Presentedは、マウスの新生児運動テストの簡潔なバッテリーです。これらの検査を使用すると、新生児の運動障害をさまざまな新生児の運動障害で実証できます。標準化された一連のテストを持つことで、異なる研究の結果を比較することができ、グループ間でより適切で正確なレポートを作成することができます。
この記事について
サマリー
要約
トランスジェニックマウスの系統数が増え、小児疾患のげっ歯類モデルが増えるにつれて、新生児マウスの運動試験の包括的で標準化されたバッテリーの必要性が拡大しています。これらの試験は、傷害または疾患モデルの検証、治療効果の判断、および/または新しいトランスジェニック株の運動行動の評価を行うことができます。この論文では、歩行、後肢の足の角度、表面の立ち直り、ネガティブジオタクシス、前肢と後肢のサスペンション、握力反射、四肢の握力、崖の嫌悪感など、一般的な運動機能を評価するための一連の新生児運動テストを紹介します。生後2日目から14日目までのマウスが使用できます。さらに、これらの検査は、脳性麻痺、低酸素性虚血性脳症、外傷性脳損傷、脊髄損傷、神経変性疾患、神経筋障害など、幅広い神経学的および神経筋の病状に使用できます。これらの試験は、薬理学的薬剤の効果や他の種類の治療的介入を決定するためにも使用できます。この論文では、低酸素症、虚血、炎症を組み合わせた脳性麻痺の新規新生児マウスモデルで運動障害を評価しました。損傷から48時間後、9つのテストのうち5つのテストで、歩行、後肢の角度、後肢のサスペンション、4肢の握力、握力、握力反射の5つが有意な運動障害を示しました。これらの検査により、後肢の脱力感や、ヒトの脳性麻痺患者に見られる運動障害と同様の把持などの微細運動能力が明らかになりました。
概要
げっ歯類を用いた小児傷害または疾病の新モデルを開発することにより、急速に神経損傷から回復するラットとマウスの両方の驚くべき能力にしばしば困難です。したがって、任意の新たな小児疾患モデルを検証するために、徹底的に細胞および分子の変化を調べることは、行動転帰と手に手を行く必要があります。多くの点で、機能的な行動回復は、治療または翻訳関連性の面で根本的な細胞の変化よりも重要な場合があります。研究者は、成人と新生児における傷害についての詳細を学ぶように、彼らの応答が非常に異なっており、両者の間に外挿することはできないことは明らかです。例えば、新生仔マウスは、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン3及び脊髄損傷1,2次グリア細胞株由来神経栄養因子の異なるレベルを表示します。また、新生児は、脳卒中3、Dの後、有意な血液脳関門漏出を有します末梢神経損傷4の後emonstrate皮質ニューロンの再配置、および遅延または脊髄損傷および低酸素虚血5,6次アストログリオーシスを遅らせてきました。したがって、並進小児科の研究が発達同等のモデルを使用し、それらのモデルは、分子/細胞の変化と年齢に応じた行動試験の両方で評価されることことが重要です。
毎年1000年出生（NIH）：脳性麻痺（CP）が3に影響する運動障害です。 CP児は、疾患の重症度に応じて、症状や合併症の条件の範囲を示します。運動と協調の難しさは、モータの発達のマイルストーンに到達するの遅れに伴い、最も一般的な兆候です。他の徴候は、異常な筋緊張を（増加または減少のいずれか）が含まれ、細かい運動能力、歩行困難、過度のよだれや嚥下、音声遅延（NIH）を減少させました。 CPの根本的な原因はあると考えられています、または1年間の産後までの前または周産期中の酸素および/または脳への血流の欠如。さらに、炎症は、現在CPの開発における重要な要素であると考えられています。
CPの例大半は脳室周囲白質軟化症（PVL）として知られる心室、周りの白質損傷に関連しています。この神経学的特徴は、CPに至る初期の侮辱は、オリゴデンドロサイトが傷害に対して最も脆弱な脳の発達の期間中に発生したことを示唆しています。 32週の妊娠 - 人間の急速なオリゴデンドロサイトの成長の期間、オリゴデンドロサイトが傷害に最も影響を受けやすいもの期間は、24の間です。げっ歯類では、同等の期間は、出生後の日2 - 7 7、およびCPは、このモデルにおいて誘導されたときです。
ここで概説試験を実施するために使用されたCPの新生児マウスモデルは、INJを作成するために、炎症と低酸素症および虚血を兼ね備えより良い模倣人間CPで見られる神経変性ユリィ。このモデルは、人間のCP患者に似た個別の運動障害、ならびに個別の白質損傷を欠いているCPの他の動物モデルにおいて観察された主要な欠点のいくつかに対処しています。同じモデルを使用して、共同研究者による以前の研究では、このように優れたCP 8と子供に見られるPVLをエミュレートし、炎症の添加は白質の損傷を増強することを実証しました。以前のデータを踏まえ、本稿では、動物の年齢などの運動行動の変化を評価するために、新生児モータの総合テストバッテリーを提示します。
プロトコル
