emulsjonen. Spre ved å dra og snu hetteglass. Kontroller at CHL er jevnt fordelt i emulsjonen.
  5. Inkuber emulsjonen i 1-2 timer på is i mørket.
  6. For å bryte ned emulsjonen og separate vanndråper fra den organiske fase overføre emulsjonen til 1,5 ml plastrør og sentrifuger ved 14 000 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
    Merk: Hvis sammenstillingen er vellykket, bør den nedre vandige fase har en grønn farge.
  7. Kast den øvre oljefasen og tilsett 1 ml av mineralolje. Bland godt mineralolje med pelletert emulsjon av vortex eller ved å vippe røret grundig. Spinne ned prøven ved 14 000 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Gjenta dette trinnet til en klar menisken skille vandig og mineral oljefaser, uten noen mellomliggende emulsjon oppnås.
  8. Utfør dette trinnet i en kjemisk hette. Etter at de vandige og jordoljefaser er klart atskilt, fjerne mineralolje og tilsett 1 ml vannmettet dietyleter. Vortex og spinne ned prøven ved 14 000 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Gjenta dette trinnet to ganger.
  9. Etter den andre sentrifugeringen, fjerne diethylether og la rørene åpne for 5-20 min i hetten.
  10. Til slutt legger du i vannfasen inneholder WSCP / Chl et kompleks på en avsalting kolonne og elueres med buffer egnet for videre eksperimenter.
    Merk: protein er stabilt i fosfat- og Tris buffere i et bredt spekter av pH (6,0-7,5). Prøven kan oppbevares ved 4 ° C beskyttet mot lys opp til en måned.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rekombinante WSCP apoproteiner ble montert med Chl en i W / O-emulsjoner i henhold til protokollen som er beskrevet i forrige avsnitt. Protokollen ble gjennomført under anvendelse av vandige faser som inneholdt enten rent WSCPs, eller lysatene E.coli-celler som overuttrykker WSCP (figur 1). Protokollen er enkel, rask og krever ikke noe spesielt utstyr, bortsett fra en vevshomogenisator.

Absorbansen og CD-spektra av Chl a komplekser av fire rekombinante WSCP varianter, nemlig RshWSCP, CaWSCP, BoWSCP og LvWSCP er vist i figur 2. Disse er lik i bandet form og posisjon til tidligere rapporterte spektra av de respektive tilpassede kompleksene 10,18, 19. Disse resultatene viser tydelig at WSCP / CHL komplekser rekonstituert i W / O-emulsjon systemet ligner de innfødte komplekser.

E. coli-celler som uttrykker WSCPs anvendt som den vandige fase av emulsjonen. Lysater av bakterier som ikke uttrykker WSCPs ble anvendt som negativ kontroll. Positive montering av WSCP med Chl en lett observeres av den grønne fargen av den vandige fase, men kun i lysater av WSCP uttrykkende celler (figur 3). Dråper som inneholder disse lysatene har tydelig Chl en fluorescens i konfokalmikroskop bilder. Dette innebærer at vellykket montering av WSCP / Chl-komplekser kan påvises direkte i vanndråper, som kan være grunnlag for vann / olje-emulsjon-baserte skjermsystemer.

