Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Au-Interactie van SLP1 Polymeren en monolaag van Published: January 19, 2016 doi: 10.3791/53572
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

Introduction

Als gevolg van het toenemende gebruik van goud voor verschillende toepassingen, zoals elektronica, katalysatoren, biosensoren, of medische instrumenten, de vraag van dit edelmetaal is gegroeid in de afgelopen paar jaar tijd 6-9. Goud evenals vele andere edelstenen en zware metalen in het milieu via industrieel afvalwater in verdunde concentraties, door middel van mijnbouw, en afvalverwerking 7,8,10, hoewel de meeste milieuvervuiling door zware of edele metalen is een continu proces vooral veroorzaakt door de technologische activiteiten. Dit leidt tot een aanzienlijke verstoring van de natuurlijke ecosystemen en zou kunnen bedreigen de volksgezondheid 9. Weten deze negatieve uitkomsten bevordert het zoeken naar nieuwe technieken om metalen uit vervuilde ecosystemen en verbeteringen te verwijderen in de recycling van metalen uit industrieel afvalwater. Gevestigde fysisch-chemische methoden zoals neerslaan of ionenwisseling zijn niet zo effectief, vooral in de hogely verdunde oplossingen 7,8,11. Biosorptie, hetzij met levende of dode biomassa, is een aantrekkelijk alternatief voor de behandeling van afvalwater 10,12. Het gebruik van dergelijke biologische materialen kan het gebruik van giftige chemicaliën verminderen. Veel micro-organismen zijn beschreven ophopen of immobiliseren metalen. Bijvoorbeeld, cellen Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 toonden hoge bindingscapaciteiten van edele metalen, bijvoorbeeld Pd (II), Pt (II), Au (III) en andere toxische metalen zoals Pb (II) of U (VI) 4,13, cellen van Bacillus megaterium van Cr (VI) 14, cellen van Saccharomyces cerevisiae van Pt (II) en Pd (II) 15 en Chlorella ordinaire voor Au (III) en U (VI) 16 , 17. De binding van de voorgaande metalen zoals Au (III), Pd (II) en Pt (II) is eveneens gerapporteerd Desulfovibrio desulfuricans 18 en L. sphaericus JG-B53 19,20. Toch niet all microben binden grote hoeveelheden metalen en hun toepassing als sorptieve materiaal is beperkt 12,21. Bovendien metaal bindingscapaciteit is afhankelijk van verschillende parameters, bijvoorbeeld celsamenstelling, de gebruikte bio-component, of milieu- en experimentele condities (pH, ionsterkte, temperatuur etc.). De studie van geïsoleerde celwandfragmenten 22,23, zoals membraanlipiden, peptidoglycaan, eiwitten of andere bestanddelen, helpt metaalbindingseigenschappen processen complex geconstrueerde gehele cellen 8,21 begrijpen.

De celcomponenten gericht in deze studie zijn S-layer eiwitten. S-layer eiwitten delen van de buitenste celwand van vele bacteriën en archaea, en zij vormen ongeveer 15 - 20% van de totale proteïnemassa van deze organismen. Als eerste interface naar de omgeving, deze mobiele verbindingen sterk beïnvloeden de bacteriële sorptie-eigenschappen 3. S-layer eiwitten met molecuulgewichten variërend van veertigtot honderden kDa wordt geproduceerd in de cel, maar buiten gemonteerd waar ze kunnen lagen op lipidemembranen of polymere celwand componenten vormen. Eenmaal geïsoleerd, bijna alle S-laag eiwitten hebben de intrinsieke eigenschap om spontaan zichzelf assembleren in suspensie, aan interfaces, of op oppervlakken vormen vlakke of buis-achtige structuren 3. De dikte van het eiwit monolaag afhankelijk van de bacteriën en ligt binnen een bereik van 5 - 25 nm 24. In het algemeen kan de gevormde S-layer eiwitstructuren een schuine (p1 en p2), vierkant (p4) of zeshoekig (p3 of p6) symmetrie roosterconstanten 2,5 tot 35 nm 3,24 hebben. Het rooster formatie lijkt in veel gevallen afhankelijk van tweewaardige kationen en voornamelijk Ca 2 + 25,26, Raff, J. et al. S-laag op basis van nanocomposieten voor industriële toepassingen op basis van eiwitten Engineered nanostructuren. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (ingediend)). Toch is de volledige reactie cascade monomeer vouwen, monomeer-monomeer interactie de vorming van een rooster, en de rol van verschillende metalen, vooral van divalente kationen zoals Ca2 + en Mg2 +, zijn nog niet volledig begrepen.

De gram-positieve stam L. sphaericus JG-B53 (hernoemd van Bacillus sphaericus na nieuwe fylogenetische classificatie) 27 werd geïsoleerd uit de uraniumwinning afval stapel "Haberland" (Johanngeorgenstadt, Saksen, Duitsland) 4,28,29. De functionele S-layer-eiwit (SLP1) bezit een vierkant rooster, een molecuulgewicht van 116 kDa 30 en een dikte van ≈ 10 nm op levende bacteriecellen 31. In eerdere onderzoeken werd de in vitro vorming van een gesloten en stabiel eiwit met een dikte van ongeveer 10 nm in minder dan 10 min 19 bereikt. De gerelateerde stam L. sphaericus JG-A12, ook een isolaat uit de "Haberland" pile, bezit hoge metaal binding capaciteiten, geïsoleerde S-layer-eiwit blijkt een hoge chemische en mechanische stabiliteit en goede sorptie bekijken van edelmetalen zoals Au (III), Pt (II), en Pd (II) 4,32,33. Deze binding van edelmetalen meer of minder specifiek voor bepaalde metalen en afhankelijk van de beschikbare functionele groepen op de buitenste en binnenste eiwit oppervlak van het polymeer en in zijn poriën, ionsterkte en pH. Relevante functionele groepen voor metalen interactie door de eiwitten COOH, NH 2 -, OH, PO 4 -, SO 4 - en SO. In principe, metaal bindende capaciteiten opent een breed spectrum van toepassingen, Raff, J. et al. S-laag op basis van nanocomposieten voor industriële toepassingen op basis van eiwitten Engineered nanostructuren. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (ingediend)). bv als biosorptive componenten voor de verwijdering of het herstelopgeloste toxische of waardevolle metalen, sjablonen voor synthese of gedefinieerd afzetting van regelmatig gestructureerde metalen nanodeeltjes (NP) voor katalyse en andere bio-engineered materialen zoals bio-zintuiglijke lagen 3,5,18,33. Regelmatig gerangschikte NP arrays zoals Au (0) -NPs zouden kunnen worden voor belangrijke toepassingen gaande van moleculaire elektronica en biosensoren, ultrahoge opslagdichtheid apparaten en katalysatoren voor CO-oxidatie 34-37. De ontwikkeling van dergelijke toepassingen en slimme ontwerp van deze materialen vereist een dieper begrip van het onderliggende metaal bindende mechanismen.

Een voorwaarde voor de ontwikkeling van dergelijke materialen op biologische basis is de betrouwbare uitvoering van een tussenlaag tussen het biomolecuul en de technische oppervlak 38,39. Bijvoorbeeld, polyelektrolyten samengevoegd met de laag-voor-laag (LbL) techniek 40,41 zijn gebruikt als interface laag voor herkristallisatie van S-layer eiwitten 39 19,42, Raff, J. et al maken. S-laag op basis van nanocomposieten voor industriële toepassingen op basis van eiwitten Engineered nanostructuren. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (ingediend)). Echter, het complex mechanisme van eiwitadsorptie en interactie eiwit-oppervlak niet volledig begrepen. Vooral informatie over de conformatie, patroon oriëntatie en coating dichtheden wordt nog steeds vermist.

Kwartskristalmicrobalans met dissipatie bewaking (QCM-D) techniek heeft de aandacht getrokken in de afgelopen jaren als een instrument voor het bestuderen eiwitadsorptie, coating kinetiek en interactie proprocessen op de nanometerschaal 19,43-45. Deze techniek maakt het mogelijk om gedetailleerde detectie van massa adsorptie in real-time, en kan worden gebruikt als indicator voor het eiwit zelfassemblerende proces op proteïne roosters 19,20,42,46-48 koppeling van functionele moleculen. Daarnaast QCM-D metingen opent de mogelijkheid om metalen interactie processen te bestuderen met de proteïneachtige laag onder natuurlijke biologische omstandigheden. In een recente studie, de interactie van de S-layer-eiwit met bepaalde metalen zoals Eu (III), Au (III), Pd (II) en Pt (II) is onderzocht met QCM-D 19,20. Het geadsorbeerde eiwit laag kan dienen als een vereenvoudigd model van een celwand van Gram-positieve bacteriën. Het onderzoek van deze ene component kan bijdragen tot een beter begrip van metaal interactie. Echter, alleen QCM-D experimenten geen uitspraken over oppervlaktestructuren en invloeden van metalen eiwit mogelijk te maken. Andere technieken zijn nodig om dergelijke informatie te verkrijgen. Een poswoordelijkheid voor bio-imaging nanostructuren en verkrijgen van informatie over structurele eigenschappen is de atomaire kracht microscopie (AFM).

De doelstelling van dit onderzoek was om de sorptie van goud (Au (III) en Au (0) -NPs) S-layer eiwitten te onderzoeken, met name SLP1 van L. sphaericus JG-B53. Experimenten werden uitgevoerd met charge gesuspendeerd eiwitten op schaal in een pH traject van 2,0 - 5,0 behulp van ICP-MS en geïmmobiliseerd S-lagen gebruikt QCM-D. Bovendien is de invloed van metaalzoutoplossing aan het rooster stabiliteit onderzocht latere AFM studies. De combinatie van deze technieken draagt ​​bij aan een beter begrip van de in vitro metaal interactie processen als een instrument voor het leren meer over bindende gebeurtenissen op de hele bacteriecellen over specifieke metalen affiniteiten. Deze kennis is niet alleen cruciaal voor de ontwikkeling van de toepasselijke filter materialen voor de recycling van metalen voor de bescherming van het milieu en het behoud van de rebronnen 49, maar ook voor de ontwikkeling van arrays van sterk geordende metalen NP voor diverse technische toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. micro-organismen en teeltomstandigheden

Opmerking:. Alle experimenten werden uitgevoerd onder steriele omstandigheden L. sphaericus JG-B53 werd verkregen uit een cryo-bewaard cultuur 29,30.

