我々は、マウスの耳と尾から初代線維芽細胞を生成するための簡単かつ迅速に実験手順を説明します。手順は、特別の動物の訓練を必要とせず、最大10日間室温で保存された耳からの線維芽細胞培養物の生成のために使用することができます。
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この記事について
サマリー
要約
初代細胞は、組織から直接誘導され、確立された細胞株よりも、インビボでの細胞の生理学的状態をより代表すると考えられています。しかし、初代細胞培養は通常、有限の寿命を有しており、頻繁に再確立される必要があります。線維芽細胞は、初代細胞の容易にアクセス可能な供給源です。ここでは、マウスの耳と尾からの一次線維芽細胞培養物を確立するための簡単かつ迅速な実験手順を説明します。プロトコルは、最大10日間室温で保存された耳からの一次線維芽細胞培養物を確立するために使用することができます。プロトコルを注意深く続く場合、汚染は、場合によっては長時間保存された非滅菌組織を使用しても発生しにくいです。線維芽細胞は、培養液中で急速に増殖し、複製老化を受ける前に、かなりの数に拡張することができます。
概要
初代細胞は 、in vitro条件下で組織培養を生きから誘導されます。それは一般的に一次細胞は、より密接に生理学的状態、それらが不死化より由来する組織または腫瘍細胞株1の遺伝的背景に似ていることが想定されます。そのため、一次細胞は、生物学的な質問の2,3を研究するための有用なモデルを表します。しかし、無制限に成長する樹立細胞株とは異なり、一次細胞培養物は、最終的に老化を受け、頻繁に再確立される必要があります。
一般的に使用される一次細胞は、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、T細胞、B細胞、骨髄由来マクロファージ（BMDM）及び骨髄由来樹状細胞（BMDC）を含みます。線維芽細胞は、多くの場合、一次細胞培養モデルとして利用されます。彼らは、他の一次細胞を超える重要な利点を提供します。細胞培養物は、簡単に容易に維持し、設立され、何のpurificaを必要とされていません培養前の細胞の化。彼らは、迅速な初期の増殖および特殊な媒体や活性化のプロトコルのための要件があります。線維芽細胞は、効率的に4,5、生物学的、化学的、および物理的なプロトコルを使用してトランスフェクトすることができます。細胞培養を確立する前に、室温で最大10日間の耳を格納する可能性があります。線維芽細胞培養物は、細胞質プロセスの可視化に資すると人工多能性幹（iPS）細胞6に再プログラミングするのに適しています。....
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プロトコル
マウスを安楽死（シンガポール国立大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）のガイドラインおよび実験動物研究のための国家諮問委員会（NACLAR）ガイドライン）まで機関のガイドラインに準拠して無菌状態で飼育しました。
1.マウス
- 適切な遺伝的背景の一つにマウスを注文。このプロトコルは、1つのC57BL / 6マウス由来の組織に基づいています。
完全培地の調製
- 10％ウシ胎児血清（FCS）、50μM2-メルカプトエタノール、100μMのアスパラギン、2mMグルタミン、1％ペニシリン - ストレプトマイシン溶液：ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640培地に、以下の成分を添加することによって、完全培地を調製します。
酵素液の調製
- 15ミリリットルコニカルチューブ中のコラゲナーゼD溶液を調製します。
- コラゲナーゼD・ディ10mgを秤量4ミリリットルでssolveコラゲナーゼD完全培地。
- 1.7ミリリットルのマイクロチューブにプロナーゼ溶液を調製します。
- プロナーゼ10mgを秤量します。
- 1Mトリス緩衝液（pH8.0）の5μLを追加します。 0.5 M EDTA（pH8.0）を1μLを加えます。
- 滅菌水494μlのアッ....
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結果
組織破片のかなりの量の組織の結果からの線維芽細胞の抽出（ 図1）。組織片とは対照的に、線維芽細胞を1日培養の3との間の組織培養プラスチック表面に付着します。線維芽細胞培養物の培地は、安全に大幅文化（ 図2）に存在するデブリのレベルを減少させるべきである文化、の3日目に変更することができます。線維芽細胞は、細長い形態とはっきりと見える細胞質（ 図1および2）を表示 。有糸分裂細胞は、以降の文化の3日目から存在していなければならないと細胞は、培養の3〜4日以内に、細胞集密度の70〜80％に到達する必要があります。 10cmの培養皿で耳と尾組織からの収量は4〜5〜5×10（耳）と文化の3日目の5×10 6個の細胞（尾）の範囲です。線維芽細胞の単離の三日後、細胞を継代することができ、10cmの培養皿あたり2×10 5細胞で播種しました。
10日間室温で保存された耳からの線維芽細胞の抽出は、培養5〜6日以内に70〜80％の細.......
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ディスカッション
ここでは、マウスの耳と尾からの一次線維芽細胞培養物を確立するために、単純な、安価で高速な実験手順を提供します。抽出は、組織の3日後に分離以内に付着し、急速に分裂する線維芽細胞を生じるはずです。初代細胞の重要な制限は、老化、永久的な増殖停止15です。プロトコルを使用して、線維芽細胞培養物は、サイズの増加（2〜3倍の増加）と拡大に失敗、線維芽細胞が老化する前に、5〜6回継代細胞の平坦化によって示すことができます。
線維芽細胞の単離を行う場合は、注意が線維芽細胞の回収率が低いことになります不十分な切断または消化として、組織の破壊時に支払わなければなりません。これは、線維芽細胞の数を増やすために、耳と尾の線維芽細胞をプールすることが可能です。同様に処理腹膜及び肺組織を含む追加の組織Tを増加させるために添加することができます線維芽細胞の彼は数。デブリは、線維芽細胞抽出培養後に存在しているが、それは、線維芽細胞が細胞培養皿に付着する時間を取るようにのみ三日後に培地を変更することをお勧めします。
プロトコルの潜在的な制.......
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開示事項
著者らは、金銭的利益の相反がないと宣言しています。
謝辞
この研究はNRFの助成金HUJ-CREATE - Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammationによって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| 子牛胎児血清 | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-メルカプトエタノール | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| アスパラギン | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| グルタミン | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | HyClone | SV30010 | |
| エタノール | メルク ミリポア | 107017 | アブソリュート 分析用 |
| コラゲナーゼ D | ロシュ 診断 | 11088866001 | Clostridium histolyticum, 凍結乾燥、非滅菌 |
| プロナーゼ プロテアーゼ | メルク ミリポア | 53702 | Streptomyces griseus |
| >Tris緩衝液(pH 8) | 1st BASE | 1415 | 超高純度グレード |
| 0.5M EDTA(pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | バイオテクノロジーグレード |
| 10Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | 超高純度 |
| グレードトリプシン-EDTA溶液10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5%トリプシン、0.2%EDTA、生理食塩水 |
| アムホテリシンB | シグマアルドリッチ | A2492-20ml | 250&muでフェノールレッドなしで、SER-TAINプロセスによって照射されたトリプシンガンマ。g/ml 脱イオン水、滅菌フィルター付き |
| ハサミ | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μMシリンジ | フィルターSartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM細胞ストレーナー | SPL | 93070 | |
| シリンジプランジャー | テルモ | SS+10L | |
| クライオビアルチューブ | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml 微量遠心チューブ | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm 細胞培養皿 | Greiner | 664160 | 細胞培養処理皿 |
| 15 ml 円錐形底部チューブ | Greiner | 188271 | |
| 50 ml 円錐形底部チューブ | Greiner | 227261 | |
| ウォーターバス | GFL | 1002 | |
| 遠心分離機 | Eppendorf | 5810R | |
| インキュベーションシェーカー | Zartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 光学顕微鏡 | Carl Zeiss AG |
参考文献
- Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
- Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformat....
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再版と許可