Figur 1
Figur 1: Montering av WSCP med Chls i W / O Emulsjoner (A. E. coli-cellelysatene som uttrykker WSCP. Når emulsjonen er ferdig, blir Chls tilsatt til emulsjonen. Etter rekonstituering er vanndråper separeres fra organisk fase ved sentrifugering. (B) W / O-emulsjon systemet kan brukes for rask og høy throughput screening for positiv rekonstituering av WSCPs med Chls. Fluorescensen av WSCP / Chl kompleks kan oppdages direkte fra vannmikrodråper av en konfokal mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Absorbance og CD spektra av WSCP / Chl en Komplekser apoproteiner på fire.WSCP varianter ble rekonstituert med 10-ganger molart overskudd av Chl a. Absorbansen spektra (a) ble normalisert til en på 673nm for BoWSCP (svart), CaWSCP (grønn), og RshWSCP (blå) og 663nm for LvWSCP (rød). De samme normaliseringsfaktorer ble anvendt på CD (b). Gjengitt med tillatelse fra 16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Skanning Fluorescensmikroskopi og Visual Screening av WSCP / Chl Complex Assembly (A) SDS-PAGE av E.. coli BL21 cellelysater før og etter rekonstituering med Chl en i W / O-emulsjoner. Felt 1: BL21-celler uten den WSCP plasmidet, felt 2: BL21-celler med den WSCP plaSmid uten induksjon med IPTG, felt 3: BL21-celler med plasmidet WSCP indusert med IPTG. Spor 4, 5 og 6 er de samme prøvene som baner 1, 2 og 3, henholdsvis, men etter separasjon av vannfasen fra den organiske fase av emulsjonen. Små prøver av hver prøve ble kjørt på en SDS-protein-gel. Lane M: protein størrelse markør. Bilder av prøvene før og etter faseseparasjon er vist på toppen av hver bane. (B) konfokalmikroskop bilder av W / O dråper tilberedt med Chl en i oljefasen. Dråpene på det venstre bildet ikke inneholder noen proteiner mens de på høyre bildet inneholdt WSCP protein. Fluorescens ble overvåket ved 682 nm. Gjengitt med tillatelse fra 16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vårt mål var å utvikle en ny generell ordning for montering av vannløselige klorofyll bindende proteiner med hydrofobe pigmenter. Her er det vist at det nye tilberedning system basert på W / O-emulsjon er en generell tilnærming vist seg å fungere for montering av WSCP apoproteiner fra rosenkål, blomkål, japansk pepperrot og Virginia pepperweed rekombinant uttrykt i E. coli. Her resultatene er presentert fra rekonstituering av 1 mg WSCP med 10-ganger molart overskudd av Chl a. Men det er også mulig å benytte lavere konsentrasjoner av WSCP for reconstitutions og forskjellige CHL / protein-molforhold. Den minimale mengde protein, som vi var i stand til å samle seg i W / O-emulsjoner var 100 ug, mens pigmentet til protein-forholdet kan variere fra 5: 1 og opptil 20: 1. I tillegg kan volumet av vandig fase senkes ned til 50 pl. I dette arbeidet sammenstillingen av WSCP med Chl a er presentert. Likevel er det også mulig å montereWSCP med andre hydrofobe Chls, BChls og deres derivater. Foreløpig tester vi vårt system med andre vannløselige pigmentbindende proteiner som FMO og PCP.

Selv om vår metode er rask og enkel er det noen viktige skritt som må vurderes i løpet av W / O forberedelse og tilberedning av WSCP med CHL. De hetteglass, som brukes for emulsjon forberedelse, må være ren og fri for vaskemiddel. Selv små mengder vaskemidler i hetteglass vil påvirke emulsjon forberedelse og resultere i lav kvalitet på emulsjon. I tillegg bør hetteglassene være helt tørr. Annet kritisk punkt, som kan innvirke på effektiviteten rekonstituering, er grundig dispersjon av Chl i organisk fase av emulsjonen. Derfor er det viktig å fullstendig blande et lite volum av Chl i 5 ml emulsjon. Det er også viktig å gjøre så mange trinn som nødvendig for å bryte ned emulsjonen og fjerne mineralolje fra vannfasen. Eventuelle rester av mineralolje i vann phase kan påvirke ytterligere eksperimenter.

W / O-emulsjon er en alternativ tilnærming for fremgangsmåten etablert av Schmidt et al. 11, som var basert på immobilisering His-tagget WSCP på affinitetskromatografikolonne og inkubering med Chls. Selv om fremgangsmåten ifølge Schmidt et al., Vist seg å fungere for forskjellige WSCPs, krever det His-merkede proteiner, og kan føre til ikke-spesifikk binding av Chls ved ligering til histidiner av koden. Videre immobilisering av proteiner på en fast overflate kan påvirke proteinstruktur og dermed også de- monteringsprosessen med pigmenter. I tillegg ble Chl, som ble brukt for sammensetning av WSCPs i dette systemet oppløst enten i buffer inneholdende vaskemidler eller 40% metanol 11,12. Slike oppløsningsmidler kan resultere i pigment aggregering og / eller ikke-spesifikk binding til Chl WSCP. Vårt nye rekonstituering system basert på W / O-emulsjon ikke er avhengig av å immobilisere proteiner til faste bærer. therefore, ingen rensning tag kondensert til WSCPs nødvendig, og rekombinante proteiner med nativ sekvens kan monteres. En annen viktig fordel med W / O-fremgangsmåten er å minimalisere pigmenter aggregering som kan innvirke rekonstituering effektivitet, oligomerisering og pigment / protein-støkiometri. Dette er fordi de hydrofobe pigmenter oppløses i oljefasen og deres innføring i W / O-dråper aktiveres av den høye overflate i forhold til volum av den sistnevnte. Videre er uspesifikk binding av Chls etter WSCP er omgått siden hydrofobe pigmenter ikke kan diffundere mellom organiske og vandige faser av emulsjonen. Bare pigmenter som er aktivt montert av WSCP i løpet av rekonstitusjon kan gå inn i vannet mikrodråpene i emulsjonen.