  1. Transfer cryo-bewaarde cultuur (1,5 ml) onder de schone bank tot 300 ml steriele voedingsoplossing bouillon (NB) media (3 g / l vleesextract, 5 g / l pepton, 10 g / l NaCl). De oplossing gedurende ten minste 6 uur bij 30 ° C daarna roeren om de voorkweek te verkrijgen voor de teelt.
  2. Cultiveren van de bacteriën onder aerobe omstandigheden in NB medium met pH = 7,0, 30 ° C in een 70 L geschaald steam-in-place bioreactor. Daarom vult de reactor met ≈ 57 L gedemineraliseerd water. Toe te voegen en te ontbinden solide NB media rechtstreeks in bioreactor (concentraties zie hierboven).
    1. Daarnaast voegen antischuimmiddel (30 pl / l NB-media) aan de media om schuimvorming tijdens de teelt te onderdrukken, dan autoclaaf (122 ° C, de temperatuur met 30 min), de mediain de reactor faciliteit.
  3. Afkoelen van de media en het uitvoeren van volledige zuurstofverzadiging. Stel de pH op 7,0 (met 1 MH 2 SO 4 en 2 M NaOH) en start de automatische inoculatie van 300 ml voorkweek. Start de gegevensregistratie van de teelt parameters bij de inenting punt. Log online parameters bv opgeloste zuurstof (DO 2), zuur en base Bovendien, en pH-waarden binnen de teelt.
    1. Controleer de bacteriegroei online door de niet-invasieve troebelheidsmetingen.
  4. Voeren extra bemonstering na elk uur van de teelt en het bepalen van verdere parameters zoals bio droog gewicht (BDW) en offline optische dichtheid (OD). Daarom verzamelen 20 ml kweek bouillon bij elk bemonsteringspunt onder steriele omstandigheden.
    1. Bepaal offline OD door fotometrische metingen van de adsorptie bij 600 nm. Gebruik steriel gefiltreerd NB-medium als een lege waarde. AftER bereiken adsorptie> 0,4 ​​verdunde celsuspensie na de lineariteit van Lambert-Beer wet.
    2. Voor bepaling van BDW centrifuge 1-5 ml bacteriesuspensie (afhankelijk van de celdichtheid) bij 5000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Droog de verkregen celpellet bij 105 ° C in een verwarmingsoven tot massaproductie stabiliteit en meet de pellet massa.
  5. Neem microscopische beelden met optische fase contrast onderzoek microscoop in 400 en 1000-voudige vergroting (respectievelijk fase contrast condensor 2 en 3) voor het controleren van de groei van bacteriën en als kruisbesmetting controle.
  6. Na het bereiken van de exponentiële groeifase gedetecteerd door online dO 2 en online troebelheid, oogsten de biomassa doorstroom centrifugatie bij 15.000 xg, 4 ° C en was de biomassa tweemaal met standaard buffer (50 mM TRIS, 10 mM MgCl2, 3 mM NaN3, pH = 7,5).
    NB: De verkregen biomassa pellet kan bij -18 & # worden opgeslagen176; C tot verder gebruik voor isolatie.

2. S-layer Protein Isolatie en zuivering

Opmerking: Zuiver SLP1 polymeren volgens een aangepaste werkwijze zoals hiervoor beschreven 2,19,30,32,50,51.

  1. Homogeniseer de gewassen en ontdooide ruwe biomassa verkregen uit kweek in standaard buffer (1: 1 (w / v)) naar flagella verwijderen met behulp van een verspreider (niveau 3, 10 min) onder ijsbadkoeling bij 4 ° C.
  2. Centrifugeer de suspensie (8000 xg, 4 ° C gedurende 20 min) en was de verkregen pellet tweemaal met standaard buffer (1: 1 (w / v)). Na wassen en centrifugeren (8000 x g, 4 ° C gedurende 20 min), resuspendeer de pellet in standaard buffer (1: 1 (w / v)), voeg DNase II en RNase (0,4 eenheden / g biomassa) aan de suspensie en desintegreren de cellen bij 1000 bar met een hogedruk-homogenisator. Daarna Centrifugeer de suspensie bij 27.500 xg, 4 ° C gedurende 1 uur.
    Opmerking: Controle celsuspensie met het onderzoek microscope. Breuk wordt voltooid wanneer minder dan 2 - 3 intacte cellen zijn zichtbaar in het gebied van de microscoop in 400-voudige vergroting weergeven.
  3. Was de pellet twee keer met standaard buffer (1: 1 (w / v)) en opnieuw uit het centrifugeren. Daarna resuspendeer de pellet in standaardbuffer (2: 1 (w / v)) gemengd met 1% Triton X-100 en incubeer gedurende 20 minuten onder achtereenvolgende schudden (100 rpm) tot lipideafzettingen oplosbaar.
  4. Centrifugeer de oplossing (27500 xg, 4 ° C gedurende 1 uur) en was de verkregen pellet driemaal met standaard buffer (1: 1 (w / v)).
  5. Incubeer de pellet verkregen na additionele centrifugatie (27.500 x g, 4 ° C gedurende 1 uur) voor 6 uur in standaard buffer (1: 1 (w / v)) gemengd met 0,2 g / L lysozyme, om bindingen in peptidoglycaan 50 hydrolyseren. Bovendien voeg DNase II en RNase (elk 0,4 eenheden / g biomassa) aan de suspensie.
  6. Na centrifugatie (45.500 x g, 4 ° C, 1 uur), resuspendeer de bovenste eiwitproteïne fase met een geringe hoeveelheid tHij centrifugeren supernatant (<30 ml) dat eiwitsubeenheden.
  7. Oplosbaar witte suspensie door het mengen van 1: 1 met 6 M guanidine hydrochloride (6 M GuHCl, 50 mM TRIS, pH = 7,2). De oplossing wordt helder.
  8. Voer steriele filtratie (0,2 urn) van de GuHCI behandelde oplossing gevolgd door een extra snelle centrifugatie (45.500 x g, 4 ° C gedurende 1 uur).
  9. Breng de supernatant dialysemembraan buizen (MWCO 50.000 Dalton) en gedialyseerd tegen herkristalliseren buffer (1,5 mM TRIS, 10 mM CaCl2, pH = 8,0) gedurende 48 uur.
  10. Breng de witte gerekristalliseerde eiwit polymeeroplossing in buizen en centrifugeer bij 45.500 xg, 4 ° C gedurende 1 uur. Resuspendeer de pellet in een lage hoeveelheid ultrazuiver water (<30 ml).
  11. Daarna breng de suspensie in dialysemembraan buizen en uitvoeren van een dialyse tegen ultrapuur water gedurende 24 uur tot buffer inhoud te verwijderen.
    Opmerking: Een aantal wijzigingen van buffer of ultrapuur water dijdens dialyse zijn onmisbaar.
  12. Lyofiliseren de gezuiverde SLP1 in een vriesdroger.

3. Karakterisering en kwantificering van SLP1 Experimenten

Opmerking: SLP1 concentratie voor sorptie en coating experimenten werden gekwantificeerd door UV-VIS spectrofotometrie.

  1. Pipet 2 pl opgelost SLP1 monster direct op de onderste meting voetstuk van de fotometer. Bepaal eiwit concentratie adsorptie maximum bij een golflengte van 280 nm, karakteristiek voor eiwitten. Gebruik de extinctiecoëfficiënt van 0,61 tot SLP1 concentratie te bepalen. Gebruik SLP1 vrije oplossing voor referentie metingen.
  2. Verdun het eiwit met de buffer (voor sorptie experimenten in batch modus 0,9% NaCl, pH = 6,0 en voor QCM-D experimenten gebruikt herkristallisatie buffer, pH = 8,0) om de gewenste concentratie experimenten (1 g / l en 0,2 g / l respectievelijk).
  3. Analyseer SLP1 kwaliteit en het molecuulgewicht van de standaard bioanalytical werkwijze natriumdodecylsulfaat polyacrylamide elektroforese (SDS-PAGE) beschreven door Laemmli, UK 52.
    1. Het uitvoeren van SDS-PAGE voor het gebruik SLP1 binnen experimenten en bijvoorbeeld na Au (0) -NP incubatie met 10% polyacrylamide scheiding gels.
    2. Voor SDS-monsters mix ≈10 ul van de teelt of eiwit monster met monsterbuffer (1,97 g TRIS, 5 mg broomfenolblauw, 5,8 ml glycerine, 1 g SDS, 2,5 ml β-mercaptoethanol, vullen met ultrapuur water tot 50 ml) in een verhouding van 1: 1 (v / v) en pipet het mengsel na 4 min incubatie bij 95 ° C in de gel zakken.
    3. Run SDS-PAGE 30 min bij een spanning van 60 V tot de monsters voorbij het verzamelen gel en verandering voltage 120 V bij het passeren van de scheiding gel.
    4. Verwijder de gels uit het gelsysteem, spoelen met ultrapuur water en voor 1 uur in fixatie-oplossing (10% zuur acid, 50% absolute ethanol). Daarna, spoel de gels met ultrapuur water.
    5. Vlek gelsmet behulp van een aangepaste niet-specifieke colloïdale Coomassie brilliant blue methode 53,54. Na ontkleuren 72,73, neem SDS-PAGE beelden door de gel documentatiesysteem volgens het protocol van de fabrikant.

4. Sorptie experimenten in batch-modus en Metal kwantificering

  1. Voor batch sorptie experimenten bereiden Au (III) voorraadoplossing van HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O verdunnen metaalzout en meng deze met de SLP1 / NaCl-oplossing een eerste metalen concentratie van 1 mM en uiteindelijke SLP1 concentratie van 1 g / l . Voeren experimenten in drieling met een extra negatieve controle zonder SLP1. Gebruik een totaal volume van 5 ml voor sorptie experimenten.
  2. Schud de suspensie continu bij RT op verschillende vooraf ingestelde pH-waarden tussen 2,0-5,0 voor 24 uur (pas pH met een laag geconcentreerd HCl en NaOH-oplossing).
  3. Na sorptie Centrifugeer de monsters bij 15.000 xg, 4 ° C gedurende 20 min) om SEPARat SLP1 van supernatant.
  4. Breng de bovenstaande in ultrafiltratie buizen (MWCO 50.000 Da) en gecentrifugeerd bij 15.000 xg dit, 4 ° C gedurende 20 min opgeloste eiwit monomeren te verwijderen.
  5. Bepaal de concentratie van metalen in de resulterende filtraat door ICP-MS 19,20 en de resultaten gebruiken voor back-berekening van gesorbeerde metalen door de SLP1 droge massa. Meten principes, werden de mogelijkheden van de methode en de onderdelen van de gebruikte ICP-MS beschreven in de literatuur 55.
    1. Bereid monsters en referenties voor ICP-MS metingen met 1% HNO 3 als matrix en rhodium als een interne standaard (1 mg / ml).