注：すべての動物の手術は、テンプル大学のウラル部門とIACUCの方針および手順に従って実施しました。 C57BL / 6ダムや種雄牛は、チャールズ・リバー・ラボラトリーズから購入し、12時間の明/暗サイクル（午前7時での光 - 夜07時00分）で飼育ケージに収容された食品や水に自由にアクセスさせて。 10子犬 - 繁殖ペアが5間のゴミのサイズを生産しました。
1.脳性麻痺の誘導手術
- 注：以前に8,9に記載されているように脳性麻痺は、出生後の日（PND）6仔マウスを使用して誘導した（https://www.jove.com/video/1951/mouse-models-of-periventricular-leukomalacia）。
- 研究室では、子犬の皮膚を保護するためにワイプで氷上のガラスボウルに子犬を置きます。足のピンチと運動の欠如によって、適切な麻酔面を確認してください。手術用のパッド入りのアイスパックに子犬を移動します。
- 70％エタノールを用いた子犬の皮膚を滅菌します。乾燥したときに、＃11無菌手術用のblaを使用ドとは、首の1cmの切開を行います。
- 立体手術用顕微鏡を使用して、小さなフックと右総頸動脈を分離し、携帯用の手持ち焼灼器を使用して焼灼します。視覚的に動脈が閉塞されていることを確認。偽手術は、焼灼することなく、総頸動脈の可視化と分離が含まれています。
- 皮膚を再編成し、近くに縫合接着剤（n-ブチルシアノアクリレート）を使用。
- 自発呼吸と通常の動きを監視するために30分間34°Cの加熱パッド上子犬を置きます。
- 30分間ダムする子犬（複数可）を返します。
- 加熱パッドまたは35分間、6％の酸素に設定し、低酸素室の内部に34°Cの時に設定された他の加温装置に子犬を置きます。酸素を窒素で置換されています。密接に一貫性の傷害結果の室の酸素濃度と温度を監視します。
- 低酸素室から子犬を削除し、加熱パッドに戻します。
- 腹腔内にリポ多注入糖類を1μg/ kgの滅菌生理食塩水で希釈し、ダムに子犬を返します。シャム注射は生理食塩水のみの注射をしています。
2.新生児モーターテスト
注：PND 8日、48時間のCP誘導後、仔マウスは神経行動発達について試験します。子犬は、行動の日差の時間を排除するために、正午前に4時間ブロック内でテストされています。子犬は、体熱と飢餓/分離問題の急速な損失を防ぐために一度にせいぜい15分ダムから削除されます。また、子犬は、最大限の努力が各テストに誘発されるように、テストとテストの間で休ませています。 （各テストのためのテキストに記載されているように）新生児モーターテストの基礎は試験10,11とWahlstenのフォックスのテスト12の適応、ならびにトリート-NMDおよびその他の行動の出版物のフォックスのバッテリーを使用して適合されています。フォックスのテストの21、打者 - テストのフォックスのバッテリーは、PND 2に適していますyの存在ここに含まれています：反射を把握、立ち直り反射、および四肢の握力（縦フォックスのバッテリーでスクリーンテストと呼ばれる）は、負の走地性が（フォックスとWahlstenの画面クライミング試験から変更されました）。ここでは、歩行、フロント肢の強度、及び後肢強度も偽とCPマウスの仔の間に反射的運動行動を区別するために試験されます。学習にテストに改良を排除するために、テストが指摘3試験の最大に制限されていました。他のすべてのテストは、動物ごとに1つだけトライアルを持っていました。
- 歩行 （ 図1）（ラットプロトコル13から適応）：
注：10日齢14 - -ポイントマウスは5から、歩行に移行し始める5、クロールは、初期のPND 0の間、マウスの仔で開発された動作です。 PND 8では、歩行テストは、この過渡的な時間経過を利用しています。歩行は、しかし、マウスの生涯を通じて獲得することができ、任意の年齢で決定することができます。学習のための電位が存在しないように、実験の過程を通して、必要に応じて、歩行テストは、何回も繰り返すことができます。- マウスは、トップだけでなく、側面から見える明確な筐体にマウスを置きます。歩いて子犬をやる気にさせる子犬の尻尾に触れることによって、穏やかな催促を使用してください。
- 0 =動き、非対称の四肢の動きでクロール1 = 2 =遅いクロールが、対称性四肢運動、および3 =速いクロール/歩行：以下のスケールを用いて、3分間の歩行をスコア。
注：後肢の各工程の間frontpawsを満たす場合ここで、対称な四肢の動きを説明すると、次のステップにスムーズに各ステップに遷移します。非対称の四肢の動きを表示するマウスはスムーズされていない1つのステップから次へ不安定な足の配置やトランジションを持っています。