Fremgangsmåten for montering WSCP med pigmenter ved blanding WSCP med isolerte thylakoids 10 er lik W / O-emulsjon system presenteres her. Det krever vaskemidler eller organiske løsemidler for solubilizing de Chls eller tagging proteiner. Imidlertid kan W / O-fremgangsmåten kan brukes med alle pigmenter som er oppløselig i oljefasen, mens den foregående metode er begrenset til Chls som er opprinnelig tilstede i thylakoid membraner. Dermed er montering med ren Chl a eller Chl d mulig fra fordi disse er tilgjengelige fra cyanobakterietoksiner thylakoids av f.eks. Synechocystis PCC 6803 eller Acaryochloris marina, henholdsvis. Det er imidlertid ikke mulig å rekonstituere WSCP med Chl b siden dette pigmentet er alltid akkompagnert av Chl en i thylakoids. Som kontrast kan WSCP montering i W / O emulsjon testes med noen naturlige eller kunstige CHL, BChl eller porfyriner derivater. Det krever ikke bruker foto membraner og dermed er det fritt for forstyrrelser av utenommembrankomponenter som phycobilisome som kan være knyttet til cyanobakterietoksiner membraner. W / O-fremgangsmåten er bare begrenset av oppløseligheten av pigmenter i oljefasen ennd derfor egnet for WSCP montering med noen naturlige eller kunstige CHL, BChl eller porfyriner derivater.

I sammendrag, presenteres vi her en generell fremgangsmåte for sammenstilling av vannløselige proteinene med hydrofobe pigmenter. Dens fordeler av ble demonstrert ved en vellykket montering av Chl en med forskjellige rekombinante WSCPs fra Brassica planter som tydelig indikert ved spektroskopiske og biokjemiske resultater. I tillegg demonstrerte vi hvordan W / U-enheten protokollen kan brukes for rask screening av WSCP / Chl kompleks sammenstilling ved hjelp av E. coli-cellelysatene overekspresjon rekombinante WSCPs og råolje CHL ekstrakter. På denne måten kan vi hoppe over tidkrevende proteinrensetrinn og behovet for å bryte emulsjoner for å separere vanndråper fra den organiske fase kan også unngås ved hjelp av fluorescens mikroskopi for direkte visualisering av sammenstillingen i vanndråper. Den generelle anvendelighet av den nye fremgangsmåten gjør det til en brukerful verktøy for å studere kofaktor bindende og montering, og energi- og elektronoverføringsmekanismer i trans protein-kofaktor komplekser ved å designe og konstruere sine forenklede kunstige vannløselige protein analoger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

DN erkjenner støtte fra EU FP7 prosjekter PEPDIODE (GA 256 672) og REGPOT-2012-2013-1 (GA 316 157), og en personlig forskningsstipend (nr 268/10) fra Israel Science Foundation. Vi takker professor Shmuel Rubinstein, School of Engineering og Applied Sciences, Harvard University, Cambridge, MA, USA for å ta konfokalmikroskopi bilder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mineral oil Sigma M5904
Span80 Sigma 85548
Tween80 Sigma P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges Bio Rad 10011164 Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence.
His Trap HF column GE Healthcare Life Science 17-5248-02 Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow GE Healthcare Life Science 17-0709-01 Chromatography medium for chlorophyll purification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bryant, D. A., Frigaard, N. -U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
  2. Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria. Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).
  3. Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates. Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).
  4. Renger, G., et al. Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes. J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).
  5. Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein. Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).
  6. Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique. Planta. 236, 251-259 (2012).
  7. Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants. J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).
  8. Horigome, D., et al. Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein. J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).
  9. Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -P., Reinbothe, S. A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide. Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).
  10. Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower. J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).
  11. Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives. Biochemistry. 42, 7427-7433 (2003).
  12. Takahashi, S., et al. Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera). Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).
  13. Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish. J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).
  14. Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).
  15. Hughes, J. L., et al. Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls. J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).
  16. Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions. BBA - Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).
  17. Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation. J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).
  18. Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts. Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).
  19. Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum. Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).

Tags

Chemistry Vann-oppløselige klorofyll bindende protein (WSCP) vann-i-olje-emulsjon klorofyll pigment-protein montering UV-synlig absorbans sirkulær dikroisme (CD)
Vann i olje emulsjoner: Et nytt system for Montering Vannløselige Klorofyll bindende proteiner med Hydrofobe Pigmenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bednarczyk, D., Noy, D. Water in Oil … More

Bednarczyk, D., Noy, D. Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments. J. Vis. Exp. (109), e53410, doi:10.3791/53410 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter