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Developmental Biology

Clonage fonctionnelle en utilisant un doi: 10.3791/53518 Published: January 30, 2016

Protocol

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Toutes les procédures expérimentales ont été approuvés par l'Université de Virginie institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.

Remarque: La figure 1 montre une vue d'ensemble schématique des modes opératoires expérimentaux.

1. Préparation d'ovocytes

  1. X. Pré-prime laevis femelles avec 150 U de jument gravide gonadotrophine sérique (PMSG) environ une semaine à l'avance de l'isolement de l'ovocyte. Injecter 1 ml 150 U / ml PMSG dans dorsale lymphatique sac avec 1 cc seringue stérile avec aiguille 29 G.
  2. Préparer des solutions pour l'injection d'ovocytes et le Cap-dosage ovocyte animal.
    1. Préparer Ca ++ / Mg ++ exempt OR2 (OR2-): NaCl 82 mM, 2,5 mM de KCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4, HEPES 50 mM pH 7,2.
    2. Préparer OR2: OR2- plus 1 mM de CaCl2 et 1 mM de MgCl2.
    3. Préparer OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml de BSA, 100 ug / ml de gentamycine à pH 7,8.
    4. Pré1x pare MBS: 88 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 0,7 mM de CaCl2, 1 mM de MgSO 4, 5 mM de HEPES (pH 7,8), 2,5 mM de NaHCO 3.
    5. Préparer 3% de Ficoll en 1x MBS.
    6. Préparer NAM 1x: 110 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de Ca (NO 3) 2, 1 mM de MgSO 4, 0,1 mM d'EDTA, 1 mM de NaHCO 3, 2 mM de Na 3 PO 4 à pH 7,4.
  3. Anesthésier la femelle dans une solution à 0,03% de sel de méthanesulfonate d'éthyle 3-aminobenzoate (MS222) à 0,1x MBS (première dissoudre 0,3 g dans 10 ml MS222 95% d'éthanol, puis diluer à 1 L 0,1x MBS) en plaçant grenouille solution pour 10 - 15 min ou jusqu'à ce que ne répond pas.
    1. Vérifiez que l'anesthésie est complète en tournant grenouille anesthésié sur le dos pour vous assurer qu'il ne répond pas (incomplètement grenouilles anesthésiés déplacer membres ou du corps au verso).
  4. Isoler des fragments de l'ovaire par voie chirurgicale en faisant une incision abdominale à travers la peau et la paroi du corps de lame de scalpel, l'isolement du tissu ovarien avec une pinceet ciseaux. Placez fragments ovariens dans OR2-. Fermez la paroi du corps avec une suture 3-0 en soie sur une aiguille courbe de 24 mm et fermer la peau séparément avec les mêmes points de suture. Permettre la récupération des femmes dans 1 g / L aquarium sel dans l'eau.
  5. En utilisant des pinces fines, tissu ovarien lacrymogènes dans les petites (10 - 20) pièces ovocytes et transfert à OR2- frais.
  6. Defolliculate fragments ovariens dans 2,0 mg / ml de collagénase A en agitant doucement par OR2- sur agitateur pendant 1 heure, le transfert de la collagénase fraîche et en agitant pendant une heure supplémentaire.
  7. Laver ovocytes 10 fois dans OR2 [contenant Ca ++ / Mg ++] en rejetant les petits ovocytes.
  8. Laver ovocytes dans OCM deux fois et transférer à nouveau OCM. Isoler ovocytes Etape VI selon la taille de l'inspection visuelle des ovocytes immatures et le jeter (plus petits): Etape VI ovocytes sont plus grandes que ovocytes immatures avec même pigmentation dans l'hémisphère des animaux et sont d'environ 1,2-1,4 mm de diamètre.
  9. Maintenir ovocytes à 18 - 20 ° C in OCM avant l'injection. Remarque: Les boîtes de Petri enrobées d'agarose-peuvent être utilisés pour réduire le collage des ovocytes à plat.

2. Injection d'Bibliothèque Transcriptions

  1. Préparer une banque d'ADNc directionnelle 15 en utilisant l'ARN extrait à un stade approprié de développement (par exemple, stade de la plaque neurale 14 10). Achetez une banque d'ADNc ou de construire un utilisant un kit commercial par la liste dans les quatre étapes ci-dessous.
    1. Isoler environ 5 pg de l'ARNm en utilisant un produit pour enrichir en poly (A) + ARN (voir le tableau des matériaux) et en suivant les instructions du fabricant. Remarque: Les relevés de notes à être utilisés pour produire la banque d'ADNc peut être limitée à un tissu induire (comme la plaque neurale, après microdissection des tissus désiré), ou peuvent être à partir d'embryons entiers à un stade particulier.
    2. Produire de l'ADNc avec un kit commercial, suivant les instructions du fabricant.
    3. Ligaturer environ 20 ng d'ADNc dans un vector inclus avec le kit commercial ou d'un autre vecteur approprié. Un vecteur plasmidique approprié comprend des séquences de stabilité de l'ARNm tel que 5 'et β-globine 3 poly (A) + pCS2 (séquences, pTnT, pCS105).
    4. Transformez ligature dans des cellules bactériennes compétentes en utilisant le protocole recommandé de fournisseur pour la transformation de choc thermique.
      Remarque: Alternativement, une collection de cadre de lecture ouvert (ORFéome) clones est disponible dans le commerce et peut être utilisé pour générer des transcriptions pour injection.
  2. Préparer 10 pools de plasmides sur 10 trois à quatre complexité dix (10 quatre à dix complexité de cinq au total). Cela représente 10 plaques avec 1.000 - 10.000 colonies chacun.
    1. Bibliothèque de plaque de culture sur 10 plaques de 15 cm LB-ampicilline, grandir 12 - 18 h à 37 ° C, et de recueillir des colonies de chaque par une légère pression avec un épandeur de verre dans 7 ml LB.
    2. Préparer un stock de glycérol de 0,5 ml (ajouter à 0,2 ml de glycérol stérile et conserver à -20 &# 730; C), et d'utiliser les 6,5 ml restants pour préparer l'ADN avec un standard du commerce kit ADN miniprep en suivant les instructions du fabricant.
  3. Linéariser l'ADN plasmidique groupé (1.0 - 2.0 ug) avec restriction appropriée enzyme digérer 16 à 37 ° C pour les 1 - 1,5 h. Isoler l'ADN linéarisé par extraction au phénol / chloroforme suivie d'une précipitation à l'éthanol et remise en suspension dans de l'eau selon les spécifications de la trousse d'ARN polymérase utilisée. Synthétiser l'ARN sens avec un kit d'ARN polymérase commerciale suivant les instructions du fabricant.
  4. Préparer aiguilles pour la micro-injection (à l'aide d'un extracteur d'aiguille avec un tube capillaire en verre) d'environ 20 um de diamètre; mesurer pointes d'aiguille sur un microscope composé avec un micromètre oculaire calibré. Remarque: Les paramètres de traction aiguille doit être déterminée empiriquement pour produire une aiguille avec une pointe fine telle que lorsque rompu avec une pince fine donne la taille de la pointe souhaitée.
  5. Préparer (pousser argile danscouche uniforme sur le fond du plat) argile bordée 35 x 10 mm boîtes de Pétri avec des rainures parallèles pour tenir ovocytes en place lors de la micro-injection; produire des rainures avec une sonde de centre commercial ou pipette Pasteur fusionné à la pointe de la flamme. Comme alternative à l'argile, de préparer des plats agarose faisant indentations avec un moule en élastomère 17. Ovocytes de transfert avec une pipette de gros calibre à 3% de Ficoll dans 1X MBS (environ 2 ml) en rangées dans les plats d'argile bordée.
  6. Utilisation microinjecteur, remplissez aiguille avec 1 ng / nl ARN et de régler la balance pour produire une légère pression positive (pour empêcher l'élaboration de cytoplasme de l'ovocyte).
  7. Injecter ovocytes avec environ 20 nl d'ARN dans la région équatoriale. Comptez 1 h pour les ovocytes injectés de rester dans Ficoll-MBS, puis transférer doucement pour 1x MBS. Incuber pendant 8-24 heures à 20 ° C avant l'essai de coiffe animale.

3. Animal Cap Assay

  1. Préparer 3 / 4x NAM et obtenir des pinces fines, boucle de cheveux, des fragments de lamelle incurvée, dis d'argile bordéehes avec indentations en forme de coupe de tenir ovocytes. Assurez fragments lamelle courbes par briser des lamelles de verre en petits fragments (environ 1 - 2 mm x 2 - 4 mm) et passant par flamme jusqu'à ce que les bords polonais et statisme, la production d'une pièce courbe.
  2. Fertiliser X. laevis oeufs 18 in vitro ou par accouplement naturel et de la culture à Gastrula stades (10 - 11 h après la fécondation à la température ambiante) à 0,1x MBS avant le tri par étape; recueillir mi-gastrula (stade de 11 à 11,5) 10 embryons.
  3. Embryons de transfert à une boîte de Pétri environ à moitié plein avec 3 / 4x Nam. L'utilisation de deux paires de pinces fines, retirez la fécondation (vitelline) membrane de gastrulas.
  4. Transfert ovocytes à 3 / 4x NAM (environ 2 ml) dans les plats d'argile bordée et d'immobiliser des impressions individuelles dans l'argile, la production d'impressions pour accueillir embryons individuels que des rainures ont été décrits ci-dessus.
  5. Embryons de transfert aux plats d'argile bordée et coupés calottes animales hors gastrulae utilisant deux paires de pinces fines. Prenez soin d'isoler l'animal bouchon ectoderme seulement et pas les tissus équatoriale 18.
  6. Placez un bouchon d'animaux sur l'hémisphère animal de chaque ovocyte avec la surface intérieure de la coiffe des animaux en contact avec l'ovocyte. Maintenir recombinants ensemble en appliquant fragment de lamelle de verre incurvée et en appliquant une pression vers le bas sur le verre, aplatissant l'ectoderme que les contacts de la lamelle de l'argile (calottes animales peut rester ouvert avec la couche intérieure exposée à la surface de l'ovocyte pour 6-8 heures ou plus ).
    Remarque: vous pouvez placer le capuchon de l'animal dans une indentation d'argile avec sa surface intérieure orientée vers le haut et placez un ovocyte sur le bouchon; sécuriser le recombinant avec de petites extensions d'argile.
  7. Culture à 20 ° C jusqu'à ce que les embryons de contrôle atteignent les désire étape pour le dosage.
  8. Recombinant séparée en enlevant lamelle / argile et l'isolement de l'ectoderme avec une pince et une boucle de cheveux.
  9. Fixer fragments ectodermiques pendant 1 h dans MEMFA (3,8%formaldehyde dans du MEM [0,1 M de MOPS, pH 7,4, 2 mM d'EGTA, 1 mM de MgSO et 4]).
  10. Fragments de transfert (et d'embryons de contrôle) de MEMFA en éthanol et conserver à -20 ° C.

4. Analyse de la réponse dans Ectoderme par hybridation in situ (ISH)

  1. Préparer des solutions pour ISH.
    1. Préparer 1x PBS: 0,01 M tampon phosphate salin, NaCl 0,138 M, pH 7,4
    2. Préparer PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% de Tween-20
    3. Préparer la solution de 100x Denhart: BSA 2%, 2% Polyvinylpyrrolidone, 2% de Ficoll
    4. Préparer tampon d'hybridation: 50% de formamide, 5x SSC, 1 mg / ml torula ARN de levure, 1 ug / ml d'héparine, la solution de 1 x Denhart, 0,1% de Tween-20, 0,1% de CHAPS, EDTA 10 mM, DEPC H 2 O
    5. Préparer le tampon acide maléique (MAB): acide maléique 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5
    6. Préparer MAB + bloc: MAB, 2% de réactif de blocage (la chaleur à 60 ° C pour dissoudre)
    7. Préparer la phosphatase alcaline (AP) tampon: Tris 100 mMpH 9,5, 50 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween, dH 2 O
  2. Préparer l'ARN Probe.
    1. L'utilisation d'un kit d'ARN polymérase commerciale et de creuser-NTP mélange, ajouter à un tube de 1,5 ml (50 de réaction pi): 25,5 pi DEPC H 2 O, 10 pl Transcription Buffer 5X, 2,5 ul 10x dig-NTP Mix, 5 pl 100 mM TNT, 2 pl RNAsin, 2 pl linéarisé matrice d'ADN (~ 1 ug / ul), 3 pi ARN polymérase et incuber 37 ° C pendant 90 min.
    2. Ajouter 2 ul ARN polymérase et incuber 37 ° C pendant 60 min.
    3. Vérifiez 2 pi de réaction sur gel d'agarose 1%.
    4. Ajouter 1 ul de DNase RQ1 RNase-Free et incuber 37 ° C pendant 20 min.
    5. Précipiter la sonde en ajoutant 50 ul DEPC-H 2 O, 25 ul d'acétate d'ammonium 10 M et 313 ul d'éthanol. Conserver à -20 ° C pendant la nuit (O / N), puis récupérer l'ARN par centrifugation à 13 800 g pendant 20 min. Laver avec 500 ul 75% d'éthanol, centrifuger brièvement, retirezéthanol et permettre culot sécher à l'air. Ajouter 50 ul DEPC H 2 O.
    6. Ajouter tampon d'hybridation à une concentration finale de ~ 0,5 pg / pl.
  3. Préparer tissus pour l'hybridation. Sauf indication contraire, remplir les flacons vers le haut à chaque changement de solution décrites (environ 4 ml).
    1. Retirer éthanol à partir de flacons et de transfert d'embryons dans 75% d'éthanol / PTW, puis 50% d'éthanol / PTW chacune pendant 10 minutes, à l'horizontale sur rocker.
    2. Laver trois fois dans PTW pendant 5 min sur chaque bascule.
    3. Transfert à 10 ug / ul de traitement à la protéinase K dans PTW; tubes de roche à la verticale de 15 min.
    4. Rincer deux fois 10 minutes dans chacune des 0,1 M pH 7,8 Triéthanolamine - Rock tubes verticalement.
    5. Ajouter 12,5 pi d'anhydride acétique à des tubes et de la roche verticale 5 min. Répéter l'opération avec 12,5 pi anhydride acétique supplémentaire pour 5 min.
    6. Laver à PTW 5 min verticalement sur rocker.
    7. Refixer dans 4% de paraformaldehyde 20 min à bascule. Chaleur tampon d'hybridationà 60 ° C.
    8. Laver trois fois dans PTW pendant 5 min sur chaque bascule.
    9. Retirez tous mais ~ 1 ml de PTW de chaque tube et ajouter 250 Buffer Hyb ul; agiter doucement tubes pour mélanger. Tubes Rock verticalement 5 min.
    10. Remplacez-le par 60 ˚C Hyb Buffer (0,5 ml) et agiter doucement à 60 ° C 10 min. Remplacer avec le tampon Hyb frais et agiter à 60 ° C de deux à 4 h.
    11. Sonde thermique (1 ml à 0,5 ug / ul dans du tampon Hyb) à 60 ° C (3 min). Retirer Hyb Buffer et ajoutez sonde pour tubes. Agiter doucement O / N à 60 ° C.
  4. Préparer tissus pour anticorps.
    1. Tampons Hyb chaleureux et 2x SSC + 0,1% de Tween-20 solutions à 60 ° C.
    2. Remplacer solution de sonde avec Hyb Buffer (sauf sondes à -20 ° C pendant 2 - 3x réutilisation). Lavage à 60 ° C pendant 10 min.
    3. Laver trois fois à 60 ° C dans 2x SSC-Tween (20 min chacun avec agitation).
    4. Laver trois fois à 60 ° C dans 0,2x SSC-Tween (20 min chacun avec agitation).
    5. Laver deux fois dans MAB (RT) pendant 15 min sur chaque bascule à l'horizontale.
    6. Ajouter 1 ml MAB + bloc. Lavez 2 h verticalement sur rocker.
    7. Transfert à 1 ml MAB + bloc contenant un anti-digoxygénine-AP 1 / 2.000. Roche verticalement à 4 CO / N.
  5. Préparer tissus pour Réactif couleur.
    1. Remplacer solution d'anticorps avec le MAB; laver trois fois en 5 min MAB horizontalement sur chaque bascule.
    2. Laver trois fois dans MAB 1 h chaque horizontalement sur rocker.
    3. Laver deux fois dans du tampon AP 10 min chaque bascule à l'horizontale sur.
    4. Transfert tissu à multiples puits plateau en plastique, retirez AP tampon et ajoutez BM réactif Violet (~ 1 ml). Laisser réaction de se dérouler dans l'obscurité 5 min à O / N.
    5. Lorsque coloration appropriée est atteint, transférer le tissu dans des flacons de PTW. Laver deux fois 10 minutes dans chacune des deux-roues motorisés sur rocker.
    6. Fixer dans la solution de Bouin à 4 CO / N sur rocker.
    7. Laver Bouin avec trois éthanol à 70% / 30% lavages PTW à TA. Procéder to capture d'image en utilisant épi-illumination et une caméra de microscope monté, le blanchiment si nécessaire 18.

5. Sib sélection et clonage

  1. Sélectionnez piscine avec l'activité la plus élevée (plus de réponse dans le tissu ectodermique).
  2. Titrer (diluer avec LB à une densité adéquate) le stock de glycérol pour la piscine avec l'activité la plus élevée et de la plaque sur dix nouvelles plaques avec environ un dixième des colonies de l'étape précédente (en utilisant l'article 2 dans le protocole ci-dessus).
  3. Réduire la taille de la piscine jusqu'à ce que l'activité est imputable à une seule colonie.
  4. Obtenir la séquence d'ADN en utilisant des amorces classiques dans le vecteur.

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Representative Results

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En réponse à l'expression de l'ARNm injecté dans des ovocytes, tissu de coiffe animale répondant a été analysé pour déterminer l'expression de otx2 par hybridation in situ (Figure 2 et tableau 1); otx2 est exprimé dans la lentille présomptif ectoderme (PLE) de fermeture du tube neural grâce à lentille placode épaississement 19. Cependant, depuis otx2 est également exprimé dans l'ectoderme neural antérieur ainsi que la non-neuronal tête ectoderme extérieur de la PLE, il est associé à la fois nerveuse et réponses placodal. L'utilisation de FOXE3 pour cribler la banque pour un produit capable de produire une réponse de la lentille-inductive à Lens-compétente bouchon animale ectoderme gène a permis une approche plus spécifique à l'objectif du clonage d'expression, puisque FOXE3 est exprimé dans le PLE de plaque neurale étapes et tout au long de la formation de vésicules lentille 20, présents dans les régions adjacentes placodal mais absents de neuroectoder m. En utilisant le clonage d'expression et de sélection de protocole au-dessus et en injectant sib pools de bibliothèques de produits de transcription, un gène capable de produire FOXE3 expression dans les calottes animales a été isolé (tableau 2). Suite à l'isolation du clone, 179 tests supplémentaires sur le plafonnement des animaux en utilisant des ovocytes injectés avec les transcriptions de la bibliothèque ont été criblées pour l'expression de FOXE3; 50 étaient positifs (28%). De 140 pièces de plafonnement des animaux placés sur les ovocytes non-injecté, 0 étaient positifs (Figure 3).

Figure 1
Figure 1. ovocytes animal Cap dosage et le clonage d'expression de aperçu schématique du protocole:. Transcriptions sont préparées à partir de la bibliothèque de clone et injectés dans des ovocytes, bouchon animale ectoderme est cultivée avec des ovocytes, puis testées pour l'expression génique induite par hybridation in situ. D / 53518 / 53518fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Résultats de Animal Cap essai suivant ARNm injection et l'hybridation in situ pour Otx2 dans. (AB) résultat représentatif de la réponse inductive à dorsalized étape 14 poly (A) + ARN dans les calottes animales, dosées pour otx2 expression par le mont ensemble in situ hybridation. (A) calottes animales placées sur les ovocytes non-injecté à l'étape 10.5 et cultivées à l'étape 25. (b) Stade 10,5 casquettes animaux placés sur les ovocytes injectés avec 10 ng de l'ARN et cultivé à l'étape 25. otx2 expression observée dans 6/7 des cas et indiqué par pointes de flèches. Bar = 500 um. "Target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Résultats typiques de Animal Cap essai suivant hybridation in situ pour FOXE3 dans. (AC) calottes animales représentatives de tests de capitalisation ovocyte-animaux, testés pour l'expression de FOXE3 par hybridation in situ. (A) Stade 11-11.5 calottes animales placées sur des ovocytes de LDB1-injecté et cultivées à l'étape 23. FOXE3 expression est indiqué par des flèches. (B) Stade 11-11.5 bouchons animaux placés sur les ovocytes non-injecté et culture à l'étape 23; aucune expression de FOXE3 détecté. (C) à travers la section FOXE3 -positifs induite bouchon animal d'une expression montrant dans les couches interne et externe de l'ectoderme. Bars = 500 um.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ARN injecté Les cas positifs Gène %
Etape 14 ARNm dorsalized, 10 ng 12/24 otx2 50
Bibliothèque piscines de 10 5 clones, 20 ng 3/9 otx2 33
Bibliothèque de piscines 5 à 10 10 0 clon es, 20 ng 50/179 FOXE3 28
Aucun 0/140 FOXE3 0

Tableau 1. ovocytes Cap-Animal Essai Résultats Les résultats de dosage de plafonnement des animaux évalués par hybridation in situ avec otx2 FOXE3 et en utilisant des ovocytes injectés avec de l'ARNm ou des transcrits synthétisés à partir de pools d'une banque d'ADNc. ou des ovocytes non-injecté.

huit: 24px; "> piscines de la bibliothèque de 10 5 clones, 20 ng ht: 21px; "> piscines de la bibliothèque de 400 clones, 20 ng height = "21" style = "height: 21px;"> piscines de la bibliothèque de 6 - 7 colonies, 20 ng 1px; ">
ARN injecté La désignation de la piscine / sélection Expression FOXE3 positive
UN 2/4
B * 4/28
C 4/44
Bibliothèque de 10 piscines 4 clones, 20 ng 1 0/11
2 0/10
3 3/14
4 0/12
5 0/15
6 1/20
7 3/23
8 0/16
9 0/16
10* 5/20
Piscines bibliothèque de 5.000 clones, 20 ng 1 0/7
2 * 5/16
3 1/7
4 0/7
5 0/7
1 0/10
2 0/10
3 0/10
4 0/10
5 * 8/26
6 0/11
7 0/10
8 0/10
9 0/10
10 0/8
Bibliothèque de piscines 70-200 colonies, 20 ng 1 0/8
2 0/10
3 * 1/10
4 * 1/10
5 0/10
6 0/9
7 0/10
8 0/10
Bibliothèque piscines de 20 colonies, 20 ng 1 0/10
2 0/10
3 0/10
4 * 7/21
5 0/10
6 0/10
7 0/10
8 0/10
9 0/10
10 0/10
K2-6, L1 0/10
L2-6, M7 0/10
M8-12, N7-8 0/10
K5-6, L1-4 1/10
L5-6, M7-10 0/10
M11-12, N7-8, K2-4 0/10
K2, K5, L2, L5, M8, M11 0/10
K3, K6, L3, L6, M9, M12 0/9
K4, L1, L4, M7, M10, N7, N8 1/9
ARN bibliothèque, 20 ng K6 0/10
L1 * 3/10
L3 0/10
L4 0/10
Bibliothèque ARN, 20 ng L1 (LDB1) la confirmation 50/179
* Indique pool sélectionné

Tableau 2. Sélection et Sib Expression Clonage Résultats. La piscine avec le plus haut niveau de réponse dans chaque essai de plafonnement des animaux (comprise entre 10% et 36% positifs pour l'expression de FOXE3) a été choisi pour une utilisation dans l'expérience suivante pour affiner l'activité à un clone. Asterisk indique pool sélectionné.

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Discussion

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Le procédé décrit ici pour le clonage fonctionnel de gènes capables d'induire une réponse dans l'ectoderme compétent peut être utilisée pour identifier une vaste gamme de produits de gènes. Cette méthode se développe sur le travail passé en combinant des analyses de tissus induisant avec des techniques d'expression de clonage. Nous utilisons les voies métaboliques de l'ovocyte de Xenopus en tant que source de production de facteurs induisant, directement ou indirectement, suite à l'injection d'ARN. Ceci, en combinaison avec l'utilisation de méthodes établies pour le clonage d'un gène d'intérêt 6,7 en utilisant l'expression de transcrits générés à partir d'une banque d'ADNc ou d'une autre collection de clones, fournit une approche intéressante pour ceux qui cherchent à identifier les gènes de nouvel intérêt impliqué dans l'embryon induction. La large applicabilité de cette méthode à l'identification fonctionnelle de nouveaux gènes est un complément utile à de nouvelles approches de génétique inverse passionnants, et pourrait également être utilisé pour fonctionnellement transcriptions de test identifiés à l'aide de haut-Throughput méthodes (telles que l'ARN-Seq) 21.

Contrôles sont essentiels dans le suivi de la fonction métabolique des ovocytes utilisés dans le dosage de la PAC. Tant pour assurer la santé de chaque lot d'ovocytes et d'établir l'utilité de ce système pour détecter des transcrits faible abondance, les concentrations d'ARNm de l'inducteur de mésoderme INHBB ont été testés variable; ce gène est sans rapport avec la voie lentille-induction et est un contrôle indépendant bien documentée 14. L'activité musculaire induisant dosé par l'expression des antigènes spécifiques du muscle à Cap animale ectoderme avec l'anticorps 12/101, a été observée avec 2-200 pg INHBB ARNm, même en présence de 500 fois en excès étape 14 poly (A) + ARN. Le système est donc utile sur une très large gamme de la quantité d'ARN injecté, et ovocytes sont capables de produire de manière stable protéines et rester viable après l'injection cytoplasmique de volumes de 50 nl et supérieur.

Une considération pour l'usoi d'une banque d'ADNc dans ce protocole est la nécessité de pleine longueur ou presque des clones pleine longueur. Avant d'utiliser dans le protocole, la bibliothèque devrait être examiné par analyse de Northern pour déterminer la taille de transcrits connus dans la bibliothèque et donc de réduire la possibilité que les effets négatifs dominants sont obtenus à partir de transcriptions injectés potentiellement tronqués. Depuis une piscine ADNc complet est important, l'utilisation de clones d'EST 22 ou de façon optimale, le Xenopus ORFéome 23 (qui fournit un ensemble complet d'validées clones pleine longueur) sont préférables pour une banque d'ADNc traditionnel, sauf si un Scène- et tissulaire source spécifique de l'ADNc sont recherchés et utilisé pour la construction de la bibliothèque. Une autre considération est la présence de séquences dans le vecteur de bibliothèque destiné à augmenter la stabilité de l'ARNm dans les transcriptions injectés β-globine et le poly (A). Bien que cela soit souhaitable d'augmenter la quantité de protéine produite à partir de l'ARNm synthétique injectée, elle soulève également la possibilirtlité de produire un effet dominant négatif à partir de l'ARNm qui est supérieure en termes de stabilité et d'activité que in vivo. Un faible nombre de copies d'ARNm ne peut pas exercer les mêmes effets que son homologue endogène dans le fond d'une grande piscine de transcriptions; une qui est stabilisé dans le processus de clonage et de la transcription peut persister pour permettre la détection dans le test de capuchon. Un troisième problème est la taille de la piscine; réduction considérable de la taille de la piscine (10 clones ou moins) a été démontré qu'il est avantageux dans des projets de dépistage récents gain de fonction dans des embryons de 24 et est susceptible de fournir des résultats plus clairs et faciliter l'identification de gènes candidats. Une plus petite taille de la piscine de la 10 3 - 10 4 recommandé dans ce protocole est réalisable si la complexité totale de la collection de clones est inférieure à 10 4, comme cela est le cas avec le ORFéome 23; on pourrait écran, dans les ~ 9.000 clones commençant avec 10 piscines de 900, si elle peut être prohibitif de main-d'œuvre àtraiter plus de 10 piscines dans une expérience.

Détermination du type de produit génique (par analyse de séquence) faite par le gène identifié dans l'écran détermine la nature des essais de sa fonction. Depuis un cofacteur transcriptionnel nucléaire a été identifié dans notre écran de 8, il était nécessaire de confirmer le rôle du noyau dans le processus inductif déclenchée par introduction de LDB1. Des ovocytes énucléés ont machinerie de synthèse de la protéine et sont entièrement fonctionnement viable et capable de produire des facteurs sécrétés à partir de transcrits injectés. Toutefois, l'absence du noyau supprimera fonctionnement des facteurs de transcription, des cofacteurs ou d'autres produits de gènes à action indirecte. Analyses ultérieures des gènes identifiés dans l'écran comprennent la détermination du profil d'expression de développement par hybridation in situ et de gain de fonction et de tests de perte de fonction. La surexpression par injection d'ARN dans des zygotes ou en limitant l'injection à la SPblastomères ecific pour limiter ses effets à des régions particulières de l'embryon peut fournir des indications, ainsi que knockdown de la fonction des gènes par injection d'oligonucléotides morpholino dirigés contre la transcription in vivo.

La visualisation directe d'un effet inductif dans la réponse bouchon animale ectoderme utilisant une lignée transgénique avec un gène rapporteur (comme la GFP) peut grandement accélérer le processus de dépistage et d'éliminer la nécessité pour l'analyse de l'expression des ARN par hybridation in situ. De même, l'utilisation d'anticorps en tant que moyens rapides de dépistage est souhaitable si un anticorps approprié (tel que l'12/101 de la réponse du muscle discuté ci-dessus) est disponible. Embryons albinos peuvent être utilisés pour les calottes animales, qui, bien que plus difficile de mettre en scène avec précision aux stades gastrula, rationaliser le processus d'hybridation in situ en éliminant la nécessité pour toute blanchiment de type sauvage de la pigmentation de mieux visualiser la prod de réaction de la couleurUCT.

Enfin, il est important de considérer que, pour plusieurs raisons, un grand nombre d'essais peut être nécessaire d'identifier menée à un gène donné. D'une part, le nombre de cas, on peut raisonnablement processus dans un essai donné est limitée par le développement (et la perte éventuelle de compétence) qui se produit au fil du temps même donné un grand lot d'embryons et d'une gamme de températures à laquelle à la culture eux, comme ainsi que la perte qui peut se produire de petits morceaux de ectoderme dans le traitement. Pour un autre, les taux d'expression d'un marqueur choisi dans l'ectoderme de réussite peuvent être très faibles et nécessitent de nombreux cas, d'observer un effet statistiquement significatif.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
12/101 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 12/101 Monoclonal antibody for detection of muscle tissue
20x SSC Buffer Sigma S6639 for ISH
Acetic anhydride Sigma A6404 for ISH
Anti-Dig-AP Roche 11093274910 for ISH
Aurum Plasmid Mini Kit Bio-Rad 732-6400 Plasmid DNA purification
Blocking Reagent Roche 11096176001 for ISH
BM Purple Roche 11442074001 for ISH
Boekel Hybridization Oven Fisher Scientific 13-245-121 for ISH
Bouin's Solution Sigma HT10132 for ISH
BSA Sigma A9647 for OCM
CHAPS Sigma C3023 for ISH
Collagenase A Roche 10103578001 Defolliculation of oocytes
Cysteine Sigma C121800 Dejelly embryos
DEPC-H2O Fisher Scientific BP5611 for ISH
Dig-RNA Labeling Mix Roche 11277073910 for ISH probes
Dumont #5 forceps World Precision Instruments 500233 for Vitelline envelope removal
Ethyl 3-aminobenzoate Sigma A5040 MS222 anesthetic
Ficoll PM 400 Sigma F4375 for Injection media
Formamide Sigma F9037 for ISH
Gentamicin sulfate Sigma G1914 for OCM
Glass capillaries World Precision Instruments 4878 3.5" long, I,D, 0.530 mm
Glass sample vials Fisher Scientific 06-408B for ISH
Hair loop Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation
Heparin sodium salt Sigma H4784 for ISH
Injector Nanoliter 2010 World Precision Instruments Nanoliter 2010 Microprocessor-controlled microinjector
Instant Ocean Carolina 972433 Aquarium Salt for frog recovery
IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA Source Bioscience 989_IRBG cDNA library 
LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin Teknova L5004 150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection
LB Luria Broth Teknova L8650 LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures
Magnetic mRNA Isolation Kit New England BioLabs S1550S for isolation of poly(A)-enriched RNA
Maleic Acid Sigma M0375 for ISH
Manual Microfil Micromanipulator World Precision Instruments M3310R Manual micromanipulator
Nutating Mixer Fisher Scientific 22-363-152 Rocker for ISH
Permoplast Nasco SB33495M Clay for injection and dissection dishes
Phosphate Buffered Saline Sigma P5368 for ISH
PMSG Sigma G4877 to stimulate oocyte development
Polyvinylpyrrolidone Sigma PVP40 for ISH
Programmable Puller World Precision Instruments PUL-1000 Micropipette needle puller
Proteinase K Sigma P6556 for ISH
pTnT Vector Promega L5610 cDNA library construction
Riboprobe Combination System Promega P1450 in vitro transcription
Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit Life Technologies 18248013 kit for cDNA library construction
Sutures, 3-0 silk Fisher Scientific 19-037-516 Suture thread and needle for post-oocyte removal
Torula RNA Sigma R3629 for ISH
Triethanolamine Sigma T1502 for ISH
Tween 20 Sigma P9416 for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System Promega C4360 alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration Source Bioscience 5055_XenORFeome ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells Agilent Technologies 200150 cells for transformation of cDNA library

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References

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Clonage fonctionnelle en utilisant un<em&gt; Xenopus</em&gt; Système d&#39;expression de l&#39;ovocyte
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Plautz, C. Z., Williams, H. C., Grainger, R. M. Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System. J. Vis. Exp. (107), e53518, doi:10.3791/53518 (2016).More

Plautz, C. Z., Williams, H. C., Grainger, R. M. Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System. J. Vis. Exp. (107), e53518, doi:10.3791/53518 (2016).

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