からの移行1.図ウォーキングにクロール後肢を観察することによって区別することができるだけでなく、頭と尾。（A）つま先からかかとまで、背面全体の足をクロール時に、ambulating時（*）によって示されるように、地面に触れました。大人の歩行パターンは、ときにのみ、つま先と後肢（かかとが上昇し、[**]でdeonoted）地面に触れるの前部見られている。（B）クローリングマウスの頭部と尾部が地面に低いです。ヘッドは、歩行にクロールからの移行時に上昇し始めます。頭と尾の両方が上昇すると後足の前面のみが地面に触れたときの移行が完了した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 後肢足の角度 （ 図2）
注：覚書として後肢姿勢の明らかな発達的変化がありますeは歩くと後肢の間の角度がクロールで見られる角度よりも小さいときに後肢が身体の下に配置されている歩行にクロールから成熟します。後肢足の角度が時間の経過とともに変化していても、別の傷害または疾患と同じ年齢の仔マウスを比較することができます。歩行テスト（3.1）と同様に、学習のための可能性がありません。実験の過程を通して、必要に応じてこのように、後肢足角試験は、何回も繰り返すことができます。- いずれかの明確なオープンフィールドボックスまたは囲まれた領域では、それはフィールドの周りに移動するように子犬を記録するために、下記または上記の、それぞれからビデオカメラをマウントします。歩いて子犬をやる気にさせる子犬の尻尾に触れることによって、穏やかな催促を使用してください。 2分間録音。
- ビデオ録画を使用して、最長（中央）つま先の先端にヒール/すねの端から線を描画することにより、子犬の足の角度を測定します。子犬がいっぱいストライドを実行している場合にのみ測定を行います直線で両足が地面に平らです。子犬が静止している間に測定を服用しないでくださいまたは子犬が回転中。
- 足の角度の3つから5つのセットを測定し、試験した各子犬の平均角度を計算します。
図2.後肢足の角度は歩行異常を決定するために使用することができます。足の角度が（最長）桁中央から半ばかかとから線を描くことによって測定することができます。 （、足の角度を代表的な結果を参照してください）、正常と比較した場合、負傷した動物は大きな足の角度を持っている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- （ 図3）を 復原表面 ：
注：立ち直り反射はのための運動能力であります仰臥位からその足の上に反転することができるようにするため、マウスの子犬。げっ歯類に表示されるように立ち直り反射の平均年齢はPND 1の範囲とPND 5である- 。10 15この試験は反射があるので、そこには学習コンポーネントではありません、それは実験期間を通して繰り返すことができます。- コットンシートやベンチパッドの上に仰向けに子犬を置き、5秒間の位置に保持します。
- 子犬を解放し、それが発生しやすい位置に戻す子犬のにかかる時間だけでなく、立ち直りの方向（左または右）を記録。必要に応じて1分の合計は、各試験のために与えられています。
- 3試験の合計に対して、この手順を繰り返します。
図3.表面復原は。このテストは、トランク制御を必要とし、姿勢の不均衡のためにテストすることができます。ヒトCP患者はそのコア内に欠損を有することができます。e.com/files/ftp_upload/53569/53569fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 負の走地性 （ 図4）
注：負の走地性反射の平均年齢げっ歯類に表示するには、PND 3の範囲とPND 7 - 15 15負の走地性試験は、若いマウスでは運動協調性を評価します。。マウスは、子犬が坂道を表向きに変わり、斜面を下に向けて配置され、重力の前庭手がかりに起因しています。刺激に応答し、またはタクシーは、生得的な行動です。- その頭は45 O斜面に下向きで子犬を置き、5秒間押し続けます。
- 子犬を解放し、子犬が上向きに転じ、時間と方向を記録。総試験時間は2分です。
- 3試験の合計に対して、この手順を繰り返します。傾斜落下またはオンに失敗したマウスは、いずれであっても、再テストし、除去、またはゼロのスコアを与えられたことができます。
注：この決定はlであります審査官へのEFTは、として時折子犬が原因眠気よりもむしろ弱さに傾斜を転がり落ちます。決定が斜面を落下子犬を獲得する方法で行われると、それは方法に留意すべきであるとすべての科目の試験を通じて一貫している必要があります。
図4.マウスが斜面にその向きを認識し、好転するために負の走地性。モーターと前庭入力が必要とされている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- フロント四肢サスペンション （ 図5）16。 18、17から適応：
注：フロント四肢のサスペンションはアームと足の強さを含む仔の前肢強度をテストします。 T彼のテストはPND 10 15歳未満の子犬にはお勧めできません。子犬は、安定したオブジェクト全体に張らワイヤーをつかみ、両方の前足とワイヤ上にハングアップすることが許可されています。テストエリアは、パッド入りのドロップゾーンの上にあります。試験は、左/右側強度の違いを検出することができます。学習と負の強化の不在が増加し、非参加につながることができます。ワイヤ上に配置されたときに解放されるとすぐに落下か把握するのに失敗したマウスは、非参加の指標です。- 体内でしっかりと子犬を持ち、両方の前足で線を把握することを可能に。
