Introduction
I de senere år kolonne teknologi for High Performance Liquid Chromatography (HPLC) har avansert sterkt; peak kapasiteter har økt betydelig mye takket være bruken av mindre partikkelstørrelser, og de mer effektive kjerneskallpartikler. Siden separasjoner er generelt mer effektive, har en flyt på effekten vært en økning i følsomhet siden toppene er nå skarpere og dermed høyere 1-8.
Likevel er radial seng heterogenitet fremdeles en begrensende faktor i utførelsen av alle kolonner, men dette er ikke en ny historie siden chromatographers har kjent dette i mange år. Kolonne senger er heterogene i både radiell retning 9-12, og langs søyleaksen 10,12-15. Veggen-effekt spesielt er en viktig bidragsyter til tap av separasjon ytelse 7,16-18. Shalliker og Ritchie 7 nylig anmeldt aspekter av kolonnen seng heterogenitet og dermed dette trenger ikke være discussed her lenger. Selv om det tilstrekkelig å si, at variasjonen i kolonnepakketetthet og veggen effektene fører til en forvrengning av den oppløste substans pluggen, slik at båndene ble eluert gjennom kolonnen i plugger som ligner delvis fylt suppe skåler i stedet for tynne, flate faste plater 7 som er vanligvis avbildet i grunnleggende undervisningstekster. Når forsøk ble foretatt slik at oppløsningsmaterialet migrering gjennom sjiktet kan bli visualisert pluggprofilene inne i kolonnen var delvis hul og haleseksjonen av båndet er stort sett den veggkomponent av prøven pluggen. Sluttresultatet er at det tar mange flere plater for å skille disse "delvis hul 'plugger enn det som ville være nødvendig hvis skivene var solid og flat 12,14,17. For å overvinne bandet bredere problemstillinger knyttet til vegg effekter og variasjonen i radialpakketetthet, ble en ny form for kolonne teknologi kjent som Active Flow Technology (AFT) designet 7,19. Hensikten med dette designet varfor å fjerne vegg effekter via fysisk separasjon av oppløsningsmiddel som elueres langs veggområdet, fra den for mobil fase eluering i radial sentrale regionen av kolonnen 19. Det finnes to hovedtyper av AFT kolonner; Parallelle segmentert Flow (PSF) kolonner og Curtain Flow (CF) kolonner 7. Siden denne protokollen er rettet mot bruk og optimalisering av CF kolonner, PSF kolonner vil ikke bli nærmere omtalt.
Gardin Flow (CF)
Gardinstrømnings (CF) kolonne formater utnytte AFT endebeslag på både innløpet og utløpet av kolonnen. AFT endebeslag består av en ringformet frit plassert inne i et multi passende. Fritten består av tre deler: en porøs radial sentral del som er på linje med den sentrale porten på endestykket, en porøs ytre del som er på linje med den ytre port (er) av endestykket, og en ugjennomtrengelig ring som skiller de to porøse deler og hindre eventuelle kryssmold flyt mellom de radiale sentrale og ytre områder av fritten 19. Figur 1 illustrerer konstruksjonen av AFT fritte og Figur 2 viser CF kolonneformat. I denne operasjonsmodus (CF) prøven injiseres i radial sentral port av innløpsrøret, mens andre mobil fase innføres gjennom den perifere port av innløpet til "gardin" migrasjon av oppløste stoffer gjennom det radiale midtområdet av søyle. Derav prøven kommer inn i sjiktet i radial sentrale regionen av kolonnen med det ytre område av kolonnen med mobil fase bare passerte gjennom den. Studier har vist at en volumetrisk strømningshastighet forhold på rundt 40:60 (av typen: perifert port) for innløpsenden montering av en 4,6 mm indre diameter (ID) kolonne er optimal 6,7,16. Den aktre utløp CF kolonnen tillater justering av det sentrale og perifere strømnings til deres relative andel og kan varieres på nesten hvilken som helst ønsket Ratio gjennom trykkstyring. Optimalisering av et CF kolonne kan forbedre ulike funksjonelle aspektene av kolonnen teknologi, for eksempel separasjonseffektivitet eller følsomhet. På denne måten en "vegg-mindre", "uendelig-diameter" eller "virtuelle kolonnen er etablert 6,10,18,20. Hensikten med CF kolonner er å aktivt styre migrering av prøven gjennom kolonnen for å forhindre at prøven fra å nå frem til veggområdet. Således blir det oppløste stoffet konsentrasjon på utgang til detektoren maksimert, og øker følsomheten på ca. 2,5 ganger større enn den konvensjonelle kolonne-format ved bruk av ultrafiolett (UV) deteksjon 16, og enda større ved bruk av masse-spektrale deteksjon 6.
CF kolonner er ideell for lav konsentrasjon prøvene, siden detekteringssensitiviteten økes. Videre, de er ideelle når koplet til strømningshastighet begrenset detektorer, slik som massespektrometer (MS) 6. en AFT-kolonne i en 4,6 mm id format, for eksempel kan være innstilt til å levere det samme volumet av oppløsningsmiddel til en detektor som en standard 2,1 mm kolonne id format når opereres ved de samme lineære hastigheter, ved å justere avslutter sentrale strømnings til 21%. Likeledes AFT-kolonnen kan også være innstilt til å levere den samme volumbelastningen til en detektor som en 3,0 mm ID-kolonne, ved å justere avslutter sentrale strømnings til 43%. Faktisk noen "virtuelle" kolonneformatet kunne bli produsert for å dekke den analytiske krav 6,18,22. Ved hjelp av disse spesielt utformede endebeslag ved innløpet og utløpet sørger for at en sann vegg mindre kolonne er etablert.
Det er to måter å sette opp løsemiddel leveringssystemet til de sentrale og perifere havner i innløpet. Split-flow system seks og to pumpesystem 6,7 Figur 3 illustrerer hver av disse CF system sett ups.
Split-flow-system
jegna split-flow-system (figur 3A) pumpestrømningen som fører til injektoren er delt pre-injektor ved anvendelse av en null-dødvolum T-stykke, hvor en strømning av mobil fase er forbundet med injektoren, som deretter kobles til sentral port av innløpsenden montering av kolonnen. Den andre strømnings strøm av mobil fase by-pass injektoren og er forbundet med den ytre port på innløpet av kolonnen. Under oppdeling av strømningen, blir strømningen prosent justert til 40:60 (sentrum: perifert) før linjene er koblet til kolonnen, det vil si, fra injektor for å sentrere og pumpe til perifert.
To pumpesystem
CF-kolonne krever to strømningsstrømmer ved innløpsenden montering av kolonnen. Avhengig av typen av prøvetageren / injektor av den HPLC-instrument, split-flow satt opp kan ikke være mulig, og slik at CF kan da oppnås gjennom 2 pumper (figur 3B) 21. Hver pumpe er tilordnet og koblet til enten den sentrale eller perifere port og strømningshastigheten er innstilt til å representere 40% av strømningen for den sentrale åpning og 60% for perifer port. For eksempel, hvis den totale strømningshastigheten er 1,0 ml min-1, er den sentrale pumpestrømningshastighet innstilt på 0,4 ml min -1 og den perifere pumpen er innstilt på 0,6 ml min-1.
Valget av hvilken virkemåte er i stor grad avhengig av HPLC-instrumentering og kromatografisk virkemåte. For eksempel i noen autosamplers en endring i trykk mellom prøvebelastning stilling og prøven injisere stilling kan forekomme forstyrre split-flow ratio, og således i dette tilfelle en dobbeltpumpe satt opp vil bli anbefalt for optimal CF ytelse. Uavhengig av løsningsmiddelavgivelsessystemet satt opp valgt for innløp av CF-kolonne, forblir CF utløp optimaliseringen den samme. Utløpet sentrale port av CF-kolonnen er festet til den ultrafiolette-synlige (UV-Vis) detektor med smalforat volum mulig av røret for å minimere effekten av post-kolonne dødvolum. Siden, CF kolonner ligne smal Boret kolonner, er død volum mellom kolonne utløp og melderen skadelig for separasjon ytelsen til CF kolonnen. Det er avgjørende for å sikre den minste mengden av volumet av røret mellom den sentrale port og UV-Vis detektor for å minimalisere virkningene av dødvolum som bandets utvidelse, tap i effektivitet og følsomhet. Derfor er bruk av smale boring rør (0,1 mm id) anbefales å lett la press justeringer uten å legge upassende dødt volum. Tubing er også knyttet til det perifere port og ledet til avfall. Ved utløpet av CF-kolonnen, kan segmentering forholdet justeres til hvilket som helst forhold som passer til formålet med analytikeren. Når en 4,6 mm id CF brukes, for eksempel, er det ofte hensiktsmessig å sette forholdet som enten 43:57 eller 21:79 (senter: perifer) for å etterligne en "virtuell" 3.0 mm id kolonnen eller 2,1 mm id kolonne,respektfullt. På den måten separasjon ytelsen er lett benk-merket. Segmenteringsforholdet blir målt ved å veie mengden av strømning som kommer ut fra den detektor som er koplet til den sentrale port og strømmer som kommer ut av omkrets port over en periode tid. Den prosentvise strømning gjennom hver port kan deretter bestemmes og forholdene kan justeres ved å endre lengden av røret er festet, eller ved hjelp av rør som har en annen innvendig diameter (id).
Denne videoen protokollen detaljer drift og optimalisering prosedyrer for et CF kolonne for forbedret kromatografisk ytelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsiktig: Se sikkerhetsdatablad (HMS) for alle materialer og reagenser før bruk (dvs. datablad for metanol). Sørg for bruk av alle nødvendige sikkerhetsrutiner ved håndtering av løsemidler og High Performance Liquid Chromatography (HPLC) elueringsmiddel. Sørg for riktig bruk av tekniske kontroller av HPLC, analytisk balanse og detektor instrumentering, og sikre bruk av personlig verneutstyr (vernebriller, hansker, frakk, full lengde bukser og lukket-toe sko).
Merk: Denne protokollen inneholder instruksjoner om hvordan du bruker en CF-kolonne på et HPLC-system kombinert med en UV-Vis-detektor. Protokollen er skrevet forutsatt at leseren har grunnleggende kunnskap og erfaring i kromatografi.
1. Oppsett av HPLC Instrument
Merk: Denne delen kan bli endret for å passe analytikernes behov, dvs. valg av løsemidler, detektor bølgelengde og strømningsrate sompasser til prøven av interesse.
- Klargjør HPLC-instrument med 100% ultrarent vann (Milli-Q-vann) for linje A og 100% metanol i linje B som den mobile fase og rense pumpene i henhold til produsentens behov.
- Sett UV-Vis-detektor til 254 nm.
- Velg enten en pre-injeksjon flyt delt modus av set-up, eller en dobbel pumpeflow oppsett. For split-flow modus videre til trinn 2, for dobbeltpumpemodus videre til trinn 3.
2. Split-flow System Setup
- Koble pumpeledningen fra injektoren ventil av den auto-sampler.
- Fest et T-stykke til pumpeledningen.
- Fest en 15 cm stykke 0,13 mm id slangen til hver port av T-stykke.
- Koble den ene slangen fra T-stykke til injeksjonsventilen av auto-sampler.
- Sett pumpen på 1,0 ml min-1.
- Før tilkobling av pumpeledningene til innløpet av CF-kolonne, tune segmentering forholdet mellom strømnings til 40%: 6 0% (midtlinje: perifer linje) som følger i trinn 2.7.
- Tuning av CF innløp ratio på split-flow system
- Måle massen til to tomme oppsamlingsfartøy ved hjelp av en analytisk balanse og merke en oppsamlingsbeholder sentrale og den andre en perifer (en for linje fra auto-sampler å sentrere port og en for linje fra T-stykke til perifer port) .
- For 1,0 min, samler den utgå mobile fasen fra den linje som kommer fra injektoren (på det punkt som vil bli koblet til den kolonne) inn i oppsamlingsbeholderen, hvis masse ble målt i 2.7.1.
- Re-veie oppsamlingsbeholderen på den analytiske målestokk og bestemme massen av mobil fase oppsamlet.
- Gjenta trinn 2.7.2 til 2.7.3 for elueringsmiddelet som kommer ut av linje fra den T-del som skal kobles til den perifere port.
- Bestemme prosentandelen av strømnings (ml min-1) fra hver linje av strømningen i henhold til de følgende ligninger:
1 "src =" / files / ftp_upload / 53471 / 53471eq1.jpg "/> - Juster strømningsforholdet til 40%: 60% (± 2%) (linje fra injektor til sentrale port: linje fra T-stykke til perifere port). Hvis linjen fra injektoren til den sentrale porten strømningsprosentandelen er over 40%, øker trykkfallet ved å redusere den indre diameter av røret eller å øke dens lengde. Hvis linjen fra injektoren til sentral port strømningsprosenten er under 40%, øke indre diameter av røret eller redusere lengden av røret.
- Når strømforhold er innstilt slå pumpen renne ut.
- Koble linjen fra injektoren til den sentrale port av kolonne innløp til og linjen fra T-stykket til den perifere port av kolonnen innløp den.
- Sakte rampe strømningshastigheten til 1,0 ml min -1 ved 100% linje B.
- Ekvilibrere kolonnen (4,6 mm ID x 100 mm lengde) ved å tillate100% Metanol (linje B) mobil fase til å strømme gjennom kolonnen ved 1,0 ml min-1 i 10 min. Denne gang er skalert i henhold til dimensjonene av andre kolonner kan brukeren benytter.
- For justering av CF uttaket gå til trinn 4. "Tuning av CF utløp flyt".
3. Dual Pump System Setup
- Koble HPLC-systemet pumpen til injektoren, og deretter koble linje fra injektoren til den sentrale innløpsporten av kolonnen.
- Forbinde den ekstra pumpe direkte til innløpsperiferutstyrs av kolonnen. Legg merke til at denne andre pumpe by-pass injektoren.
- Rampe strømningshastigheten for systemets pumpe som er koplet til den sentrale port til 0,4 ml min-1 (representativ for 40% av den totale strømningshastigheten på 1,0 ml min-1) ved 100% Metanol (linje B).
- På samme tid som trinn 3,3, gradient strømningshastigheten av den perifere pumpen til 0,6 ml min-1 (representativ for 60% av den totale strømningshastigheten1,0 ml min-1) ved 100% Metanol (linje B).
- Ekvilibrere kolonnen (4,6 mm ID x 100 mm lengde) ved å la 100% Metanol (linje B) mobil fase til å strømme gjennom kolonnen ved 1,0 ml min-1 i 10 min. Denne gang er skalert i henhold til dimensjonene av andre kolonner kan brukeren benytter.
- For justering av CF uttaket gå til trinn 4. "Tuning av CF utløp flyt".
4. Justering av CF Outlet Flow
- Koble den sentrale utløpsporten til den UV-Vis-detektor ved bruk av en 15 cm stykke av 0,13 mm ID-røret.
- Koble en 15 cm stykke av 0,13 mm id slangen til det perifere utløpsåpningen av CF-kolonne.
- Vei massen av to tomme oppsamlingsfartøy på analytisk balanse og merke ett fartøy sentral og annet perifer.
- For 1,0 min, samler den utgå mobile fasen fra den UV-Vis detektor (sentral strømnings) inn i oppsamlingsbeholderen etikett av typen, hvis masse ble målt i 4.2.
- Re-veie oppsamlingsbeholderen som inneholder det oppsamlede elueringsmiddel på den analytiske målestokk og bestemme massen av mobil fase oppsamlet.
- Gjenta trinn 04.04 til 04.05 for elueringsmiddel avslutter linje fra perifere utløpsåpningen.
- Bestemme prosentandelen av strømning fra hver linje av strømningen i henhold til de følgende ligninger:
- Juster strømningsforholdet til 21%: 79% (± 2%) (sentral utløpsstrømmen fra UV-vis: perifer utløpsstrømmen fra linje). Når den sentrale strømningsprosentandel fra UV-Vis er over 21%, øker trykkfallet ved å redusere den indre diameter av røret er festet til utgangen av UV-Vis detektor, eller ved å øke dens lengde. Dersom den sentrale strømningsprosentandel fra UV-vis er under 21%, øke indre diameter av røret er festet til utgangen av UV-Vis detektor, eller redusere lengden av røret. Hver gang lengden på slangen har blitt endret, gjentartrinn 04.03 til 04.07.
Merk: CF kolonnen i "virtuelle" 2,1 mm id-modus er klar for analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AFT kolonner ble utviklet ved hjelp av en spesialisert frit design (figur 1) i multikolonneendebeslag til å overvinne kolonne seng heterogenitet i og forbedre separasjons ytelse. En inter-laboratorium studie om separasjon ytelsen til CF kromatografikolonner (figur 2) ble gjennomført med et dobbelt pumpesystem satt opp (figur 3B) som beskrevet i kapittel 3 i denne protokoll 23. En tre-komponent testblandingen ble analysert under via en "virtuell" 2,1 mm id hvor 21% av den sentrale utløpsstrømmen fra CF-kolonnen ble sendt til detektoren. Separasjonen av en tre-komponent test blanding illustrerer forbedret ytelse når det gjelder effektivitet og følsomhet, av en CF kolonne i forhold til standard kolonner. De tre komponent test blanding inneholdt fenetol, butylbenzen og pentylbenzene og ble analysert på konvensjonelle 4,6 og 2,1 mm id søyler og en 4,6 mm id CF kolonne med en segmentering forhold på 22:78 (senter: perifer) for å etterligne en 2,1 mm id (figur 4). Separasjon effektivitet ble evaluert i form av kimtall (N), og følsomhet. Bruken av CF-kolonnen for analyse viste en nedre deteksjonsgrense (figur 5) og en økning i følsomhet (figurene 4 og 6) sammenlignet med konvensjonell kolonne analyser. Det ble også funnet at uten hensyn til laboratoriet eller type HPLC-system som anvendes, separasjonsytelse resultat for CF-kolonnen var forholdsvis det samme, alle resulterer i bedre separasjonsytelse ved anvendelse av CF-kromatografikolonner 23.
Figur 1. Illustrasjon av Active Flow Technology kolonne slutten sittende fritte design. OAD / 53471 / 53471fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. AFT kolonne -. CF-kolonne-format Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Sett opp fra CF kolonne innløpsstrømmen i (A) split-flow systemoppsettet og (B) to pumpesystemoppsettet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
/53471fig4.jpg "/>
Figur 4. En typisk separasjon av tre komponenter testblanding oppnådd ved å anvende den ultimate 3000 system. (A) Konvensjonell 4,6 mm ID-kolonne, (b) Konvensjonell 2,1 mm ID-kolonne, (c) Gardin strømningskolonne som arbeider med en 22% utløp segmentering forhold. Løste stoffer: (i) fenetol, (ii) butylbenzen og (iii) pentylbenzene. Dette tallet er hentet fra 23. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Eluering båndprofiler butylbenzen ved påvisningsgrensen på (a) den konvensjonelle kolonne, og (b) gardin strømnings kolonnen System:. Shimadzu på 2,0 ml / min, 5 ul injeksjon, deteksjon ved 254 nm. Dette tallet er hentet fra
Figur 6. Sammenligning i elueringsprofiler av butylbenzen fremskaffet på den ultimate 3000 system. (A) den konvensjonelle 4,6 mm ID-kolonne, (b) den konvensjonelle 2,1 mm ID-kolonne, (c) gardin strømnings kolonnen med en 22% utløp segmentering forhold. Dette tallet er hentet fra 23. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien involverte interlaboratorieanalyse av CF kromatografikolonner å teste den analytiske ytelsen når det gjelder effektivitet og følsomhet. CF Kolonnen ble satt opp med en dobbel pumpesystem som beskrevet i avsnittet "tre. To pumper systemet satt opp "for å oppnå et strømningsforhold på 40:60 (sentrum: perifert) på innløpet til CF-kolonnen. Den 40:60 (sentrum: perifert) Flytforholdet ble oppnådd ved å sette strømningshastigheten for hver pumpe til den verdi som representerer 40% og 60% av den totale strømningshastighet, henholdsvis. CF kolonne uttaket ble innstilt til et "virtuelt" kolonnen med en id på 2,1 mm ved å følge prosedyren beskrevet i avsnittet "fire. Tuning av CF utløp flyt ". En prøveblanding inneholdende fenetol, butylbenzen og pentylbenzene ble anvendt som en teststandard for en separasjonsytelse sammenligning mellom en 4,6 mm id CF-kolonne (22:78) og konvensjonelle 4,6 og 2,1 mm id kolonner. Figur 4 er en overlapping av Chromatogrhic separering av testblandingen foretas ved hjelp av hver av de tre kolonner. Den største forskjellen observert i denne figur er den betydelige økningen i signalrespons for separasjon oppnådd ved anvendelse av CF-kolonnen. Den signalrespons for 4,6 og 2,1 mm id konvensjonelle kolonner var nesten identiske som forventet som kromatografiske betingelser ble skalert for å matche den tverrsnittsflate av søylene.
Linearitet og påvisningsgrenser ble også vurdert mellom CF og konvensjonelle operasjonsmodi, hvor en serie av standarder ble fremstilt og analysert i replikater på forskjellige HPLC-systemer med forskjellige strømningshastigheter. Uavhengig av hvilken HPLC-system ble anvendt og til hvilken strømningshastighet resultatet av analysen var i det vesentlige den samme, hvor den signalrespons for CF var alltid vesentlig større enn de andre konvensjonelle kolonner. Signalrespons gevinstene var typisk mellom 1,7 og 2,8 ganger større enn de konvensjonelle kolonner. En 5-foldforbedring i nøyaktigheten av målinger (dvs. relativt standardavvik - RSD%) av topphøyde for den laveste standardserie ble observert for CF-modus for operasjonen ved 22% sammenlignet med den konvensjonelle 2,1 mm ID-kolonne. CF forbedrer presisjonen av toppverdier på grunn av økningen i følsomhet som oppnås ved CF. Jo større signalrespons jo lavere RSD verdi. Således, som en følge av forbedret signalresponstopp presisjon er også forbedret, også effektivitet er høyere, slik at båndene hale mindre og følgelig toppintegrering er mer presis. Grensene for forvaring og kvantifisering bruker CF søyler med et uttak segmentering forhold på 22:78 (senter: perifert). Det ble også forbedret med opptil 2,3 ganger enn vanlig 2,1 mm id kolonne 23 Figur 5 illustrerer nær deteksjonsgrensen respons for butylbenzen peak under CF forhold og konvensjonelle betingelser.
Et viktig aspekt til compost mellom CF og konvensjonelle kolonner som ikke er synlig i figur 4 er den reduksjon i maksimal volum for analyttene i prøvene i henhold til CF-forhold. Figur 4 viser toppene i forhold til tid, men siden i CF-modus bare en del av totale vannmengden blir brukt, toppbredden kan justeres med hensyn på volum. figur 6 sammenligner den butylbenzen elueringsprofilen med hensyn til topp volum for CF (22:78) som emulerer en "virtuell" 2,1 mm id, et konvensjonelt 4,6 mm iD-kolonne og et konvensjonelt 2,1 mm id toppen volumet mellom CF og de konvensjonelle 2,1 mm kolonner var nesten identisk, men toppen volumet av den konvensjonelle 4,6 mm kolonne var omtrent 5 ganger større enn både konvensjonelt 2,1 mm og CF (22:78) . Viktigere, ble reduksjonen i toppvolumet i CF-modus ikke resultere i en reduksjon av signalrespons, men snarere en økning på nesten 3 ganger enn for de konvensjonelle kolonner regardless av innvendig diameter 23. Selv om en reduksjon i maksimal volum ikke kan være viktig for UV-Vis-deteksjon, kan det samme ikke sies om påvisningsfremgangsmåter som er strømningshastighetsavhengig eller begrenset, f.eks massespektrometer eller evaporativ lysspredningsdetektor.
Ulempen til CF virkemåte som det av smalere Boret konvensjonelle kolonner er dens mottakelighet for effekten av post-kolonne dødt volum, som i betydelig grad kan forringe separasjon ytelse ved å forårsake bandet bredere og forfall i signalintensitet. Imidlertid er dødvolumet ved innløpet mindre viktig. Dermed er nødvendig for optimal CF separasjon ytelse på grunn av omsorg for å etter kolonne slange. CF-kromatografi er en ganske ny form for kolonne teknologi som har et stort potensial i fremtidige søknader. For eksempel, injeksjon av en lav konsentrasjon prøve inn i sentrum av CF-kolonne, er "gardiner" av veggen (perifert) mobil fase concentvurdering av prøven i midten av CF-kolonnen, og således maksimalisere signalrespons. Ved utløpet bare den sentrale flyt som inneholder "konsentrert" prøven er tatt til detektoren, som gir en økning i følsomhet, ideelt for høyhastighets analyse ved hjelp av høye strømningshastigheter på flyt begrensede detektorer som MS 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC instrument | |||
| Additional Pump | Required if 2 pump CF system set up is to be used. | ||
| Curtain Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialized |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels | |
| T-piece | Any brand |
References
- Camenzuli, M., et al. The use of parallel segmented outlet flow columns for enhanced mass spectral sensitivity at high chromatographic flow rates. Rapid Commun. Mass Sp. 26 (8), 943-949 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr. A. 1232 (0), 47-51 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr. A. 1270 (0), 204-211 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111 (0), 3-7 (2013).
- Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803 (0), 154-159 (2013).
- Kocic, D., et al. High through-put and highly sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry separations of essential amino acids using active flow technology chromatography columns. J. Chromatogr. A. 1305 (0), 102-108 (2013).
- Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr. A. 1335 (0), 122-135 (2014).
- Shellie, R., Haddad, P. Comprehensive two-dimensional liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 386 (3), 405-415 (2006).
- Abia, J. A., Mriziq, K. S., Guiochon, G. A. Radial heterogeneity of some analytical columns used in high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1216 (15), 3185-3191 (2009).
- Knox, J. H., Laird, G. R., Raven, P. A. Interaction of radial and axial dispersion in liquid chromatography in relation to the "infinite diameter effect". J. Chromatogr. A. 122 (0), 129-145 (1976).
- Miyabe, K., Guiochon, G. Estimation of the column radial heterogeneity from an analysis of the characteristics of tailing peaks in linear chromatography. J. Chromatogr. A. 830 (1), 29-39 (1999).
- Shalliker, R. A., Scott Broyles, B., Guiochon, G. Axial and radial diffusion coefficients in a liquid chromatography column and bed heterogeneity. J. Chromatogr. A. 994 (1-2), 1-12 (2003).
- Gritti, F., Guiochon, G. Effects of the thermal heterogeneity of the column on chromatographic results. J. Chromatogr. A. 1131 (1-2), 151-165 (2006).
- Shalliker, R. A., Wong, V., Broyles, B. S., Guiochon, G. Visualization of bed compression in an axial compression liquid chromatography column. J. Chromatogr. A. 977 (2), 213-223 (2002).
- Tallarek, U., Albert, K., Bayer, E., Guiochon, G. Measurement of transverse and axial apparent dispersion coefficients in packed beds. AICHE J. 42 (11), 3041-3054 (1996).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. J. Sep. Sci. 35 (3), 410-415 (2012).
- Shalliker, R. A., Broyles, B. S., Guiochon, G. Physical evidence of two wall effects in liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 888 (1-2), 1-12 (2000).
- Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column. J. Chromatogr. A. 1262 (0), 64-69 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).
- Foley, D., et al. Precision and Reliability: an Intercontinental Study of Curtain Flow Chromatography. Thermo Scientific. , (2013).
- Pravadali-Cekic, S. Multidimensional Approaches for the Analysis of Complex Samples using HPLC. University of Western Sydney. , PhD thesis (2014).
- Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116 (0), 230-234 (2014).
- Foley, D., et al. Curtain flow chromatography ('the infinite diameter column') with automated injection and high sample through-put: The results of an inter-laboratory study. Microchem. J. 110 (0), 127-132 (2013).