5. Synthese van Au-NP en Bepaling van de deeltjesgrootte

Opmerking: Citraat gestabiliseerde Au (0) -NP werden gesynthetiseerd volgens een aangepaste werkwijze eerder beschreven door Mühlpfordt, H. et al. (1982) om bolvormige deeltjes te verkrijgen met een diameter van 10 - 15 nm 56,57

  1. Bereid een gestabiliseerde 25 mM HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O voorraad voor de NP formatie.
  2. Verdunnen 250 ul van deze voorraad oplossing in 19,75 ml ultrapuur water en incubeer deze gedurende 15 min onder opeenvolgende schudden bij 61 ° C.
  3. Bereid 5 ml van een tweede voorraadoplossing (12 mM looizuur, 7 mM natriumcitraat di-hydraat, 0,05 mM K 2 CO 3) en incubeer de 2e oplossing afzonderlijk bij 61 ° C gedurende 15 min.
  4. Voeg onder voortdurend roeren de 2 de voorraad oplossing voor een oplossing. Roer het reactiemengsel gedurende ten minste 10 minuten bij 61 ° C. Daarna afkoelen van de oplossing en het gebruiken voor NP coating op SLP1 rooster binnen QCM-D experimenten.
    Opmerking: De verkregen Au (0) -NP werden gekarakteriseerd met UV-VIS spectroscopie van het absorptiemaximum van 520 nm, gewoonlijk gebruikt voor de detectie van gevormde Au (0) -NPs 58. De oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C.
  5. Analyseer de grootte van de gevormdeAu (0) -NP door fotoncorrelatiespectroscopie (PCS), dat ook bekend staat als dynamische lichtverstrooiing.
    1. Voor de bepaling van NP grootte, overdracht 1,5 ml gesynthetiseerde Au (0) -NP oplossing in cuvettes onder stofvrije omstandigheden in een laminaire stroming doos en analyseren met een grootte en zetapotentiaal particle sizer. Een gedetailleerde beschrijving van PCS en monstervoorbereiding gegeven in Schurtenberger, P. et al. (1993) 59 en Jain, R. et al. (2015) 60.

6. QCM-D Experimenten - SLP1 Coating op oppervlakken en Au-NP Adsorptie op SLP1 Lattice

Opmerking: De metingen werden uitgevoerd met een QCM-D uitgerust met maximaal vier modules stroom. All QCM-D-experimenten werden uitgevoerd met een constante stroomsnelheid van 125 pl / min bij 25 ° C. SLP1 coating en metalen / NP incubatie werden uitgevoerd op SiO 2 piëzo-elektrische AT-cut kwarts sensoren (Ø 14 mm) met een fundamentele frequentie van ≈ 5 MHz. Spoelstappen en voegvulle oplossing zijn gemarkeerd in de cijfers van de resultaten representatief deel. De QCM-D experimenten kan worden omschreven als een stapsgewijze wijze beginnend met het schoonmaken en oppervlaktemodificatie van de gebruikte sensors gevolgd door herkristallisatie SLP1 en daarna het metaal en metaal NP interactie.

  1. Reinigen Procedure:
    1. Voorzie de vloeistof cellen met sensor dummies. Pomp minstens 20 ml (elk per module) van alkalisch reinigingsmiddel (2% reinigingsmiddel in ultrazuiver water (v / v)) door de QCM-D en buissysteem. Daarna pomp de vijfvoudig volume (elk per module) ultrazuiver water door het systeem (debiet tot 300 ul / min). Voer de reiniging volgens het protocol van de fabrikant.
    2. Reinig de SiO 2 sensoren buiten de stroom modules door incubatie (minstens 20 min) in 2% SDS-oplossing en spoel de sensoren daarna meerdere malen met ultrapuur water 61,62.
    3. Droog de kristallen met gefilterd compingressed lucht en plaats ze in een ozon reinigingskamer 20 min 63,64.
    4. Herhaal de reinigingsprocedure tweemaal om alle organische inhoud te verwijderen.
    5. Om gebonden metalen uit het sensor oppervlak te verwijderen spoel de sensoren met 1 M HNO 3. Daarna voer alle spoelstappen met ultrapuur water.
  2. Sensor Surface Wijziging door Polyelektrolyten:
    Opmerking: Oppervlakte modificatie kan worden gedaan binnen (doorstromen procedure) of buiten de stroom module (LbL techniek). Binnen deze experimenten als volgt aan de oppervlakken te wijzigen gebruikt.
    1. Wijzig de sensoren met 3 g / l PE afwisselende lagen van polyethyleenimine (PEI, MW 25.000) en polystyreensulfonaat (PSS, MG 70.000) via dip coating Lbl techniek 40,41 eerder beschreven voor het speciale gebruikte systeem in het artikel van Suhr, M. et al. (2014) 19.
    2. Plaats de sensoren in de juiste PE-oplossing in diepe well platen en incubeer deze gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    3. Neem de sensoren van PE-oplossing en spoel de sensoren tussen elke dip coating stap intensief met ultrapuur water.
      Opmerking: De nieuwe oppervlaktemodificatie uit ten minste drie lagen PE eindigend met positief geladen PEI.
    4. Na deze externe wijziging plaats van de sensoren in de stroom module en evenwicht de sensoren door spoelen met ultrapuur water voor aanvang van de experimenten.
  3. SLP1 Monolayer Herkristallisatie:
    1. Los SLP1 in 4 M ureum voor het omzetten van polymeren in monomeren.
    2. Centrifugeer de monomerized eiwitten bij 15.000 xg, 4 ° C gedurende 1 uur tot grotere agglomeraten eiwit te verwijderen.
    3. Meng het oplosbaar en gecentrifugeerd SLP1 supernatant met herkristallisatie buffer tot een uiteindelijke eiwitconcentratie van 0,2 g / l.
      Opmerking: De calcium afhankelijk herkristallisatie van SLP1 (zelf-assemblage) begint door de toevoeging van de recrystallization buffer. Derhalve pomp de gemengde oplossing met een debiet van 125 ul / min naar de sensors (geplaatst in de stroom modules) onmiddellijk. De herkristallisatie wordt uitgevoerd na stabiele waarden van frequentie en dissipatie verschuivingen binnen QCM-D experimenten werden gedetecteerd.
    4. Na succesvolle eiwit herkristallisatie bovenop de PE-gemodificeerde sensors in de stroom modules spoel de beklede sensoren met herkristallisatie buffer of ultrazuiver waterintensively met een debiet van 125 ul / min tot stabiele waarden van frequentie en afbraak verschuivingen werden gedetecteerd.
      Opmerking: De SiO 2 oppervlaktemodificatie met PE later sorptie experimenten op SLP1 monolaag en AFM studies wordt gevisualiseerd in figuur 1.

Figuur 1
Figuur 1. Schematische Ontwerp van PE Surface Wijziging en SLP1 MonolayerCoating; Dit cijfer is aangepast van Suhr, M. et al. (2015) 19 met toestemming van Springer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Metaal en metaal NP Interactie:
    Opmerking: De sorptie met Au metaalzoutoplossing (HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O) werd in een concentratie van 1 mM of 5 mM bij pH = 6,0 in 0,9% NaCl oplossingen uitgevoerd. Au-NP adsorptie werd met onverdund au-NPs in 1,6 mM tri-natrium-citraatbuffer bij pH ≈ 5,0.
    1. Na succesvolle SLP1 coating in de stroom modules, spoel de verkregen SLP1 lagen intensief met 0,9% NaCl-oplossing totdat stabiele waarden van frequentie en afbraak verschuivingen werden gedetecteerd.
    2. Pomp de bereide metaaloplossing (1 mM) en NP oplossing om de stroom modules met een stroomsnelheid van 125 pl / min en volgen de massa adsorptie aan het Slp1 laag. Mass adsorptie kan direct worden gedetecteerd door het volgen van de frequentieverschuivingen verwijzing naar de Sauerbrey vergelijking (Vergelijking 1).
    3. Na het voltooien van de interactie metalen en NP, spoel de laag met metaal / NP vrije buffer zwak gebonden of zwak verbonden metalen of nanodeeltjes te verwijderen.
      Opmerking: Een weergave van de experimentele opstelling wordt getoond in figuur 2.

Figuur 2
Figuur 2. Schematische Ontwerp van QCM-D Setup met behulp van Flow Module QFM 401 * 66. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Gegevensregistratie en Evaluatie:
    1. Noteer de verschuivingen in de frequentie in Hz (Af n) en dissipatie (AD n) Binnen de QCM-D experimenten met QCM-D specifieke software.
    2. Gebruik voor de evaluatie van de geadsorbeerde massagevoeligheid (Δm) de Sauerbrey vergelijking / model (Vergelijking 1) 65 66 die geldig is voor dunne en harde films gekoppeld wrijvingsloos op het sensoroppervlak aangebracht op de n boventoon. De term C (Sauerbrey constant) voor het gebruik van 5 MHz AT cut kwarts sensor is 17,7 ng ∙ Hz -1 ∙ cm -2 68. Voor stijve, gelijkmatig verdeeld en voldoende dun geadsorbeerd lagen gebruiken vergelijking 1 als een goede benadering.
      Vergelijking 1
    3. Voer aanvullende modellering volgens de Kelvin-Voigt model geldig viscoelastische molecules 68-71 met fabrikantspecifieke software en de resultaten te vergelijken met die van de Sauerbrey model.
    4. Voor de berekening van de laagdikte en het massale gebruik adsorptiebelangrijk modeling parameter een laag dichtheid van de geadsorbeerde laag van 1,35 g ∙ cm -3 corresponderen met waarden eerder beschreven voor S-layer eiwitten 72-75. Gebruik hetzelfde geldt voor de berekening van metaal interactie met de proteïneachtige laag.

7. AFM Metingen

  1. Voeren studies met volledig in staat AFM op een omgekeerde optische microscoop.
    1. Record AFM beelden in vloeistof met behulp van de herkristallisatie buffer of ultrapuur water direct op de gecoate QCM-D-sensoren.
    2. Spoel de sensoren met ultrapuur water na QCM-D experimenten en plaats ze in de AFM vloeistof cel. Daarom is een gesloten fluïdumcel met een totaal volume van ongeveer 1,5 ml. Houd de temperatuur van het fluïdum celconstante bij 30 ° C.
    3. Gebruik een cantilever met een resonantiefrequentie van 25 kHz ≈ in water en een stijfheid van <0,1 N / m. Pas de scansnelheid tussen 2,5 en 10 um / sec.
      4. 76.
      Opmerking: Hoogte afbeeldingen worden weergegeven met z-schaal terwijl z-waarden de exacte topografie van het oppervlak. Amplitude (Pseudo 3D) beelden worden getoond zonder z-schaal omdat amplitude z-waarden zijn afhankelijk van het scannen van de parameters en dragen beperkte informatie. Analyse van de beelden werd gedaan met behulp van drie verschillende evaluatie software 77.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Teelt van micro-organismen en SLP1 karakterisering

De opgenomen gegevens van bacteriegroei geeft het einde van de exponentiële groeifase bij ongeveer 5 uur. Eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat SLP1 kunnen worden geïsoleerd uit het ogenblik van de oogst (4,36 g / L natte biomassa (≈ 1,45 g / L (BDW)) met een maximale opbrengst 19. Niettemin optimalisatie van de teelt met gedefinieerde media componenten of fe- batchkweek strategieën zouden destijds leiden tot hogere opbrengsten biomassa. Dit is onvervreemdbaar voor het gebruik van hoge hoeveelheid biomassa voor industriële toepassingen. De waarden van de online en offline opgenomen kweken parameters zijn in figuur 3A. Microscopische control (figuur 3B) van de oogst voorstelling non-gesporuleerde cellen van L. sphaericus JG-B53.


Figuur 3: (A) online en offline gemeten teelt parameters van L. sphaericus JG-B53 en (B) microscopische beeld van vitale bacteriën cellen van L. sphaericus JG-B53 op het moment van de oogst in de 400-voudige vergroting; Dit cijfer is aangepast van Suhr, M. et al. (2014) 19 met toestemming van Springer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ook kan een additioneel gemaakt SDS-PAGE eiwitprofiel (figuur 4A) geeft de maximale hoeveelheid SLP1 bij de 5 uur kweken. Het eiwit band die overeenkomt met SLP1 (≈ 150 kDa) is dikker, maar vanaf hier op een verlies in intensiteit waargenomen en grotied door een toename van eiwitten met een lager molecuulgewicht als gevolg van mogelijke eiwit versnippering of afzonderen van andere eiwitten. De banden van geïsoleerde en gezuiverde eiwitten die met de bovengenoemde (Figuur 4B) genoemde werkwijze overeenkomt met een molecuulgewicht van ongeveer 150 kDa, die zwaarder is dan het berekende gewicht op basis van sequentie-gegevens van SLP1 (116 kDa) 30. Dit is waarschijnlijk het gevolg van posttranslationele modificaties. Andere redenen voor de discrepantie tussen de theoretische moleculaire massa en de waargenomen molecuulgewicht in SDS gels worden eventueel op te laden afhankelijk artefacten in de SDS-gel 30.

Figuur 4
Figuur 4. eiwitprofielen Gemaakt door SDS-PAGE van (A) gedesintegreerd bacteriecellen verkregen uit de teelt monsters en (B) gezuiverd SLP1 na een succesvolle isolatie; Deze figuur is aangepast Suhr, M. et al. (2014) 19 met toestemming van Springer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Batch-sorptie Experimenten en Bepaling van Au met ICP-MS

De maximale metaalbindende capaciteit (Qmax) van Au (III) gesuspendeerd SLP1 zijn weergegeven in figuur 5. De resultaten tonen dat Au (III) werd stabiel gebonden SLP1 tijdens de 24 uur incubatie in het onderzochte pH gebied. De resultaten geven Qmax in het bereik van ongeveer 80 - 100 mg Au (III) / g SLP1. De samengevatte waarden (Tabel 1) werden vergeleken met de absorptiecapaciteit van ongeveer 75 mg Au (III) / g SLP1 eerder gemeld door Suhr, M. et al. (2014), verkregen uit experimenten met zelf-aanpassingpH-waarde door toevoeging van het metaalzout (pH ≈ 4,3) 19. Samenvattend heeft SLP1 aangetoond het vermogen om grote hoeveelheden oorspronkelijk toegevoegde Au (III) binden bewijst zijn hoge bindingscapaciteiten voor dit onderdeel.

Figuur 5
Figuur 5. Diagram van Maximum metaalbindende vermogen (Qmax) van Au (III) te SLP1 polymeren bij pH-experimenten vergeleken sorptie resultaten met behulp van zelf-aangepaste pH-waarde (≈ 4,3) gerapporteerd door Suhr, M. et al. (2014) 19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De berekende metaal verwijderen efficiëntieverbeteringen (RE) binnen de onderzochte pH-bereik waren tussen de 50 - 60% waardoor de re bevestigttaten gemaakt door Suhr, M. et al. (2014), waarin de waarden van rond de 40% werden bereikt. In eerder gemaakte experimenten sterke interacties van Au (III) met functionele groepen bijvoorbeeld carboxylic-, hydroxyl- en aminogroepen, is waargenomen voor S-layer proteïnen zoals SLP1 en voor de vergelijkende eiwit SlfB L. sphaericus JG-A12 1,78. Jankowski, U. et al. (2010) spectroscopisch gedetecteerd een sterke interactie van Au (III) voornamelijk carbonzuurgroepen van SlfB die ook kan worden afgeleid voor SLP1 van L. sphaericus JG-B53 20,79,80. Ook intrinsieke eiwiteigenschappen die Au (III) zal reduceren tot Au (0) bij afwezigheid van reducerende middelen kan een oorzaak van de sterke interactie 79 zijn. Bovendien geven de resultaten van deze studie tonen de neiging van een binding van SLP1 voorkeur bij lagere pH waarden. Aan de andere kant een binding bij lagere pH-waarde kan ook leiden tot een denaturatie van SLP1. Studies naar het SLP1 bleek een eiwitstabiliteit beneden tot pH =3,0 (ongepubliceerde resultaten). Van desorptie experimenten onder zure omstandigheden, via bijvoorbeeld salpeterzuur of via complexvormers zoals EDTA of citraat (gegevens niet getoond), verifieert goud stabiel was gebonden en kon niet worden afgegeven uit SLP1 polymeren.

Au (III) op SLP1 van L. sphaericus JG-B53
c initiële (mg / l) 196,97
pH 5 4.5 ≈ 4,3 23 4 3.5 3 2.5 2
waarde
Qmax 88.3 85.3 74.7 102.5 94.1 81 101,9 96.9
(mg Au (III) / g SLP1)
OPNIEUW 47.1 47.8 37.9 57.1 54.1 44.8 58.7 56.5
(%)

Tabel 1: Maximaal Metal Binding Capaciteiten (q max) en metaal verwijderen Efficiëntieverbeteringen (RE) van de Batch-adsorptie Experimenten met Au (III) en SLP1 Polymers in Solution Geanalyseerd door ICP-MS. Gegevens vergeleken met eerder gepubliceerde resultaten van Suhr, M. et al. (2014) 19.

SLP1 Monolayer Herkristallisatie rupsbanden door QCM-D

De directe afname frequentie (5 Af, Af 7, 9 Af, Af 11) geeft een snelle absorptie en een hoge affiniteit van de eiwitten aan het PE gemodificeerd oppervlak (figuur 6A). Gelijk aan de snelle verandering in de frequentie, de dissipatie (AD 5, AD 7, AD 9, AD 11) verhoogt ook onmiddellijk. Dit feit geeft een adsorptie van viscoelastische moleculen aan het oppervlak vanwege snelle demping leidt tot een hogere dissipatie waarden. De maximale frequentieverschuiving wordt na 5 min met een waarde van ≈ 95 Hz en AD van 4,2. In een later stadium alleen herschikkingen van gekristalliseerd SLP1 optreden. SLP1 adsorptie werd thusly uit voor meer dan 60 minuten om ervoor te zorgen t uitgevoerdhij de vorming van een bijna volledig gedekt oppervlak en regelmatig besteld eiwitraster. Het experiment toont aan dat positief geladen PE-laag is onvervreemdbaar voor een stabiele coatings, negatieve uitgang aanpassing leidt tot een zwakke adsorptie en langere coating kinetiek (gegevens niet getoond) 38. Zwak verbonden eiwitten en agglomeraten werden uitgespoeld met SLP1-vrije buffer herkristallisatie. De kleine veranderingen van Af n bevestigen de lage eiwit desorptie en stabiele adsorptie van SLP1. Ondanks dat de dissipatie omlaag naar ≈ 2,8 aangeeft dat groter elastische moleculen worden verwijderd.

Figuur 6
Figuur 6. Herkristallisatie van SLP1 van gemodificeerde SiO 2 Sensoren Analyzed by QCM-D; (A) in Af / AD plot en (B) de dikte oppervlak profile; Dit cijfer is aangepast van Suhr, M. et al. (2014) 19 met toestemming van Springer en Suhr, M. (2015) 20. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het oppervlakteprofiel berekend door de eerder genoemde modellen tonen een SLP1 monolaag dikte van ≈ 11,2 nm (Kelvin-Voigt model voor elastische films) en 10,0 nm (Sauerbrey model stijve laag) (Figuur 6B). Deze waarden zijn lager dan die gerapporteerd door Suhr, M. et al. (2014). De verschillen kunnen worden verklaard door een ander gebruikte waarde eiwitlaag densiteit binnen het modelleren. De huidige waarden moeten dichter bij realiteit dikte van S-layer layer eiwitten op het celoppervlak van levende cellen van L. zijn sphaericus JG-B53 31,42. Dit model toont aan dat de Sauerbrey relatie is ongeschikt voor akoestische dunne proteïneachtige laag door een vermeerdering van de shear akoestische golf in viscoelastische vloeistof folies 81,82 die resulteert in een onderschatting van de geadsorbeerde SLP1 massa en dikte. Dit kan worden verklaard door de elastische eigenschappen van de S-layer eiwitten en de koppeling van watermoleculen in het adsorptieproces. De interactie van water met eiwitten kan gemakkelijk worden beschreven door de vorming van hydratatie schelpen, viskeuze slepen of insluiting in holtes in de geadsorbeerde laag 83. Dit bewerkstelligt een hogere laagdikte gemeten met de Kelvin-Voigt model en kan ook duidelijk de verschillen in de laagdikte verkregen door twee verschillende modellen. In eerdere AFM studies werden laagdikte van SLP1 roosters van ongeveer 8-12 nm gemeten. Door het berekenen van de massa adsorptie van SLP1, in plaats van laagdikte, een totaal Δm van 1506,6 ng ∙ cm -2 (Kelvin-Voigt-model) werd berekend. De gegevens van de massa adsorptie aan surfazen zijn samengevat in Tabel 2 en tonen een hoge massa adsorptie met de waarden van de Kelvin-Voigt model.

m max Δm max dikte dikte
(ng / cm2) (ng / cm2) (nm) (nm)
(Kelvin-Voigt) (Sauerbrey) (Kelvin-Voigt) (Sauerbrey)
SLP1 na het coaten en spoelen 1,505.6 1,351.6 11.2 10

Tabel 2: Geadsorbeerde Massa van SLP1 van gemodificeerde Polyelectrolyte SiO 2 Kristallen Analyzed by QCM-D na het spoelen met Omkristalliseren Buffer (pH = 8,0) en Berekend Laagdikte.

QCM-D als Tool voor detectie van Metal en Metal NP Interactie met Eiwitachtige SLP1 Monolayer

De interactie van herkristalliseerd SLP1 monolaag met 1 mM en 5 mM opgelost Au (III) onderzocht. De resultaten van de totale geadsorbeerde massa verkregen uit berekeningen en modellering van de geregistreerde data van veranderingen in de frequentie en dissipatie worden samengevat in Tabel 3. De QCM-D studies van Au (III) interactie met de monolagen bieden een dieper begrip van de metaal-biomolecuul interactie. Voor het eerst de bindingscapaciteit, sorptie kinetiek en hoe de metal beïnvloedt de stabiliteit eiwit werden bestudeerd in een nano-range. Na de toevoeging van het metaalzout oplossing van het SLP1 monolaag de frequentie verlaagd binnen de eerste 5 min hetgeen een snelle massa adsorptie. Niettemin werd de adsorptie van Au niet aangevuld na 60 min zoals beschreven voor andere metalen zoals Pd (II) in eerdere studies 19. De massatoename optreedt tot 18 uur. Hierna werden wasstappen uitgevoerd met metaalvrije buffer waaruit blijkt dat de geadsorbeerde metaal vrijwel stabiel is gebonden aan het geherkristalliseerd SLP1 laag. Tenslotte totaal metaal absorptie van 955,0 ± 2,7 ng ∙ cm -2 (Kelvin-Voigt-model) werd verkregen bij het ​​1 mM Au (III) -oplossing en 4,534.4 ± 5,5 ng ∙ cm -2 (Kelvin-Voigt model) in Bij 5 mM Au (III). De hogere waarden verkregen door 5 mM Au (III) oplossing kan worden verklaard door intrinsieke eigenschappen reductie van SLP1 wanneer spoortje metaal Au (0) -NP gevormd uit deze oplossing. Deze reducerende juistebanden van SLP1 zijn reeds in eerdere studies Pd (II) en Au (III) 32,33,79,84. De gegevens toonden ook dat de interactie met de goudoplossing niet leidt tot een destabilisatie van het eiwit lagen. Dit geeft de specifieke en stabiele binding van Au (III) te SLP1, die ook bevestigd door ICP-MS metingen met eiwitpolymeren.

De vorming van Au (0) -NP tijdens de synthese kan worden gevisualiseerd door kleurverandering van het uitgangsmateriaal gele oplossing roodachtig één. Deze kleurverandering wordt veroorzaakt door de excitatie van het oppervlak plasmon trillingen van metallische nanodeeltjes en bewijst de vorming van Au (0) -NPs 1,78. Verder kleinere NP kan worden gesynthetiseerd door de variatie van de concentratie van het reductiemiddel (hogere looizuurconcentratie) 85 toegankelijk in een andere kleur van de oplossing en gecontroleerd door de resultaten van metingen PCS (gegevens niet getoond). Op deAnderzijds verhogen looizuurconcentratie leidt tot een verlies aan stabiliteit NP en NP neiging te agglomereren 20. Als bewijs van principe, pre-gesynthetiseerde Au (0) -NPs (grootteverdeling van 10 - 18 nm gemeten met PCS zien in figuur 7A) werden geïncubeerd met hangende SLP1 voor 48 uur en door SDS-PAGE geanalyseerd. Het eiwit profiel weergegeven in figuur 7B verifieert de conclusie van QCM-D data, dat Au (0) -NPs niet de SLP1 structuur verstoren. De eiwitbanden waargenomen bij 150 kDa tonen de aanwezigheid van intacte SLP1.

Figuur 7
Figuur 7. (A) Aantal gewogen grootteverdeling van pre-gesynthetiseerde Au (0) -NPs gemeten met PCS en (B) SDS-PAGE profiel van eiwit SLP1; laan 1: 2 ug SLP1 voor Au (0) -NPs interactie en laan 2: 1 ug SLP1 polymeren in suspensie na 48 uur incuba tie met pre-gesynthetiseerde Au (0) -NPs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Na de NP-synthese en karakterisering werden QCM-D experimenten uitgevoerd. De adsorptie van pre-gesynthetiseerde metallic Au (0) -NPs wordt exemplarisch getoond QCM-D experimenten Af / AD plaatsen (Figuur 8 A) en dat de dikte en massa-profielen (figuur 8B).

Figuur 8
Figuur 8. Adsorptie van Pre-gesynthetiseerde Au (0) -NPs op gekristalliseerd SLP1 Lattice Analyzed by QCM-D, (A) in Af / AD plot en (B) laag oppervlak en massa-profiel.blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het kan worden bevestigd dat QCM-D kan worden gebruikt om de adsorptie van de 10 sporen - 18 nm bolvormige Au (0) -NPs. Na toevoeging van de onverdunde Au-NP-oplossing (A 520 nm = 1), verkregen door de synthese beschreven, de frequentie af, hetgeen een directe indicator massa adsorptie beschreven door de voorspelling van de Sauerbrey vergelijking (Vergelijking 1). De adsorptie van Au (0) -NPs bijna voltooid in minder dan 60 min. Na deze tijd niet meer NPs werden op de bovenkant van het SLP1 rooster, zodat kan worden aangenomen dat alle reactieve plaatsen of poriën werden bezet door Au (0) -NPs. De getoonde afname dissipatie kan worden aangesloten bij de verstijving van SLP1 rooster veroorzaakt door de NP interactie. De waarden van de totale massa adsorptie zijn samengevat in tabel 3. Zelfs intensieve spoeling met de NP-vrije citraatbuffer leidt neiterugkeerde naar een desorptie van NP's noch een detachement van de SLP1 monolaag. Daarom kan een stabiele en sterke interactie worden voorspeld voor de Au (0) -NP interactie in dezelfde betrekking als met Au (III).

Metaal c metal Δm max Δm max dikte dikte
(ng / cm2) (ng / cm2) (nm) (nm)
(Kelvin-Voigt) (Sauerbrey) (Kelvin-Voigt) (Sauerbrey)
1 mM 955 932,6 --- ---
5 mM 4,534.4 4,687.9 --- ---
Au (0) - --- 1,382.9 1,382.7 10.2 10.2
NP

Tabel 3: Geadsorbeerde mis op gekristalliseerd SLP1 Lattice na Au (III) Interactie (pH = 6,0) en Au-NP Adsorptie (pH = 4,7) Geanalyseerd door QCM-D en Berekening van Laagdikte na Au (0) -NP Coating. Gegevens vergeleken met eerder gepubliceerde resultaten van Suhr, M. et al. (2014) 19.

AFM Visualisatie van Nanometer Scaled Structuren

figuur 9, de eiwitraster van SLP1 herkristalliseerd on PE gemodificeerde sensoren wordt getoond met zijn typische vierkant rooster (p4) als amplitude afbeeldingen. De roosterconstante kan worden bepaald als 13 - 14 nm, wat vergelijkbaar is met de resultaten van eerdere experimenten 30. De laagdikte van 10 nm ± 2,0 nm gemeten met AFM bevestigde de verwachte dikte van de QCM-D metingen van ≈ 11,2 nm (Kelvin-Voigt modeling) laag. Het kleine verschil in de oppervlaktehoogte wordt verklaard door het feit dat de calculated QCM-D fit beschouwt de hele sensor gebied, terwijl het hoge resolutie AFM studie toont slechts een deelgebied. Gezien deze werden eiwit agglomeraten die zijn bevestigd aan het sensoroppervlak in de berekening van de geadsorbeerde massa respectievelijk de laagdikte en leidde tot een hogere laagdikte dan bepaald door AFM.

Figuur 9
Figuur 9. AFM Amplitude Afbeelding van gekristalliseerd SLP1 Lattice van L. sphaericus JG-B53 op QCM-D kristallen Direct na Coating en spoelen met buffer en vergroting van Marked Gewest; Dit cijfer is aangepast van Suhr, M. et al. (2014) 19 met toestemming van Springer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10 toont de intacte SLP1 rooster na incubatie met Au (III) oplossing. Aangetoond kan worden dat na de incubatie het eiwitraster bleven volledig intact. Dit bevestigt de resultaten van de QCM-D experimenten die de stabiliteit van de coating voorspeld. In figuur 11A en B het geadsorbeerde pre-gesynthetiseerde Au (0) -NPs (grootte varieert van 10 - 18 nm, bepaald door PCS) op het SLP1 rooster weergegeven. Door de deeltjesgrootte, de Au (0) -NPs worden geadsorbeerd in de poriën en SLP1 niet volgen p4 -symmetry van SLP1. Au (0) -NPs zijn statistisch verdeeld over eiwitraster. Door het meten van de deeltjesgrootte in hoogte AFM afbeeldingen (gegevens niet getoond) de omvang van de NP in het bereik van 16 - 23 nm en nog kleiner, namelijk in het bereik van ongeveer 10 nm 19,20. Dit verifies de bepaalde NP omvang eerder gemeten met PCS (gezien in figuur 8).

Figuur 10
Figuur 10. AFM Amplitude Afbeelding van gekristalliseerd en Intact SLP1 Lattice op QCM-D Sensor Kristallen na incubatie van 5 mM Au (III) Solution en Vergroting van Marked Gewest; Dit cijfer is aangepast van Suhr, M. et al. (2014) 19 met toestemming van Springer en Suhr, M. (2015) 20. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11
Figuur 11. (A) AFM beeld amplitude geadsorbeerd Au (0) -NPs op herkristalliseerd SLP1 rooster op QCM-D sensor kristallen (linker) En (B) gereconstrueerde 3D ​​oppervlakteprofiel (rechts); Dit cijfer is aangepast van Suhr, M. (2015) 20 met toestemming van Springer en Raff, J. et al. (2016) Raff, J. et al. S-laag op basis van nanocomposieten voor industriële toepassingen op basis van eiwitten Engineered nanostructuren. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (ingediend)). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit werk onderzochte de binding van Au S-laag-eiwitten werd onderzocht met behulp van een combinatie van verschillende analysemethoden. Vooral de binding van Au is zeer aantrekkelijk, niet alleen voor de terugwinning van Au uit de mijnbouw water of procesoplossingen, maar ook voor de constructie van materialen, bijvoorbeeld sensorische oppervlakken. Voor studies van de interactie Au (Au (III) en Au (0) -NPs) met onderbroken en herkristalliseerd monolaag van SLP1 het eiwit moesten worden geïsoleerd. Daarom heeft deze studie aangetoond dat het succesvol kweken van gram-positieve bacteriestam L. sphaericus JG-B53 en de isolatie van de oppervlaktelaag eiwit SLP1. Toch is de teelt en eiwitisolatie blijven uitdagend en worden geoptimaliseerd. Een grootschalige productie van biomassa en S-laag-eiwitten een voorwaarde is voor industriële toepassing van beide, bijvoorbeeld voor de productie van metalen selectief filtermaterialen. De toepassing ervan potentieel is undoubtedly hoog voor het verwijderen van giftige metalen en de winning van waardevolle metalen opgelost in proces water, afvalwater of drainagewater. Bovendien kan de toepassing mogelijke S-lagen nog groter gezien hun aanvullend potentieel andere bio-geïnspireerde materialen, zoals biosensoren en katalysatoren.

De batch-adsorptie experimenten zwevende SLP1 polymeren aangegeven een hoge en stabiele binding van Au (III) binnen het onderzochte pH-traject 2,0-5,0. Daardoor kan metaalverwijdering rendementen tot 60% bereikt worden. Deze opmerkelijke binding gedrag kan worden verklaard door een sterke interactie van Au (III) met SLP1 waarschijnlijk geïnduceerd door interactie carboxylgroepen en stikstof dragende groepen aanwezig op het oppervlak van het proteïne. Deze argumenten kunnen worden versterkt door FTIR en EXAFS onderzoek naar de gelijkaardige stam L. sphaericus JG-A12 32,79. Ook kan het verminderen van de intrinsieke eigenschappen van SLP1 de hoge RE van Au (III) door redu uitleggencing aan nanodeeltjes Au (0). Aangenomen kan worden dat S-layer als eerste interface bacteriën in het milieu dienen voornamelijk bezig met metaalbindende zijn. Binnen het onderzochte pH, de hoogste metaalbinding capaciteit van 102,5 mg Au (III) / g SLP1 werd bij pH 4,0 bereikt. Het bindingsvermogen is hoger dan gerapporteerd voor andere bio-componenten, bijvoorbeeld voor geïsoleerde celwand van Bacillus subtilis (71,5 mg Au (III) / g) 86 of biomassa van Chlorella vulgaris (98,5 mg Au (III) / g) 8 .

ICP-MS gebruikt voor de bepaling van de gebonden metalen door SLP1 polymeren zeer gevoelige methode en maakt de detectie van de kleinste hoeveelheden goud in deze studie. ICP-MS biedt vele voordelen voor het uitvoeren van sporen metalen bepalingen, bijvoorbeeld, eenvoudige bediening systeem en lage detectielimieten; Indien goud tot 0,1 - 1 ppt. Dit maakt deze methode een veelzijdig instrument voor het onderzoeken biosorptive processen in lage concentratie ranges. De resultaten van dit onderzoek werden gemaakt met onderbroken S-layer polymeren en kunnen niet gemakkelijk worden overgebracht naar S-layer roosters herkristalliseerd op oppervlakken, en daarom geeft de beperking van ICP-MS. Zo kon geen directe relatie van geïsoleerde eiwit polymeren worden gesteld van S-laagstructuren op vitale bacteriecellen. Bovendien hebben de ICP-MS metingen niet maken de bepaling van de kinetische metaal sorptie. Daarom is het noodzakelijk werkwijzen geschikter voor het onderzoeken van de metaalbinding door dunne films geïmmobiliseerd eiwit te vinden.

In de onderhavige studie werden QCM-D analyses toegepast op de in situ vorming van S-layer roosters op oppervlakken en de afzetting van Au op de proteïnen te detecteren. Daarom QCM-D is een robuuste en reproduceerbare methode voor de erkenning van molecuul adsorptie en interactie processen. Bovendien QCM-D is een relatief eenvoudige, kosteneffectieve en ongevaarlijke werkwijze volgen sUch verwerkt online. De methode heeft het voordeel om de massa verandering te detecteren met een maximummassa van gevoeligheid in vloeistoffen van ≈ 0,5 ng ∙ cm -2. Dit maakt het mogelijk om zelfs zwakke interactie, bijvoorbeeld sporen van eiwit met opgeloste metalen of adsorpties in lage concentratie bereik te meten. Het nadeel van QCM-D is dat dit geen structuur beeldvormende methode die de visualisatie van bijvoorbeeld eiwit roosters maakt. Daarom zijn andere technieken nodig.

De QCM-D analyse in deze studie werden gevolgd door AFM beeldvorming. De combinatie van deze werkwijzen toegestaan ​​de studie van de sorptie kinetiek en gevolgen van Au sorptie van de bekleding, het blijkt dat deze veelzijdig gereedschap voor het onderzoeken van de interactie van metalen dunne eiwitachtige films. Verder werd aangetoond dat een betrouwbare herkristallisatie van het S-layer eiwitten op technische ondersteuning essentieel voor verdere studies eiwit interacties. Ervoorgrond, modificaties van de oppervlakken met behulp van adhesie promotors zijn van belang. De beschreven uitvoering van polyelektrolyten (eindigend met positief geladen PE's) als tussenlaag tussen SiO 2 oppervlakken en eiwitlaag tot een verbeterde werkwijze voor een snelle proteïne coating. Het positieve effect van een positief laden polyelektrolietlaag is eerder beschreven voor bijvoorbeeld immobilisatie van vitaal bacteriecellen van L. sphaericus JG-B53 31. De nakoming van de PE-lagen zijn de belangrijkste en meest kritische stap voor de latere succesvolle en reproduceerbare herkristallisatie van S-layer eiwitten.

Het kan worden aangetoond dat voor het onderzoek van dunne lagen SLP1, QCM-D is een goede manier om de massa desbetreffende adsorptie aan het eiwit herkristallisatie als monolayer films in real time te tonen. Dit kan ook eerder worden waargenomen voor de montage van de S-layer-eiwit SBPA L. sphaericus </ em> CCM2177 47. Door daaropvolgende hoge resolutie AFM analyseert veranderingen van de roosterstructuur van het eiwit zelf samenstellen kunnen worden gevisualiseerd. AFM metingen bleek de p4 symmetrie van SLP1 en bevestig de gemodelleerde laagdikte van SLP1 van ongeveer 10 nm. Ook zou de directe interactie van opgeloste metaalionen met eiwitlaag worden gevolgd door QCM-D blijkt goede binding van Au (III) van de onderliggende eiwitlaag. De waarschijnlijke vorming van de kleinste Au (0) -NPs van Au (III) -oplossing in eiwit poriën veroorzaakt door intrinsieke reducerende eigenschappen van het SLP1 rooster binnen QCM-D gemeten waarden gedetecteerd door daaropvolgende AFM metingen. Dit kan worden gerelateerd aan de resolutielimiet van AFM en opgericht in dit experimentele onderzoek. Dit toont de beperkingen van deze techniek en de noodzaak van hoge resolutie afbeelding van biomoleculen in de sub nanometerschaal. Echter, kan een hoge stabiliteit van de herkristalliseerd SLP1 laag worden afgeleid the verkregen QCM-resultaten en werd bevestigd door de AFM onderzoek.

Concluderend kan worden aangetoond dat SLP1 polymeren hoge metalen bindingscapaciteiten voor goud in het onderzochte pH-traject. Voorts heeft het onderzoek blijkt dat de SLP1 rooster is een goede matrix metaalion bindende en voor de immobilisatie van metallische nanodeeltjes. Het kan worden aangetoond dat elke methode die in dit artikel heeft de mogelijkheid om zelfs kleine metalen interacties, of in het geval van de AFM op te sporen kunnen structuren te visualiseren in de nanoschaal bereik. Hoewel alleen door de combinatie van deze werkwijzen aangetoond, dat toegestaan ​​om de kennis van de onderzochte eiwitten op moleculair niveau.