- 子犬を離します。タイマーやストップウォッチを使用して、落下する総時間を記録するだけでなく、足の弱さ。
注：子犬が一貫むしろ同時に両方の足でワイヤーから解放する以外の前に1足でワイヤーから下がると足の弱さが決定されます。 - 合計3回のテストを繰り返します。
図5.フロントリムサスペンション。この懸濁試験は、筋肉疲労まで前肢の緊張を引き起こします。このアプローチでは、前肢のベースライン強度が確立されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 後肢懸垂 （ 図6）：
注：この懸濁試験は、後肢の強さを決定します。これは、新生児のために特別に設計された試験で、最初はPND 2間の動物で使用されていた- 12 19,20が、この試験は、左/右後肢の強さの違いだけでなく、神経筋機能を検出することができますPND 14までのマウスに適合させることができます。標準的な50mLの円錐を使用する、実験用ワイプで埋め。フロント肢懸垂試験と同様に、この試験は、特に罪を学習することができますCE落下への否定的な結果はありません。放出されたか、障害がチューブの端に置かれたとき、注目することができる滞在するとすぐに落下したマウスに見られるようにこのように、非参加を増加させました。- 後ろ足がリムに掛けて50ミリリットルの円錐を使用して、場所の子犬が静かにチューブに伏せて。
- 子犬を離します。後肢の姿勢を観察します。
- 以下の基準に従って姿勢をスコア。
注：4のスコアを上げ、尾を持つ通常の後肢の分離を示しています。 3のスコアが弱点が明らかであると後肢が互いに接近しているが、それらはほとんど互いに接触しないことを意味します。 2のスコアは後肢が近接していると、しばしば触れ示しています。 1のスコアが弱点が明らかであると後肢を上げ尾と握りしめた位置にほぼ常に示しています。 0のスコアが低下し、尾または任意の期間のためのチューブに保持するために、障害を持つ後肢の定数留めを示しています。 - 必要に応じてカウントが引っ張ります。プルはクアルですコニカルチューブの側に停止している子犬がその後肢を使用して、その本体を持ち上げるようにしようとしたときified。
- タイマーやストップウォッチを使用して、秋に待ち時間を記録。
- 三連で試験全体を繰り返します。
図6.後肢懸垂。（A）。この懸濁試験は、筋肉疲労まで後肢の緊張を引き起こします。後肢におけるベースラインの強さと姿勢が確立されている。（B）。得点。可能な姿勢スコアを実証する代表的なマウスの上の数字に注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 握力 （ 図7）。
注：このテストは、足秒を検討します同時にすべての4つの足のtrength。 16×18ガラス繊維スクリーンワイヤが使用されます。 15 15 フォックスはPND 2から4肢の水平スクリーンテストを使用する- -げっ歯類は横画面を把握できるようにするための平均年齢は生後5の範囲でPND 8である。。21 10この試験は、水平標準から変更されていますスクリーンテスト。ここで画面はすべて四肢21の把持に挑戦し、垂直位置に水平からゆっくりと回転させられます。コルチS 16から適応。 180°に反転したときにマウスがメッシュの画面に保持している場合、落下する待ち時間を記録。また、体重に注意してください。吊りインパルスは次のように計算することができる[落下する重量（g）×待ち時間（秒）]、重力に抵抗するために必要な力を反映しています。- ワイヤーメッシュの部分を使用して、画面上の子犬を置きます。子犬は約5秒のためにこの環境に適応できるようにします。
- 180度にゆっくりと画面を反転。おおよそのANGLを記録します画面の電子子犬が落ちます。
- 3試験の合計のために繰り返して試験を平均します。
図7.握力。マウスは、重力が増加すると、すべての四肢で筋肉の緊張を維持するために必要とされる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 把握反射 （ 図8）
注：把握反射が通常PND 3の範囲でPND 7でげっ歯類に表示されます- 15 15各足は、このようにテストは前面または後肢の問題だけでなく、偏りの問題を明らかにすることができ、個別にテストされています。それは反射のように反射が表示されるまで、このテストを繰り返すことができます。これは、学習しがちではありません。重要な注意点として、このテスト強さ、能力のみを把握区別しない、と前に幼若マウスが応答を恐れるによる把握を開始年齢の15日にテストする必要があります。- マウスの子犬がダムによって運ばれているのと同様に、その首筋、によってマウスを置きます。このホールドは、子犬は、テストを容易にするためにできるように、本能的に不動とリラックスになるようになります。
- ストローク鈍いと子犬の各足は、かみそりの刃の側を丸めました。
- 個別に各足をテストし、把握の有無を記録し、とマウスの把握足につき1ポイントを獲得。
注：右の足の好みのためのスコアリングは、右足の好みのための100％です - - 左足の嗜好に-100％、両方の足のための50％が把握し、把握がない足は0％。 ×100％ - [/（右足+左足+両足）（左足右足）]これらの番号を決定するための方程式があります。
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図8.把握反射。新生児マウスは、強い恐怖反応を持っていないので、このテストは厳密に手掌反射/足底を決定する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- クリフ嫌悪 （ 図9）。
注：クリフ回避テストは反射、ならびに強度および協調をラビリンスとPND 1-14 22からの仔を試験するために使用することができます。前香りボックスフラット高架棚で（5匹のマウスの最小値は自由に移動することが許可されているボックス）が使用され、子犬だけ自分の前足とエッジの上に位置付け、その鼻の桁で配置されます。得点は、それが離れて崖からオンにし、エッジから離れ、その足と鼻を移動するために子犬を取る合計時間をカウントすることによって行われます。応答は、30秒後に見られない場合、試験を終了します。子犬がエッジを落下した場合、単一の追加試験を行うことができます。- 側面図を使用して、前足、数字と鼻がエッジの上部分だけであることを確認して、事前に香りのボックスの端に子犬を置きます。
- 子犬を離し、タイマーを開始します。
- 鼻と足の両方がエッジから削除されていたら、タイマーと記録時間を停止します。
- 3試験の合計のためのテストを繰り返します。子犬は、30秒以内に崖から離れて移動しない場合、スコアが与えられていません。
注：子犬は、審査官の裁量に委ねられている障害者対非参加者であるかどうかを決意。崖の高さは、子犬の安全を確保する子犬の年齢について調整することができます。より小さい高さが大きい高さをエミュレートするために黒い「床」で使用することができます。
Figur電子9.クリフ嫌悪。前庭不均衡は崖回避試験を用いて測定しています。ここでは、子犬の目はまだ恐怖を離れて、崖の端からオンにする駆動要因ではないように閉じられている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
3.統計的有意性
- 統計ソフトウェアを使用すると、結果を分析します。平均（SEM）の平均±標準誤差としてデータを表現します。試験はパラメトリックであり、従って、t検定分析を使用してデータを調べます。
注：実験は、性差をテストするために設計されていませんでした。差はp <0.05の場合、統計的に有意であると考えられます。
結果
マウスは、試験のパラダイムを学ぶことは交絡変数ではなかったように、各時点に別のマウスを用いて、P13（1週間以下の手術）にP7（手術後24時間）から試験しました。マウスは、この時点で最大の赤字を示したようP8は、代表的な結果として選択しました。
クロールからウォーキングへの移行は、CP新生児マウスにおける遅延され
人間のCP患者はつま先歩きからシザリング歩行に至るまで、歩行異常を持っています。このCPモデルディスプレイは人間に似赤字を歩行したように、歩行を評価しました。マウスはまっすぐ歩行中の歩行対称性と肢足の動きに採点しました。 CP 1.083±：手術後48時間（PND 8）では、CPのマウスは、それらの偽の対応（平均歩行スコアと比較して少ない対称性四肢運動と「クロール」歩行を持っていました偽1.639±0.4859対0.6337、N = 12、N = 9; P <0.05、 図10）。一週間では、CPおよび偽マウスの両方が（データは示していない）歩行に移行しました。
図10. CPマウス子犬は歩行しないだけでなく、シャムス。シャムマウス（黒棒）は1.639±0.4859の平均スコアを持っていた（n = 9）、彼らの歩行発達を意味する非対称性四肢運動と遅いクロールの間に入ります。 CPマウス（灰色のバー）1.083±0.6337（N = 12）の平均スコアを受け、彼らの歩行は発展途上であり、非対称の四肢の動きを持っている傾向があるという意味。データは、平均±SEMとして表されます。 *はp <0.05である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ホアヒンフット角度はCPで増加するdlimb
歩行に加えて、後肢足角を評価しました。八日齢の偽の仔マウスは、直線（ 図2の中を歩いたときに後足をスプレイしているHILマウスに比べ、前方を向いた彼らの後足で歩く;平均角度：CP 77.48±9.848、N = 9、対54.54±シャム8.043、N = 11; P <0.0001、 図11）。子犬が彼らの歩行を安定化し、バランスと協調を支援するために、その後部足の角度を大きくする必要があるという点で、この増加した角度は、歩行不安定性と相関します。
図11. CPマウス子犬スプレイは、彼らの後足ウォーキング。CPマウス（黒棒）77.48±8.043（N = 11）の彼らの後肢間の平均角度を持って、偽マウス（グレーBしばらく ARS）は54.54±9.848（平均角度を持っているのn = 9）。データは、平均±SEMとして表されます。 ****はp <0.0001である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
CPのマウスは、赤字を表示しないときに表面復原
いくつかのCP患者は、トランク制御（Heyrman ら。、2013）が損なわれているように、テストを正す面が含まれていました。また、前庭系は、立ち直りの必要性を検出する必要がある、いくつかのCP患者23内の前庭障害があります。シャム対照と比較して、立ち直り時CPマウスは有意な障害を示していない（データは示さず）。
CPのマウスは、負の走地性テストにシャムと同じを実行します
。。 "FO：キープtogether.within-ページは="トン配向上り坂に1 ">負の走地性は若い子犬に運動協調をテストするために使用されたマウスは、傾斜面に下り坂面した場所であることによってチャレンジする遅延や障害が障害を示している可能性があります（データは示していない）偽のマウスと比較して、負の走地性でチャレンジした場合に協調、バランス、または前庭入力に。CPマウスは全く障害を示さない。さらに、CPマウスは再配向もうに対して一方側に回転する選好を示しませんでした。フロントリム懸垂試験は、10日より前のマウスに適しています
CP患者は、このような把握などの細かい運動能力、で筋肉の緊張と赤字が低下しています。このマウスモデルの弱点をテストするために、我々は、フロント肢懸垂試験を用います。さらに、このモデルは、一方的な虚血性傷害を使用して両面らしこの懸濁試験を用いて決定することができます。このテスト10日15歳以上のマウスのためのより良いです。 8日齢に、損傷後2日、CPおよび偽マウスの間に有意差はなかった（データは示さず）。
後肢強度は、CPマウスにおいて減少します
人間のCP患者はしばしば、モータ制御と強度不足にブレースや支援歩行デバイスが必要です。ヒトへのげっ歯類CPモデルを比較するために、後肢強度は後肢懸垂試験を用いて評価しました。 CP 3.468±0.5561、N = 13、対偽3.891±0.1329、N = 13; pは<：コニカルチューブの側面から吊り下げたときのスコアをぶら下げの減少により示されるように、CPマウスは後肢吊りスコア（、後肢弱さを示しました0.05、 図 12）。差異は後肢懸垂時間で観察されなかった（データは示さず）。したがって、ヒトのCP患者と同様に、CPマウスはhindlを実証しますIMB（脚）脱力。
図12.シャムマウスは 、偽マウス（黒棒）より後肢分離し、したがって強い後肢の姿勢を示し3.891±0.1329の平均吊りスコアで。少しけど （N = 13）CPマウスよりも彼らの後肢で有意に強いです 3.468±0.5561（N = 13）の平均吊りスコアでCPマウス（灰色のバー）よりもチューブの端にぶら下がったとき。データは、平均±SEMとして表されます。 *はp <0.05である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
握力は、次のCP傷害低減されます
すべての4つの足で把握することで、げっ歯類のために重要です登山や凹凸面全体に実行されているという点。グリップは、主桁で、重要な持続的な強さではなく、器用さや直線力を必要とし、24を PAWS。マウスを反転ワイヤメッシュスクリーン上に彼らの体重を保持するために必要でした。 CPマウスは彼らのグリップを維持することができませんでしたし、これらのマウスは、有意に低い角度で落ちた（四肢平均角度：CP 75.627±24.48、N = 11、対偽96.57±10.836、N = 9; P <0.05、 図13）。このデータは、CPマウスにおける握力の有意な欠陥があることを示します。
13. CPマウスがシャムス。シャムマウス（黒棒） よりも弱いグリップを持っている図は、96.57±10.836の平均反転角度に把握（N = 9）ことができます。 CPマウス（灰色のバー）が唯一の75.627±24.48（N = 11）の反転角度に到達することができます。データは、平均±SEMとして表されます。 * pは0; 0.05。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
把握反射赤字はCPマウスにおいて明らかです
総運動障害に伴い、微細運動の動きはまた、CP患者25,26に損なわれています。ヒトでの把握反射が出生時に存在し、約5消える - 6ヶ月。しかし、このような誇張された速度や強度把握、把握するのに失敗、または把持反射の再来として把握反射の変化、年齢の6ヶ月後に、すべてのは、神経系への損傷を示しています。 CPモデルに把握比較するために、反射的把持赤字が決定しました。
損傷後48時間で、CPマウス（平均足把持反射を把握するの減少を実証します48時間で：CP 2.429±0.9376、N = 14、対3.214±0.8018偽、N = 14; P <0.05、 図14A）。前肢の右肢の好みのわずかな、しかし有意ではない増加があった（データは示さず）。そこ後足の大幅な右足の好みだった（CP 75.0±42.74であり、n = 14、偽17.86±54.09対はn = 14; P <0.005、 図14B）。 、特段の足の嗜好と;：一週間損傷後、CPマウス（P <0.05、 図14C CP 2.75±1.035、N = 8を、対3.80±0.6325、N = 10を偽平均足は1週間で把握）の赤字を把握表示します。
図14. CPのマウスは、後足で、負傷脳領域に対側を把持赤字を持っています。 （A）48時間後の損傷（PND 8）、CPマウス（灰色のバー）、平均して、とスティックを把握、偽アニマよりも少ない足LS（黒いバー）。（B）CPマウス（灰色のバー）が、左後肢（損傷に同側）を使用してとは対照的に（損傷に対側）の右後足に把握するためのプリファレンスを表示します。シャムマウス（黒棒）は、この右足の好みは表示されません。右足の好みは次のように計算された（ - / [右足+左足+両足] * 100 [右足の足左]）を（C）一週間損傷後、CPマウス（灰色のバー）と比較して依然として赤字を把握示します。シャムス（黒いバー）。データは、平均±SEMとして表されます。 * P <0.05、**は、p <0.005である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
CPのマウスは、クリフ嫌悪中にエッジから離れ向けます
崖回避テストは、阿波を回すために、マウスの固有の恐怖に依存しています安全性に向かって急な崖と頭からyの。いくつかのCP患者は前庭困難だけでなく、障害者のモータ制御を持っていますが、CPのマウスは、このテスト上の任意の障害を示しませんでした。
ディスカッション
人間とげっ歯類の間で行わ行動試験は、ヒトの症状に直接関連性を持っている細胞および分子応答の間に重複がある場合ヒトの疾患を研究するための動物モデルを使用するとのみ関連します。小児疾患の研究の主な問題の一つは、多くの研究者が疾患プロセスのために重要であり得る発達の違いを考慮することなく、モデル、ならびに成体げっ歯類の行動評価を作成するために、成体げっ歯類を使用することです。 、7（7日間の齧歯類- - 32週出生後2日目に相当し28で例えば、ヒトCNSの開発）、これらの問題のため、小児疾患の利用に関する研究だけではなく、適切な調整後の発達時点があることが重要ですだけでなく、適切な運動、感覚や反射的発達行動を検討する行動試験を。それぞれの新しい新生児疾患モデルが開発されるようにこのように、厳密に携帯することを保証するために試験されなければなりませんそして、行動反応は、齧歯類とヒトの間で最も適切な翻訳可能なデータを提供します。
脳性麻痺は、大人になって存続運動障害、です。現在入手可能な脳性麻痺モデルの多くの1つの問題は、小児患者に見られる障害と相関することができ、再現、標準化された運動テストの欠如です。新生児マウスにおいて低酸素症、虚血、および炎症を組み合わせたこの新たなモデルでは、モータの動作は、新生仔マウスに特異的な一連の試験を用いて評価しました。主観性を減少させ、定量的な報告を高めるために、いくつかの試験は非常に特異的ではなく、標準化することができる措置を評価しやすい含むように修飾されています。また、フロント及び後肢評価を別々に行うことができ、右/左の差を決定することができます。テストのこの電池は、年齢の2週間まで新生仔マウスに特異的です。
このCPモデルは示しています歩行困難（歩行、後肢蹄の角度）、ならびに四肢固有の弱点（4肢のサスペンション、後肢懸垂）、および発達反射の欠損（反射を把握）。この研究において唯一の時点を調べたが、これらの障害は、時間の経過とともに追跡することができます。
そのような試験のフォックスのバッテリーや発達のマイルストーン15のHeyserの評価として、新生児に使用することができるテストの他の電池は、あります。しかし、これらのテストは、その応答新生児がまだ開発されているので、同じではないかもしれない大人に新生児を比較します。フォックスのバッテリーとHeyserのAssementテストが観察主観的な二分法との情報（yesまたはno）の評価ではなく、客観的なデータ（角度、強度などに基づいて姿勢）に依存しています。そのため、これらの試験の主観性のため、多くの科学者は、このように他の人と限界への比類のない、その結果を作り、基準を、適応追加、または削除しました特定の疾患または障害のベースライン赤字を確立するという点で、データの有用性をる。定性的および特に新生児をテストするために設計されている標準化された運動テストの一組を確立することにより、個々の研究グループからの結果を正確かつ確実に報告し、比較することができます。
開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
私たちは、シュライナーズ病院小児研究センターの皆さん、特にミッキー・セルツァー博士に感謝したいと思います。彼の支援がなければ、この研究は資金提供されなかったでしょう。また、早期のデータ収集に貢献してくださったIsha Srivastavaさんと、数字の作成に協力してくださったAmy Heさんにも感謝いたします。この研究は、Shriners Hospitals for Childrenによって資金提供されました。実験計画や論文の出版決定に役割を果たした資金源はありませんでした。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| C57BL/6マウス | Charles River Laboratories | STRAIN CODE: 027 | C57BL/6NCrlは、私たちが使用する正確な株です |
| 麻酔皿、PYREX™結晶化皿 | コーニング ライフサイエンスガラス | 3140125 | 容量:25.03オンス(740ml)、直径x高さ:4.92×2.55インチ(125 x 65mm)。ただし、小さな丸いガラス容器なら何でも機能します。平らな底の2カップ容量のパイレックス食品保存ボウルも機能し、はるかに安価です(パイレックスモデル番号:6017399)。 |
| カバー付きリードリング | フィッシャーサイエンティフィック | S90139C | 水浴中でフラスコを安定させるためのリードリング。麻酔皿の内側で使用します。 |
| スカルペルブレード #11 | World Precision Instrucments, Inc. | 500240 | |
| 小型容器焼灼器 | ファインサイエンスツール | 18000-00 | |
| マイクロフック | ファインサイエンスツール | 10064-14 | |
| トボンド縫合接着剤 | 3M | 1469SB | n-ブチルシアノアクリレート接着剤 |
| ポ多糖 | シグマライフサイエンス | L4391 | 腸菌0111からリポ多糖類:B4、ガンマ線照射12 |
| x 12インチ不透明なボックス | アクリルディスプレイ製造:Piasa Plastics | C4022 | カラーアクリル5面キューブ、3/16 "カラーアクリル、12 "W x 12" D x 12 "Hの一部門。 http://www.acrylicdisplaymfg.com/html/cubes_19.html |
| カメラ/ビデオカメラ | JVC | GC-PX100BUS | 暗い場所でもうまく機能し、インポートと編集が可能なビデオカメラ。JVCのフルHDビデオカメラ「Everio」を使用しています。 |
| Covidienテンダーソーブ&トレード;アンダーパッド | Kendall Healthcare Products Co | 7174 | |
| WypAll L40 | Kimberly-Clark Professional | 5600 | 適度なグリップを持つ任意の表面は、 |
| 45度の傾斜 | 段ボール箱を使用しています。 | ||
| パイプクリーナーからの細いワイヤー | Creatology | M10314420 | どのクラフトショップのパイプクリーナーでも機能します。 |
| 50mLの円錐管 | の鷹 | 352070 | |
| のガラス繊維スクリーン ワイヤー | ニューヨークのワイヤー www.lowes.com | 14436 | スクリーンが16 x 16または18 x 16 |
| かみそりの刃 | Fisherbrand | 12-640 | 綿先端の綿棒の木製の棒のアプリケーターか木の部分も働きます。 |
| OPTIX 24インチ x 4フィート x 0.22インチの透明アクリルシートで、透明なアクリル通路 | PLASKOLITE INC | 1AG2196A | 透明なアクリル (厚さ 1/8") で、側面と上部が探索を制限します。地元の金物屋さんからアクリル板を買ってきて、サイズに合わせて切ってもらいました。(2)2 "x 2";(3)2 "x 18";(1)2 "x 15.5";(1)2インチ×3インチ。透明なテープを使用して、15.5インチのピースを上にして、すべての面を一緒にテープで留めます。3インチのピースを15.5インチのピースの端にテープで固定して、マウスのフラップ/入り口を作成します。あるいは、通路の一部または全部を接着し、上部の部分だけをテープで留めることもできます。この設計により、通路を開けて簡単に掃除することができます。 |
| 分度 | ウェストスコット | ACM14371 |
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