Hoofdzakelijk, QCM-D en AFM zijn de voorkeurswerkwijzen van de keuze voor toekomstige onderzoeken van eiwit monolaag adsorptie en hun interactie met metalen en functionele moleculen. Door het combineren van deze twee methoden, de detectie van S-layer-eiwit adsorptie processen oppervlak beeldvorming geeft inzicht in de moleculaire processen die in staat te worden overgedragen aan de kennis van levende bacteriën en de interactie met de omgeving te verbeteren. Deze studie toonde een fragment van mogelijke methoden nuttig voor begrip eiwit en metalen interactie. Andere handige technieken die de kennis van dergelijke processen in detail, variërend van diverse spectrometrische en chromatografische methoden om onderzoeken van biomoleculen spectroscopische en kon verbeteren moeten worden opgenomen in toekomstige studies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Het huidige werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de IGF-project "S-Sieve" (490 ZBG / 1) gefinancierd door de BMWi en de BMBF-project "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A). Speciale dank aan Tobias J. Günther voor zijn waardevolle hulp tijdens AFM studies en Erik V. Johnstone voor het lezen van het manuscript als een native speaker Engels. Verder zou de auteur van dit document graag Aline Ritter en Sabrina Gurlit bedanken (van Institute for Resource Ecology voor hulp bij het ICP-MS-metingen), Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava en de groep biotechnologie van het Helmholtz-instituut Freiberg voor Resource Technology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
equiment and software
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System Applikon Biotechnology, Netherlands Z6X Including dO2, pH sensors of Applikon Biotechnology and BioXpert software V2
Noninvasive Biomass Monitor BugEye 2100 BugLab, Concord (CA), USA Z9X ---
Spectrometer Ultrospec 1000 Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain 80-2109-10 Company now GE Healthcare Life Sciences
MiniStar micro centrifuge VWR, Germany 521-2844 For centrifugation of cultivation samples
Research system microscope BX-61 Olympus Germany LLC, Germany 037006 Microscope in combination with imaging software
Cell^P (version 3.1) Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Germany --- together with microscope
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S Carr Centritech, Florida, USA 9010PLT For biomasse harvesting
T18 basic Ultra Turrax IKA Labortechnik, Germany 431-2601 For flagella removal and sample homogenization
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA 728411 Used within protein isolation
Mobile high shear fluid processor, M-110EH-30 Pilot Microfluidics, Massachusetts, USA M110EH30K Used for cell rupture
Alpha 1-4 LSC Freeze dryer Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Germany 102041 ---
UV-VIS spectrophotometry (NanoDrop 2000c) Thermo Fisher Scientific, USA 91-ND-2000C-L For determination of protein concentration
Mini-PROTEAN vertical electrophoresis chamber Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 165-3322 For SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000 Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 1708030 Used for imaging of SDS-PAGE gels
ICP-MS Elan 9000 PerkinElmer, Waltham (MA), USA N8120536 For determination of metal concentration
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Worcestershire United Kingdom ZEN3600 For determination of nanoparticle size
Q-Sense E4 device  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-E4 ordered via LOT quantum design (software included with E4 platform)
Q-Soft 401 (data recording) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
Q-Tools 3 (data evaluation and modelling) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
QCM-D flow modules QFM 401  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QFM401 ordered via LOT quantum design
QSX 303 SiO2 piezoelectric AT-cut quartz sensors Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QSX303 ordered via LOT quantum design
Ozone cleaning chamber Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA QS-ESA006 ordered via LOT quantum design
Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFM Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA MFP-3DBio AFM measurements and imaging software
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223 Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 Software WaveMetrics, Inc., USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
BioHeater Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA Bioheater Sample heater for AFM measurements
Biolever mini cantilever,  BL-AC40TS-C2 Olympus Germany LLC, Germany  BL-AC40TS-C2 Prefered cantilever for AFM measurements
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013) Nanotec Electronica S.L. , Spain freeware Software for AFM analysis
Name Company Catalog Number Comments
Detergents and other equiment
acidic acid, 100 %, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3738.5 Danger, flammable and corrosive liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Antifoam 204 Sigma-Aldrich Co. LLC. A6426 For foam suppression
bromophenol blue, sodium salt Sigma-Aldrich Co. LLC. B5525 ---
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3862.1 ---
Deoxyribonuclease II from porcine spleen Sigma-Aldrich Co. LLC. D4138 Typ IV , 2,000 - 6,000 Kunitz units/mg protein
Ethanol, 95% VWR, Germany 20827.467 Danger, flammable
glycerine, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3783.1 ---
Guanidine hydrochloride (GuHCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 0037.1 ---
Hellmanex III Hellma GmbH & Co. KG 9-307-011-4-507 ---
Hydrochloric acid (HCl) (37%) CARL ROTH GmbH+CO.KG 4625.2 Danger; Corrosive, used for pH adjustment
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich Co. LLC. L6876  Lyophilized powder, protein = 90 %, = 40,000 units/mg protein (Sigma) 
Magnetic stirrer with heating,  MR 3000K Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany 504.10100.00 Standard stirrer within experiment
NB-Media DM180 Mast Diagnostica GmbH 121800 ---
Nitric acid (HNO3) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN50.1 Danger; Oxidizing, Corrosing
PageRuler Unstained Protein Ladder ThermoScientific-Pierce 26614 ---
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS) Sigma-Aldrich Co. LLC. 243051 Average Mw ~70,000
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich Co. LLC. 408727 Warning; Harmful, Irritant, Dangerous for the environment; average Mw ~25,000
Potassium carbonate anhydrous (K2CO3) Sigma-Aldrich Co. LLC. 60108 Warning; Harmful
Ribonuclease A from bovine pancreas  Sigma-Aldrich Co. LLC. R5503 Type I-AS, 50 - 100 Kunitz units/mg protein 
Sodium azide (NaN3) Merck KGaA 106688 Danger; very toxic and Dangerous for the environment
Sodium chloride (NaCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3957.2 ---
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich Co. LLC. L-5750 Danger; toxic
Sodium hydroxide (NaOH) CARL ROTH GmbH+CO.KG 6771.1 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation and pH adjustment
Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000  CARL ROTH GmbH+CO.KG 1893.1 ---
Sulfuric acid (H2SO4) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN52.2 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation
Tannic acid (C76H52O46) Sigma-Aldrich Co. LLC. 16201 ---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 9090.2 ---
Triton X-100 CARL ROTH GmbH+CO.KG 3051.3 Warning; Harmful, Dangerous for the environment
VIVASPIN 500, 50,000 MWCO Ultrafiltration tubes Sartorius AG VS0132 ---
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich Co. LLC. M6250 Danger, toxic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merroun, M. L., Rossberg, A., Hennig, C., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. Spectroscopic characterization of gold nanoparticles formed by cells and S-layer protein of Bacillus sphaericus JG-A12. Mater. Sci. Eng. C. 27 (1), 188-192 (2007).
  2. Raff, J., Soltmann, U., Matys, S., Selenska-Pobell, S., Bottcher, H., Pompe, W. Biosorption of uranium and copper by biocers. Chem. Mat. 15 (1), 240-244 (2003).
  3. Sleytr, U. B., Schuster, B., Egelseer, E. M., Pum, D. S-Layers: Principles and Applications. FEMS Microbiol. Rev. , (2014).
  4. Pollmann, K., Raff, J., Merroun, M., Fahmy, K., Selenska-Pobell, S. Metal binding by bacteria from uranium mining waste piles and its technological applications. Biotechnol. Adv. 24 (1), 58-68 (2006).
  5. Raff, J., Selenska-Pobell, S. Toxic avengers. Nucl. Eng. Int. 51, 34-36 (2006).
  6. Tsuruta, T. Biosorption and recycling of gold using various microorganisms. J. Gen. Appl. Microbiol. 50 (4), 221-228 (2004).
  7. Sathishkumar, M., Mahadevan, A., Vijayaraghavan, K., Pavagadhi, S., Balasubramanian, R. Green Recovery of Gold through Biosorption, Biocrystallization, and Crystallization. Ind. Eng. Chem. Res. 49 (16), 7129-7135 (2010).
  8. Das, N. Recovery of precious metals through biosorption - A review. Hydrometallurgy. 103 (1-4), 180-189 (2010).
  9. Volesky, B. Biosorption and me. Water Res. 41 (18), 4017-4029 (2007).
  10. Vilar, V. J. P., Botelho, C. M. S., Boaventura, R. A. R. Environmental Friendly Technologies for Wastewater Treatment: Biosorption of Heavy Metals Using Low Cost Materials and Solar Photocatalysis. Security of Industrial Water Supply and Management.NATO Science for Peace and Security Series C-Environmental Security. Atimtay, T. A., Sikdar, S. K. , Springer. 159-173 (2010).
  11. Lovley, D. R., Lloyd, J. R. Microbes with a mettle for bioremediation. Nat. Biotechnol. 18 (6), 600-601 (2000).
  12. Schiewer, S., Volesky, B. Environmental Microbe-Metal Interactions. Lovely, D. R. , ASM Press. Washington. 329-362 (2000).
  13. Raff, J., Berger, S., Selenska-Pobell, S. Uranium binding by S-layer carrying isolates of the genus Bacillus. Annual Report 2006 Institute of Radiochemistry. , Forschungszentrum Rossendorf. Dresden. (2006).
  14. Srinath, T., Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Chromium (VI) biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria. Chemosphere. 48 (4), 427-435 (2002).
  15. Godlewska-Zylkiewicz, B. Biosorption of platinum and palladium for their separation/preconcentration prior to graphite furnace atomic absorption spectrometric determination. Spectroc. Acta Pt. B-Atom. Spectr. 58 (8), 1531-1540 (2003).
  16. Hosea, M., et al. Accumulation of elemental gold on the alga Chlorella-vulgaris. Inorg. Chim. A-Bioinor. 123 (3), 161-165 (1986).
  17. Vogel, M., et al. Biosorption of U(VI) by the green algae Chlorella vulgaris. in dependence of pH value and cell activity. Sci. Total Environ. 409 (2), 384-395 (2010).
  18. Creamer, N., Baxter-Plant, V., Henderson, J., Potter, M., Macaskie, L. Palladium and gold removal and recovery from precious metal solutions and electronic scrap leachates by Desulfovibrio desulfuricans. Biotechnol Lett. 28 (18), 1475-1484 (2006).
  19. Suhr, M., et al. Investigation of metal sorption behavior of Slp1 from Lysinibacillus sphaericus. JG-B53 - A combined study using QCM-D, ICP-MS and AFM. Biometals. 27 (6), 1337-1349 (2014).
  20. Suhr, M. Isolierung und Charakterisierung von Zellwandkomponenten der gram-positiven Bakterienstämme Lysinibacillus sphaericus JG-A12 und JG-B53 und deren Wechselwirkungen mit ausgewählten relevanten Metallen und Metalloiden. , Technische Universität Dresden. (2015).
  21. Spain, A., Alm, E. Implications of Microbial Heavy Metal Tolerance in the Environment. Reviews in Undergraduate Research. 2, Rice University . Houston. 1-6 (2003).
  22. Ledin, M. Accumulation of metals by microorganisms - processes and importance for soil systems. Earth-Sci. Rev. 51 (1-4), 1-31 (2000).
  23. Maruyama, T., et al. Proteins and Protein-Rich Biomass as Environmentally Friendly Adsorbents Selective for Precious Metal Ions. Environ. Sci. Technol. 41 (4), 1359-1364 (2007).
  24. Sara, M., Sleytr, U. B. S-layer proteins. J. Bacteriol. 182 (4), 859-868 (2000).
  25. Baranova, E., et al. SbsB structure and lattice reconstruction unveil Ca2+ triggered S-layer assembly. Nature. 487 (7405), 119-122 (2012).
  26. Teixeira, L. M., et al. Entropically Driven Self-Assembly of Lysinibacillus sphaericus S-Layer Proteins Analyzed Under Various Environmental Conditions. Macromol. Biosci. 10 (2), 147-155 (2010).
  27. Ahmed, I., Yokota, A., Yamazoe, A., Fujiwara, T. Proposal of Lysinibacillus boronitolerans gen. nov. sp. nov., and transfer of Bacillus fusiformis to Lysinibacillus fusiformis comb. nov. and Bacillus sphaericus to Lysinibacillus sphaericus comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57 (5), 1117-1125 (2007).
  28. Panak, P., et al. Bacteria from uranium mining waste pile: interactions with U(VI). J. Alloy. Compd. 271, 262-266 (1998).
  29. Selenska-Pobell, S., Kampf, G., Flemming, K., Radeva, G., Satchanska, G. Bacterial diversity in soil samples from two uranium waste piles as determined by rep-APD, RISA and 16S rDNA retrieval. Antonie Van Leeuwenhoek. 79 (2), 149-161 (2001).
  30. Lederer, F. L., et al. Identification of multiple putative S-layer genes partly expressed by Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Microbiology. 159 ( Pt 6), 1097-1108 (2013).
  31. Günther, T. J., Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Immobilization of microorganisms for AFM studies in liquids. RSC Advances. 4, 51156-51164 (2014).
  32. Fahmy, K., et al. Secondary Structure and Pd(II) Coordination in S-Layer Proteins from Bacillus sphaericus. Studied by Infrared and X-Ray Absorption Spectroscopy. Biophys. J. 91 (3), 996-1007 (2006).
  33. Pollmann, K., Merroun, M., Raff, J., Hennig, C., Selenska-Pobell, S. Manufacturing and characterization of Pd nanoparticles formed on immobilized bacterial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (1), 39-45 (2006).
  34. Corti, C., Holliday, R. Gold : science and applications. , CRC Press - Taylor&Francis Group. (2010).
  35. Daniel, M. C., Astruc, D. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology. Chem. Rev. 104 (1), 293-346 (2004).
  36. Tang, J., et al. Fabrication of Highly Ordered Gold Nanoparticle Arrays Templated by Crystalline Lattices of Bacterial S-Layer Protein. Chem. Phys. Chem. 9 (16), 2317-2320 (2008).
  37. Haruta, M. Size- and support-dependency in the catalysis of gold. Catal. Today. 36 (1), 153-166 (1997).
  38. Habibi, N., et al. Nanoengineered polymeric S-layers based capsules with targeting activity. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 88 (1), 366-372 (2011).
  39. Toca-Herrera, J. L., et al. Recrystallization of Bacterial S-Layers on Flat Polyelectrolyte Surfaces and Hollow Polyelectrolyte Capsules. Small. 1 (3), 339-348 (2005).
  40. Decher, G., Lehr, B., Lowack, K., Lvov, Y., Schmitt, J. New nanocomposite films for biosensors - Layer-by-Layer adsorbed films of polyelectrolytes, proteins or DNA. Biosens. Bioelectron. 9 (9-10), 677-684 (1994).
  41. Decher, G., Schmitt, J. Fine-tuning of the film thickness of ultrathin multilayer films composed of consecutively alternating layers of anionic and cationic polyelectrolytes. Progress in Colloid & Polymer Science. 89 Trends in Colloid and Interface Science VI, Dr Dietrich Steinkopff Verlag. (1992).
  42. Günther, T. J. S-Layer als Technologieplattform - Selbstorganisierende Proteine zur Herstellung funktionaler Beschichtungen. , Technische Universität Dresden. (2015).
  43. Delcea, M., et al. Thermal stability, mechanical properties and water content of bacterial protein layers recrystallized on polyelectrolyte multilayers. Soft Matter. 4 (7), 1414-1421 (2008).
  44. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of Protein Adsorption: Surface-Induced Conformational Changes. J. Am. Chem. Soc. 127 (22), 8168-8173 (2005).
  45. Zeng, R., Zhang, Y., Tu, M., Zhou, C. R., et al. Protein Adsorption Behaviors on PLLA Surface Studied by Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring (QCM-D). Materials Science Forum. 610-613, 1219-1223 (2009).
  46. Bonroy, K., et al. Realization and Characterization of Porous Gold for Increased Protein Coverage on Acoustic Sensors. Anal. Chem. 76 (15), 4299-4306 (2004).
  47. Pum, D., Toca-Herrera, J. L., Sleytr, U. B. S-layer protein self-assembly. Int. J. Mol. Sci. 14 (2), 2484-2501 (2013).
  48. Weinert, U., et al. S-layer proteins as an immobilization matrix for aptamers on different sensor surfaces. Eng. Life Sci. , (2015).
  49. Umeda, H., et al. Recovery and Concentration of Precious Metals from Strong Acidic Wastewater. Mater. Trans. 52 (7), 1462-1470 (2011).
  50. Engelhardt, H., Saxton, W. O., Baumeister, W. 3-Dimensional structure of the tetragonal surface-layer of Sporosarcina-urea. J. Bacteriol. 168 (1), 309-317 (1986).
  51. Sprott, G. D., Koval, S. F., Schnaitman, C. A. Methods for general and molecular bacteriology. , American Society for Microbiology. 72-103 (1994).
  52. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during Assembly of Head Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  53. Stoscheck, C. [6] Quantitation of protein. Methods in Enzymology. Deutscher, M. P. 182, Academic Press. 50-68 (1990).
  54. Sleytr, U. B., Messner, P., Pum, D. Analysis of Crystalline Bacterial Surface-Layers by Freeze-Etching Metal Shadowing, Negative Staining and Ultra-Thin Sectioning. Method Microbiol. 20, 29-60 (1988).
  55. PerkinElmer. ICP Mass Spectrometry - The 30-Min to ICP-MS. , PerkinElmer. USA. (2001).
  56. Mühlpfordt, H. The preparation of colloidal Gold Nanoparticles using tannic-acid as an additional reducing agent. Experientia. 38 (9), 1127-1128 (1982).
  57. Hayat, M. A. Colloidal Gold - Principles, Methods and Applications. , Academic Press. (1989).
  58. Amendola, V., Meneghetti, M. Size Evaluation of Gold Nanoparticles by UV−vis Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry C. 113 (11), 4277-4285 (2009).
  59. Schurtenberger, P., Newman, M. E. Characterization of biological and environmental particles using static and dynamic light scattering in Environmental Particles. Buffle, J., van Leeuwen, H. P. 2, Lewis Publishers. 37-115 (1993).
  60. Jain, R., et al. Extracellular Polymeric Substances Govern the Surface Charge of Biogenic Elemental Selenium Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 49 (3), 1713-1720 (2015).
  61. Harewood, K., Wolff, J. S. Rapid electrophoretic procedure for detection of SDS-released oncorna-viral RNA using polyacrylamide-agarose gels. Anal. Biochem. 55 (2), 573-581 (1973).
  62. Penfold, J., Staples, E., Tucker, I., Thomas, R. K. Adsorption of mixed anionic and nonionic surfactants at the hydrophilic silicon surface. Langmuir. 18 (15), 5755-5760 (2002).
  63. Krozer, A., Rodahl, M. X-ray photoemission spectroscopy study of UV/ozone oxidation of Au under ultrahigh vacuum conditions. J. Vac. Sci. Technol. A-Vac. Surf. Films. 15 (3), 1704-1709 (1997).
  64. Vig, J. R. UV ozone cleaning of surfaces. J. Vac. Sci. Technol. 3 (3), 1027-1034 (1985).
  65. Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift Fur Physik. 155 (2), 206-222 (1959).
  66. Q-Sense - Biolin Scientific. Introduction and QCM-D Theory - Q-Sense Basic Training. , (2006).
  67. Edvardsson, M., Rodahl, M., Kasemo, B., Höök, F. A dual-frequency QCM-D setup operating at elevated oscillation amplitudes. Anal. Chem. 77 (15), 4918-4926 (2005).
  68. Hovgaard, M. B., Dong, M. D., Otzen, D. E., Besenbacher, F. Quartz crystal microbalance studies of multilayer glucagon fibrillation at the solid-liquid interface. Biophys. J. 93 (6), 2162-2169 (2007).
  69. Liu, S. X., Kim, J. T. Application of Kelvin-Voigt Model in Quantifying Whey Protein Adsorption on Polyethersulfone Using QCM-D. Jala. 14 (4), 213-220 (2009).
  70. Reviakine, I., Rossetti, F. F., Morozov, A. N., Textor, M. Investigating the properties of supported vesicular layers on titanium dioxide by quartz crystal microbalance with dissipation measurements. J. Chem. Phys. 122 (20), (2005).
  71. Voinova, M. V., Rodahl, M., Jonson, M., Kasemo, B. Viscoelastic acoustic response of layered polymer films at fluid-solid interfaces: Continuum mechanics approach. Phys. Scr. 59 (5), 391-396 (1999).
  72. Fischer, H., Polikarpov, I., Craievich, A. F. Average protein density is a molecular-weight-dependent function. Protein Sci. 13 (10), 2825-2828 (2004).
  73. Schuster, B., Pum, D., Sleytr, U. B. S-layer stabilized lipid membranes (Review). Biointerphases. 3 (2), FA3-FA11 (2008).
  74. Malmström, J., Agheli, H., Kingshott, P., Sutherland, D. S. Viscoelastic Modeling of Highly Hydrated Laminin Layers at Homogeneous and Nanostructured Surfaces: Quantification of Protein Layer Properties Using QCM-D and SPR. Langmuir. 23 (19), 9760-9768 (2007).
  75. Vörös, J. The Density and Refractive Index of Adsorbing Protein Layers. Biophys. J. 87 (1), 553-561 (2004).
  76. Hillier, A. C., Bard, A. J. ac-mode atomic force microscope imaging in air and solutions with a thermally driven bimetallic cantilever probe. Rev. Sci. Instrum. 68 (5), 2082-2090 (1997).
  77. Horcas, I., et al. WSXM: A software for scanning probe microscopy and a tool for nanotechnology. Rev. Sci. Instrum. 78 (1), 013705 (2007).
  78. Merroun, M. L., Rossberg, A., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. XAS characterization of gold nanoclusters formed by cells and S-layer sheets of B. sphaericus JG-A12. Annual Report Forschungszentrum Rossendorf - Institute for Radiochemistry. , (2005).
  79. Jankowski, U., Merroun, M. L., Selenska-Pobell, S., Fahmy, K. S-Layer protein from Lysinibacillus sphaericus. JG-A12 as matrix for Au III sorption and Au-nanoparticle formation. Spectroscopy. 24 (1), 177-181 (2010).
  80. Selenska-Pobell, S., et al. Magnetic Au nanoparticles on archaeal S-Layer ghosts as templates. Nanomater. nanotechnol. 1 (2), 8-16 (2011).
  81. Caruso, F., Furlong, D. N., Kingshott, P. Characterization of ferritin adsorption onto gold. J. Colloid Interface Sci. 186 (1), 129-140 (1997).
  82. Ward, M. D., Buttry, D. A. In situ interfacial mass detection with piezoelectric transducers. Science. 249 (4972), 1000-1007 (1990).
  83. Höök, F., et al. Variations in coupled water, viscoelastic properties, and film thickness of a Mefp-1 protein film during adsorption and cross-linking: A quartz crystal microbalance with dissipation monitoring, ellipsometry, and surface plasmon resonance study. Anal. Chem. 73 (24), 5796-5804 (2001).
  84. Wahl, R. Reguläre bakterielle Zellhüllenproteine als biomolekulares Templat. , Technische Universität Dresden. (2003).
  85. Jennings, T., Strouse, G. Past, present, and future of gold nanoparticles in Bio-Applications of Nanoparticles. , Springer. 34-47 (2007).
  86. Beveridge, T., Fyfe, W. Metal fixation by bacterial cell walls. Can. J. Earth Sci. 22 (12), 1893-1898 (1985).

Tags

Chemistry biosorptie metalen S-layer bacteriën nanodeeltjes QCM-D AFM ICP-MS gold
Au-Interactie van SLP1 Polymeren en monolaag van<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS en de AFM als gereedschap voor Biomolecuul-metal Studies
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K.… More

Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies. J. Vis. Exp. (107), e53572, doi:10.3791/53572 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter