Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Au-אינטראקציה של הפולימרים Slp1 וחד שכבתי מ Published: January 19, 2016 doi: 10.3791/53572
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

Introduction

בשל השימוש הגובר של זהב עבור מספר יישומים כמו אלקטרוניקה, זרזים, חיישנים, או מכשירים רפואיים, הביקוש של מתכת יקרה זו גדל במשך הזמן כמה השנים האחרונות 6-9. זהב, כמו גם רבות מתכות יקרות וכבדות אחרות משתחררים לסביבה באמצעות שפכים תעשייתיים בריכוזים לדלל, באמצעות פעילויות כרייה, וסילוק פסולת 7,8,10, למרות שרוב הזיהום סביבתי על ידי מתכות כבדות או יקרות הוא תהליך מתמשך נגרמים בעיקר על ידי פעילות טכנולוגית. זה מוביל להפרעה משמעותית של מערכות אקולוגיות טבעיות ועלול לאיים על בריאות אדם 9. ידיעת תוצאות השליליות אלה מקדם את החיפוש אחר שיטות חדשות להסרת מתכות ממערכות אקולוגיות ושיפורים מזוהמים במחזור מתכות משפכים תעשייתיים. שיטות פיסיקלי כימיות מבוססות היטב כמו משקעים או חילוף יונים הן לא כל כך יעילות, במיוחד בתחום ההייly מדולל פתרונות 7,8,11. Biosorption, גם עם חיים או מת ביומסה, היא חלופה אטרקטיבית לטיפול בשפכים 10,12. השימוש בחומרים ביולוגיים כזה יכול להפחית את הצריכה של כימיקלים רעילים. מיקרואורגניזמים רבים תוארו לצבור או לשתק מתכות. לדוגמא, תאים של sphaericus Lysinibacillus (L. sphaericus) JG-A12 הראו יכולות גבוהות מחייבות למתכות יקרות, למשל, פ"ד (II), Pt (II), Au (III), ומתכות רעילות אחרות כמו Pb (II) או U (VI) 4,13, תאים של megaterium Bacillus לCr (VI) 14, תאים של שמר אפייה לPt (II) וPd (II) 15, ווולגרי כלורלה לAu (III) וU (VI) 16 , 17. הכריכה של מתכות קודמות כמו Au (III), פ"ד (II), וPt (II) דווח גם לDesulfovibrio desulfuricans 18 ולL. sphaericus JG-B53 19,20. עם זאת, לא אלהחיידקים l לקשור כמויות גבוהות של מתכות ויישומם כחומר sorptive מוגבלים 12,21. יתר על כן, מחייבת קיבולת מתכת תלויה בפרמטרים שונים, למשל, הרכב תא, ביו-רכיב המשמש, או סביבתי ותנאי ניסוי (pH, כוח יוני, וכו 'טמפרטורה). המחקר של דופן תא שברים המבודדים 22,23, כמו שומני קרום, פפטידוגליקן, חלבונים, או רכיבים אחרים, מסייע להבין את המתכת מחייבת תהליכים של תאים שלמים נבנו מורכבים 8,21.

מרכיבי התא התמקדו במחקר זה הם חלבוני S-שכבה. חלבוני S-שכבה הם חלקים של מעטפת התא החיצונית של חיידקים וחיידקים קדומים רבים, והם מהווים כ -15 - 20% ממסת החלבון הכוללת של אורגניזמים אלה. כממשק הראשון לסביבה, תרכובות תאים אלה משפיעות בחוזקה על תכונות ספיחת חיידקי 3. חלבוני S-שכבה עם משקולות מולקולריות הנעות בין ארבעיםלמאות kDa מיוצרים בתוך התא, אבל הם התאספו מחוץ בו הם יכולים ליצור שכבות על ממברנות שומנים בדם או מרכיבי דופן תא פולימרים. ברגע בודד, כמעט כל S-שכבת חלבונים הרכוש המהותי לאופן ספונטני עצמי להרכיב בהשעיה, בממשקים, או על משטחים ויוצרים מבנים מישוריים או כמו צינור-3. עובי monolayer החלבון תלוי בחיידקים והוא בטווח של 5-25 ננומטר 24. באופן כללי, מבני חלבון S-שכבה נוצרו יכולים להיות אלכסוני (P1 או P2), ריבוע (P4), או משושה (P3 או P6) סימטריה עם קבועי סריג של 2.5-35 3,24 ננומטר. נראה היווצרות הסריג להיות במקרים רבים תלויים בקטיונים דו ערכיים ובעיקר על Ca 2 + 25,26, רף, ג 'ואח'. S-שכבת nanocomposites מבוסס עבור יישומים תעשייתיים הבמבוסס על החלבון מהונדס ננו. (עורכים Tijana ז גרוב ואיית'יבר ל Cortajarena) (Springer, 2016 (שהוגש)). עם זאת, המפל מלא התגובה של קיפול מונומר, אינטראקציה מונומר-מונומר, ההיווצרות של סריג, והתפקיד של מתכות שונות, בעיקר של קטיונים דו ערכיים כגון Ca 2 + וMg 2 +, עדיין לא הבין באופן מלא.

המתח גרם-חיובי ל sphaericus JG-B53 (שם מsphaericus Bacillus לאחר סיווג פילוגנטי החדש) 27 היה מבודד מערימת פסולת כריית אורניום "Haberland" (Johanngeorgenstadt, סקסוניה, גרמניה) 4,28,29. חלבון S-השכבה הפונקציונלית שלה (Slp1) בעל סריג מרובע, משקל מולקולרי של 116 kDa 30, ועובי של 10 ננומטר ≈ על תאי חיים חיידקים 31. במחקרים קודמים, ההיווצרות במבחנה של שכבת חלבון סגורה ויציבה בעובי של כ -10 ננומטר הושגה בפחות מ -10 דקות 19. הזן הקשורים ל sphaericus JG-A12, גם לבודד מהערימה "Haberland", בעל יכולות גבוהה מחייבות מתכת וחלבון S-השכבה המבודדת שלה הוכיח כימי גבוהות ויציבות מכאנית ושיעורי ספיחה טובים למתכות יקרות כמו Au (III), Pt (II), וPd (II) 4,32,33. זה מחייב מתכות יקרות הוא פחות או יותר ספציפי לכמה מתכות ותלויות בזמינות של קבוצות פונקציונליות על פני החלבון החיצוני ופנימי של הפולימר ובנקבוביות שלה, כוח יוני, וערך ה- pH. קבוצות פונקציונליות רלוונטיות לאינטראקציה מתכת על ידי החלבונים הן COOH-, NH 2 -, OH-, PO 4 -, SO 4 -, וכך-. באופן עקרוני, יכולות מחייבות מתכת לפתוח ספקטרום רחב של יישומים, רף, ג 'ואח'. S-שכבת nanocomposites מבוסס עבור יישומים תעשייתיים הבמבוסס על החלבון מהונדס ננו. (עורכים Tijana ז גרוב ואיית'יבר ל Cortajarena) (Springer, 2016 (שהוגש)). לדוגמא, כרכיבי biosorptive להסרת או שחזורשל מתכות רעילות או בעל ערך מומס, תבניות לסינתזה או בתצהיר מוגדר של חלקיקים מובנים באופן קבוע מתכתיים (NPS) לקטליזה, וחומרים מהונדסים יו אחרים כמו שכבות ביו-חושי 3,5,18,33. מערכים מסודרים באופן קבוע NP כמו Au (0) -NPs יכולים לשמש ליישומים מרכזיים החל אלקטרוניקה מולקולרית וחיישנים, התקני אחסון צפיפות ultrahigh, וזרזים לCO-חמצון 34-37. הפיתוח של יישומים כגון ועיצוב חכם של חומרים אלה מחייב הבנה עמוקה יותר של המנגנונים המחייבים המתכת הבסיסית.

תנאי מוקדם לפיתוח של חומרים מבוסס ביו כזה הוא היישום אמין של שכבת ממשק בין biomolecule והמשטח הטכני 38,39. לדוגמא, פוליאלקטרוליטים התאספו עם 40,41 טכניקת השכבה אחר שכבה (LBL) שימשו כשכבת ממשק לגיבוש מחדש של חלבוני S-שכבה 39 19,42, רף, ג 'ואח'. S-שכבת nanocomposites מבוסס עבור יישומים תעשייתיים הבמבוסס על החלבון מהונדס ננו. (עורכים Tijana ז גרוב ואיית'יבר ל Cortajarena) (Springer, 2016 (שהוגש)). עם זאת, המנגנון המורכב של חלבון הספיחה והאינטראקציה חלבון-פני השטח אינו מובן לחלוטין. במיוחד מידע על קונפורמציה, אוריינטצית דפוס, וצפיפות ציפוי עדיין חסר.

microbalance גביש קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D) טכניקה משך תשומת לב בשנים האחרונות ככלי ללימוד חלבון ספיחה, קינטיקה ציפוי, ופרו אינטראקציהcesses בקנה המידה ננומטרי 19,43-45. טכניקה זו מאפשרת לגילוי מפורט של ספיחה המונית בזמן אמת, ויכולה לשמש כאינדיקציה לתהליך חלבון הרכבה העצמית והצימוד של מולקולות תפקודיות ברשתות חלבון 19,20,42,46-48. בנוסף, מדידות QCM-D לפתוח את האפשרות ללמוד תהליכי אינטראקציה מתכת עם השכבה חלבוניים בתנאים ביולוגיים טבעיים. במחקר שנערך לאחרונה, את האינטראקציה של חלבון S-השכבה עם מתכות נבחרו כמו האיחוד האירופי (III), Au (III), פ"ד (II), וPt (II) נחקר עם QCM-D 19,20. שכבת חלבון adsorbed יכולה לשמש כמודל מופשט של דופן תא של חיידקי גרם חיובי. המחקר של מרכיב אחד זה יכול לתרום להבנה עמוקה יותר של אינטראקציה מתכת. עם זאת, רק ניסויי QCM-D לא מאפשרים הצהרות לגבי מבני משטח והשפעות של מתכות לחלבון. טכניקות אחרות הן הכרחיות כדי להשיג מידע כזה. קופה אחתsibility ליו-ננו הדמיה ומידע על קבלת תכונות מבניות הוא במיקרוסקופ הכוח האטומי (AFM).

מטרתו של המחקר שהוצג הייתה לחקור את הספיחה של זהב (Au (III) וAu (0) -NPs) לחלבוני S-שכבה, בSlp1 המסוים של ל ' sphaericus JG-B53. ניסויים נעשו עם חלבונים תלויים על קנה מידה אצווה בטווח pH של 2.0-5.0 באמצעות ICP-MS ועם S-שכבות משותקות באמצעות QCM-D. בנוסף, ההשפעה של תמיסת מלח מתכת על יציבות הסריג נחקרה במחקרים AFM שלאחר מכן. השילוב של טכניקות אלה תורם להבנה טובה יותר של תהליכים באינטראקצית מתכת מבחנה ככלי ללמידה נוסף על אירועים מחייבים בתאים שלמים של חיידקים לגבי זיקות מתכת ספציפיות. ידע זה הוא לא רק חיוני לפיתוח של חומרי מסנן ישימים עבור ההתאוששות של מתכות להגנה על סביבה ושימור מחדשמקורות 49, אלא גם לפיתוח של מערכים של צירופים ומתכתיים הורה מאוד עבור יישומים טכניים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תנאי מיקרואורגניזם וטיפוח

הערה:. כל הניסויים נעשו בתנאים סטריליים ל sphaericus JG-B53 התקבל מתרבות שהשתמר cryo 29,30.

  1. ההעברה cryo-השתמר תרבות (1.5 מיליליטר) מתחת לספסל הנקי ל -300 מיליליטר מרק מזין סטרילי (NB) תקשורת (תמצית בשר 3 G / L, 5 גר '/ peptone L, 10 גר' / ליטר NaCl). לאחר מכן מערבב את הפתרון במשך לפחות 6 שעות על 30 מעלות צלזיוס להשיג מראש התרבות לטיפוח.
  2. לטפח את החיידקים בתנאים אירוביים בתקשורת NB ב- pH = 7.0, 30 מעלות צלזיוס בL 70 טיפס bioreactor קיטור במקום. לכן, למלא את הכור עם ≈ 57 מים ללא יוני L. להוסיף ולפזר תקשורת NB המוצקה ישירות בbioreactor (ריכוזים ראו לעיל).
    1. בנוסף להוסיף סוכן antifoam (30 μl / NB-מדיה L) לתקשורת כדי לדכא את היווצרות קצף במהלך טיפוח, אז החיטוי (122 מעלות צלזיוס, טמפרטורה מחזיקה זמן 30 דקות) בתקשורתבתוך מתקן הכור.
  3. להתקרר התקשורת ולבצע ריווי חמצן מלא. התאם את ה- pH 7.0 (באמצעות 1 MH 2 SO 4 ו- 2 M NaOH) ולהתחיל את החיסון האוטומטי של טרום-תרבות 300 מיליליטר. התחל הקלטת נתונים של פרמטרים טיפוח בנקודת החיסון. התחבר פרמטרים מקוונים למשל, רמת חמצן מומסת (DO 2), בנוסף חומצה ובסיס, ו- pH-ערכים בטיפוח.
    1. צג התפתחות החיידקים באינטרנט על ידי מדידות עכירות לא פולשנית.
  4. לבצע דגימה נוספת לאחר כל שעה של טיפוח ולקבוע פרמטר נוסף כגון משקל ביו יבש (BDW) וצפיפות מחובר אופטית (OD). לכן, לאסוף 20 מיליליטר מרק טיפוח בכל נקודה בתנאים סטריליים דגימה.
    1. לקבוע OD מחובר על ידי מדידות photometric של הספיחה ב 600 ננומטר. השתמש NB-בינוני filtrated סטרילי כערך ריק. מאחוראה להגיע ספיחה> 0.4 לדלל את ההשעיה התא הבא הליניאריות של חוק למברט-באר.
    2. לקביעת צנטריפוגות BDW 1 עד 5 מיליליטר של השעיה חיידקים (תלוי בתא צפיפות) בXG 5000 במשך 5 דקות ב RT. ייבש את התא גלולה שהושג ב 105 מעלות צלזיוס בחימום תנור עד יציבות מסה ולמדוד את מסת גלולה.
  5. קח תמונות מיקרוסקופיות עם מיקרוסקופ מחקר לעומת שלב אופטי ב400 ו -1000 הגדלה של פי (לעומת שלב הקבל 2 ו -3 בהתאמה) לבדיקה של התפתחות החיידקים וכביקורת זיהום צולב.
  6. לאחר שהגיע לשלב הצמיחה המעריכית זוהה על ידי מקוון לעשות 2 ועכירות באינטרנט, לקצור את ביומסה על ידי צנטריפוגה זרימה דרך ב15,000 XG, 4 מעלות צלזיוס ולשטוף ביומסה פעמיים עם חיץ סטנדרטי (50 מ"מ טריס, 10 מ"מ MgCl 2, 3 מ"מ 3 נאן, pH = 7.5).
    הערה: גלולה ביומסה הושגה ניתן לאחסן ב -18 & #176; C עד שימוש נוסף לבידוד.

בידוד חלבון 2. S-שכבה וטיהור

הערה: לטהר פולימרים Slp1 פי שיטה מותאמת כפי שתואר לעיל 2,19,30,32,50,51.

  1. Homogenize ביומסה הגולמי שטפה והפשרה שהושגה מטיפוח במאגר סטנדרטי (1: 1 (w / v)) כדי להסיר שוטונים באמצעות disperser (רמה 3, 10 דקות) באמבט קרח קירור ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. צנטריפוגה ההשעיה (8000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות) ולשטוף את הכדור שהושג פעמיים עם חיץ סטנדרטי (1: 1 (w / v)). לאחר הכביסה וצנטריפוגה (8000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות), resuspend גלולה במאגר סטנדרטי (1: 1 (w / v)), להוסיף DNase השני וRNase (0.4 יחידות / ביומסה ז) להשעיה ולהתפורר התאים בבר 1,000 עם homogenizer בלחץ גבוה. לאחר מכן צנטריפוגה ההשעיה ב27,500 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    הערה: השעיה תא בקרה עם מיל המחקרcroscope. קרע הושלם כאשר פחות מ 2 - 3 תאים שלמים גלויים בתחום התצוגה של מיקרוסקופ בהגדלה של פי 400.
  3. שטוף את הכדור פעמיים עם חיץ סטנדרטי (1: 1 (w / v)) ולבצע צנטריפוגה שוב. לאחר מכן resuspend גלולה במאגר סטנדרטי (2: 1 (w / v)) מעורבב עם 1% Triton X-100 ודגירה זה במשך 20 דקות תחת (100 סל"ד) רועד הרצופים לsolubilize פיקדונות שומנים.
  4. צנטריפוגה הפתרון (27,500 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1) ולשטוף פעמים גלולה שהושגו שלוש עם חיץ סטנדרטי (1: 1 (w / v)).
  5. דגירה גלולה שהושג לאחר צנטריפוגה נוספת (27,500 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1) במשך 6 שעות במאגר סטנדרטי (1: 1 (w / v)) מעורבב עם 0.2 g / L יזוזים, לhydrolyze קשרים ב -50 פפטידוגליקן. בנוסף להוסיף DNase השני וRNase (כל 0.4 יחידות / ביומסה ז) להשעיה.
  6. לאחר צנטריפוגה (45,500 XG, 4 ° C, 1 שעה), resuspend שלב החלבון הלבן העליון עם נפח נמוך של tהוא supernatant צנטריפוגה (<30 מיליליטר) יחידות משנה חלבון מכיל.
  7. Solubilize ההשעיה הלבנה על ידי ערבוב 1: 1 עם 6 מ 'hydrochloride guanidine (6 מ' GuHCl, 50 מ"מ טריס, pH = 7.2). הפתרון הופך בהיר.
  8. בצע סינון סטרילי (0.2 מיקרומטר) של הפתרון שטופל GuHCl אחרי צנטריפוגה נוספת במהירות גבוהה (45,500 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1).
  9. מעבירים את supernatant לצינורות קרום דיאליזה (MWCO 50,000 דלתון) ודיאליזה זה נגד מאגר recrystallization (1.5 מ"מ טריס, 10 מ"מ CaCl 2, pH = 8.0) במשך 48 שעות.
  10. מעבירים את פתרון פולימר חלבון recrystallized הלבן לתוך צינורות וצנטריפוגות ב 45,500 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. Resuspend גלולה בהיקף נמוך של המים ultrapure (<30 מיליליטר).
  11. לאחר מכן, להעביר את ההשעיה לתוך צינורות קרום דיאליזה ולבצע דיאליזה נגד המים ultrapure עבור 24 שעות כדי להסיר תוכן חיץ.
    שים לב: מספר שינויים של ד חיץ או המים ultrapureהדיאליזה uring היא הכרחיות.
  12. Lyophilize Slp1 המטוהרים במייבש הקפאה.

3. אפיון וכימות של Slp1 לניסויים

הערה: ריכוז Slp1 לניסויי ספיחה וציפוי היה לכמת על ידי spectrophotometry UV-VIS.

  1. פיפטה 2 μl של מדגם Slp1 המומס ישירות על הכן המדידה התחתון של פוטומטר. קביעת ריכוז חלבון במקסימום ספיחה באורך גל של 280 ננומטר, אופייני לחלבונים. השתמש במקדם ההכחדה של 0.61 כדי לקבוע ריכוז Slp1. להשתמש בפתרון חופשי Slp1 למדידות התייחסות.
  2. לדלל את החלבון עם החיץ (לניסויי ספיחה במצב אצווה להשתמש 0.9% NaCl, pH = 6.0 ולניסויי QCM-D להשתמש חיץ recrystallization, pH = 8.0) לריכוז רצוי לניסויים (ז 1 / L 0.2 g / L בהתאמה).
  3. ניתוח איכות Slp1 ומשקל מולקולרי על ידי bioanal הסטנדרטיאלקטרופורזה ytical נתרן שיטת polyacrylamide סולפט dodecyl (SDS-PAGE) תוארה על ידי Laemmli, בריטניה 52.
    1. בצע SDS-PAGE לפני שימוש Slp1 בתוך ניסויים ולמשל, Au לאחר הדגירה -NP (0) באמצעות ג'לי הפרדת polyacrylamide 10%.
    2. לתערובת SDS-דגימות ≈10 μl של מדגם הטיפוח או חלבון עם חיץ מדגם (טריס 1.97 גר ', bromophenol 5 מ"ג כחול, 5.8 מיליליטר גליצרין, SDS 1 גרם, 2.5 מיליליטר β-mercaptoethanol, למלא במי ultrapure 50 מיליליטר) ב יחס של 1: 1 (V / V) ופיפטה את התערובת לאחר דגירה 4 דקות ב 95 מעלות צלזיוס לכיסי ג'ל.
    3. הפעלת SDS-PAGE 30 דקות במתח של 60 V עד הדגימות לעבור את הג'ל אוסף ושינוי המתח 120 V עובר ג'ל ההפרדה פעם.
    4. הסר את ג'לי ממערכת ג'ל, לשטוף עם מים ultrapure ומקום עבור שעה 1 לפתרון קיבעון (10% חומצת חומץ, 50% אתנול אבסולוטי). לאחר מכן, יש לשטוף את ג'לי עם מים ultrapure.
    5. ג'לי כתםבאמצעות colloidal נוקבים מותאם Coomassie 53,54 שיטה כחולות מבריקות. לאחר destaining 72,73, לקחת תמונות SDS-PAGE על ידי מערכת תיעוד ג'ל על פי הפרוטוקול של היצרן.

4. ניסויי ספיחה במצב אצווה וכימות מתכת

  1. ליצוו ניסויי ספיחה להכין Au (III) פתרון מניות מ4 HAuCl ∙ 3 H 2 O, לדלל את המלח המתכת ולערבב אותו עם פתרון Slp1 / NaCl לריכוז ראשוני מתכת של 1 מ"מ וריכוז Slp1 הסופי של 1 גרם / L . לבצע ניסויים בשלישייה עם ביקורת שלילית נוספת ללא Slp1. השתמש בהיקף כולל של 5 מיליליטר לניסויי ספיחה.
  2. לנער את ההשעיה ברציפות ב RT בערכי pH מותאם מראש שונים בין 2.0-5.0 למשך 24 שעות (להתאים את ה- pH עם פתרון HCl וNaOH מרוכז נמוך).
  3. לאחר ספיחה, צנטריפוגה הדגימות ב 15,000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות) לseparאכלתי Slp1 מsupernatant.
  4. מעבירים את supernatant לתוך צינורות אולטרה סינון (MWCO 50,000 Da) ו צנטריפוגות זה ב15,000 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי להסיר מונומרים חלבון מומסים.
  5. קבע את ריכוז המתכת בתסנין וכתוצאה מכך על ידי ICP-MS 19,20 ולהשתמש בתוצאות לגב-חישוב sorbed מתכת על ידי המסה היבשה Slp1. מדידת עקרונות, הזדמנויות של השיטה והמרכיבים של ICP-MS המשומש תוארו בספרות 55.
    1. הכן דגימות ואזכור למדידות ICP-MS באמצעות 1% HNO 3 כמטריצה ​​ורודיום כסטנדרט פנימי (1 מ"ג / מיליליטר).

5. סינתזה של Au-NP וקביעת גודל חלקיקים

הערה: ציטראט התייצב Au (0) -NP היה מסונתז על פי שיטה מותאמת שתוארה קודם לכן על ידי Mühlpfordt, ח 'ואח'. (1982) כדי לקבל חלקיקים כדוריים בקוטר של 10 - 15 56,57 ננומטר

  1. הכן התייצב 25 מ"מ HAuCl 4 ∙ 3 מניות H 2 O להיווצרות NP.
  2. לדלל 250 μl של פתרון מניות זה ב19.75 מיליליטר מים ultrapure דגירה אלה ב 61 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות רצוף תחת רעד.
  3. הכן 5 מיליליטר של פתרון מניות שני (חומצת 12 מ"מ טאני, די-מימה נתרן ציטרט 7 מ"מ, 0.05 מ"מ K 2 CO 3) ודגירת פתרון 2 nd בנפרד 61 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  4. להוסיף בבחישה מתמדת פתרון מניות -2 לפתרון אחד. מערבבים את תערובת תגובה ללפחות 10 דקות על 61 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לקרר את הפתרון ולהשתמש בו לציפוי NP על סריג Slp1 בתוך ניסויי QCM-D.
    הערה: Au התוצאה (0) -NP התאפיינו בספקטרוסקופיה UV-VIS במקסימום ספיגה של 520 ננומטר, משמש בדרך כלל לגילוי של Au נוצר (0) -NPs 58. הפתרון יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס.
  5. לנתח את גודל יצרAu (0) -NP ידי ספקטרוסקופיה מתאם פוטון (PCS) אשר ידוע גם בשם פיזור אור דינאמי.
    1. לקביעת גודל NP, להעביר 1.5 מיליליטר של (0) -NP פתרון Au מסונתז לcuvettes בתנאים נטול אבק בזרימה למינרית תיבה ולנתח אותו עם גודל וסייזר חלקיקי פוטנציאל זטה. תיאור מפורט של מחשבים אישיים והכנת מדגם ניתן בורטנברגר, פ ואח '. (1993) 59 וJain, ר 'ואח'. (2015) 60.

6. ניסויים QCM-D - Slp1 ציפוי על משטחים וAu-NP ספיחה על Slp1 סריג

הערה: מדידות בוצעו עם QCM-D מצויד עם עד ארבעה מודולים זרימה. כל ניסויי QCM-D בוצעו עם קצב זרימה קבוע של 125 μl / דקה 25 מעלות צלזיוס. ציפוי Slp1 ומתכת דגירה / NP נעשו על חיישני SiO 2 פיזואלקטריים קוורץ AT-החתך (O 14 מ"מ) עם תדר בסיסי של ≈ 5 מגה-הרץ. שטיפת מדרגות ולהוסיףition של פתרון מסומנים בדמויות של חלק נציגי תוצאות. ניסויי QCM-D יכולים להיות מתוארים כצעד אחר צעד בדרך החל בניקוי ושינוי פני השטח של החיישנים המשמשים אחריו recrystallization Slp1 ומאוחר יותר על האינטראקציה NP מתכת ומתכת.

  1. ניקוי נהלים:
    1. לצייד את תאי נוזל עם בובות חיישן. משאבה לפחות 20 מיליליטר (כל לכל מודול) סוכן אלקליין נוזלי טיהור (ניקוי 2% במי ultrapure (V / V)) דרך מערכת QCM-D והצינור של. לאחר מכן לשאוב את הנפח פי חמישה (כל לכל מודול) של המים ultrapure באמצעות המערכת (קצב זרימה עד 300 μl / min). לבצע הניקוי על פי הפרוטוקול של היצרן.
    2. נקה את SiO 2 החיישנים מחוץ לזרימת מודולים על ידי דגירה (לפחות 20 דקות) בפתרון של 2% SDS ולשטוף את החיישנים אחר כך מספר פעמים עם המים ultrapure 61,62.
    3. ייבש את הגבישים עם comp המסונןressed אוויר ומניח אותם בתא ניקוי אוזון במשך 20 דקות 63,64.
    4. חזור על תהליך הניקוי פעמיים כדי להסיר את כל התוכן האורגני.
    5. כדי להסיר מתכות כרוכים ממשטח החיישן לשטוף את החיישנים עם 1 M HNO 3. לאחר מכן, לבצע את כל שלבי השטיפה במי ultrapure.
  2. שינוי פני שטח חיישן ידי פוליאלקטרוליטים:
    הערה: שינוי פני שטח יכול להיעשות גם בתוך (לזרום דרך הליך) או מחוץ לזרימת מודול (טכניקת LBL). בתוך ניסויים אלה את הדרך לשנות את המשטחים הבאים הייתה בשימוש.
    1. לשנות את החיישנים עם 3 גרם / L של שכבות PE לסירוגין של imine פוליאתילן (PEI, MW 25,000) וsulfonate פוליסטירן (PSS, MW 70,000) באמצעות ציפוי לטבול באמצעות טכניקת LBL 40,41 תוארה קודם לכן למערכת בשימוש המיוחדת במאמרו של זור, מ 'ואח'. (2014) 19.
    2. הנח את החיישנים בתוך PE-הפתרון המתאים בw העמוקצלחות ell דגירה אלה במשך 10 דקות ב RT.
    3. קח את החיישנים מPE-פתרון ולשטוף את החיישנים בין כל צעד ציפוי לטבול באינטנסיביות עם מים ultrapure.
      הערה: שינוי פני השטח החדש מורכב מלפחות שלוש מסתיים שכבת PE עם PEI מטען החשמלי חיובי.
    4. לאחר שינוי חיצוני זה למקם את החיישנים בתוך הזרימה מודול ולאזן את החיישנים על ידי שטיפה במי ultrapure לפני תחילת הניסויים.
  3. Slp1 חד שכבתי Recrystallization:
    1. ממיסים Slp1 ב 4 M אוריאה להמרת פולימרים למונומרים.
    2. צנטריפוגה חלבוני monomerized ב15,000 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי להסיר agglomerates חלבון גדול יותר.
    3. מערבבים את supernatant Slp1 solubilized וcentrifuged עם חיץ recrystallization לריכוז חלבון סופי של 0.2 g / L.
      הערה: סידן בהתאם recrystallization של Slp1 (הרכבה עצמית) מתחיל על ידי תוספת של recמאגר rystallization. לכן, לשאוב את הפתרון המעורב עם קצב זרימה של 125 μl / דקה לחיישנים (ממוקם בתוך זרימת מודולים) באופן מיידי. הגיבוש מחדש נעשה לאחר ערכים יציבים של משמרות תדירות והפיזור התגלו בתוך ניסויי QCM-D.
    4. לאחר גיבוש מחדש חלבון מוצלח על גבי החיישנים-שונה PE בתוך זרימת מודולים לשטוף את החיישנים המצופים עם חיץ recrystallization או ultrapure waterintensively עם קצב זרימה של 125 μl / דקה עד ערכים יציבים של משמרות תדירות ופיזור אותרו.
      הערה: שינוי SiO 2 משטח עם PE לניסויי ספיחה מאוחר יותר על מחקרי monolayer וAFM Slp1 היא דמיינה באיור 1.

איור 1
איור 1. סכמטי עיצוב של שינוי פני שטח PE וSlp1 חד שכבתיציפוי; נתון זה שונה מזור, מ 'ואח'. (2015) 19 באישור שפרינגר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. מתכת ומתכת NP אינטראקציה:
    הערה: הספיחה עם תמיסת מלח מתכת Au (HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O) בוצעה בריכוזים של 1 מ"מ או 5 מ"מ ב- pH = 6.0 בפתרונות NaCl 0.9%. ספיחת Au-NP נעשתה עם Au-צירופים וחיים ב1.6 מ"מ חיץ תלת-נתרן-ציטראט על 5.0 pH ≈.
    1. לאחר ציפוי Slp1 מוצלח בזרימת מודולים, לשטוף את שכבת Slp1 הושגה באופן אינטנסיבי עם 0.9% NaCl פתרון עד ערכים יציבים של משמרות תדירות ופיזור אותרו.
    2. לשאוב את הפתרון מוכן מתכת (1 מ"מ) ופתרון NP לזרימת מודולים עם קצב זרימה של 125 μl / דקה ולעקוב אחר ספיחת המסה לSlשכבת P1. ספיחת מסה יכולה להיות מזוהה באופן ישיר על ידי מעקב משמרות התדירות מתייחסת למשוואת Sauerbrey (1 משוואה).
    3. לאחר שסיים את האינטראקציה המתכת והמתכת NP, לשטוף את השכבה עם חיץ חופשי מתכת / NP להסיר מתכות חלשות כבול או חלשות מצורפים או חלקיקים.
      הערה: איור של ההתקנה הניסיונית מוצג באיור 2.

איור 2
איור 2. סכמטי עיצוב של התקנת QCM-D באמצעות זרימת מודול QFM 401 * 66. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. נתונים הקלטה והערכה:
    1. רשום את המשמרות בתדירות בהרץ (n Δf) ופיזור (ΔD n) בתוך ניסויי QCM-D באמצעות QCM-D תוכנה ספציפית.
    2. להשתמש להערכת הרגישות ההמונית adsorbed המשוואה / מודל Sauerbrey (Δm) (1 משוואה) 65 66 שתקפות לסרטים דקים ונוקשה בשילוב ללא חיכוך על פני השטח החיישן להחיל n ה נימה. C הטווח (קבוע Sauerbrey) לMHz 5 בשימוש בחיישן קוורץ חתך הוא 17.7 ng ∙ הרץ -1 ∙ סנטימטר -2 68. לנוקשה, מופץ באופן שווה, ושכבות adsorbed דקות מספיק להשתמש 1 משוואה כקירוב טוב.
      משוואת 1
    3. בצע דוגמנות נוספת על פי מודל קלווין-Voigt תקף למולקולות viscoelastic 68-71 עם התוכנה ספציפית היצרן ולהשוות את התוצאות עם זה של מודל Sauerbrey.
    4. לחישוב עובי השכבה ושימוש ספיחת מסהכפרמטר חשוב דוגמנות צפיפות שכבה של שכבת adsorbed של 1.35 גר '∙ סנטימטר -3 מתאים לערכים שתוארו קודם לכן לחלבונים S-שכבת 72-75. השתמש באותו הערך לחישוב האינטראקציה מתכת עם השכבה חלבוניים.

7. מדידות AFM

  1. לבצע מחקרים עם מסוגל באופן מלא AFM על מיקרוסקופ אופטי הפוך.
    1. תמונות רשומות AFM בנוזל באמצעות חיץ recrystallization או המים ultrapure ישירות על חיישני QCM-D המצופה.
    2. יש לשטוף את החיישנים במי ultrapure לאחר ניסויי QCM-D ולמקם אותם בתוך תא נוזל AFM. לכן, שימוש בתא נוזל סגור בהיקף כולל של כ 1.5 מיליליטר. לשמור על הטמפרטורה של נוזל תא הקבוע על 30 מעלות צלזיוס.
    3. השתמש בשלוחה עם תדר תהודה של ≈ 25 קילוהרץ במים ונוקשות של <0.1 N / m. התאם את מהירות הסריקה בין 2.5 ו -10 מיקרומטר / sec.
      4. 76.
      הערה: תמונות גובה מוצגות עם z בקנה מידה תוך Z-ערכים מייצגים את הטופוגרפיה של פני השטח המדויקת. משרעת תמונות (פסאודו 3D) מוצגות ללא z בקנה המידה כי Z-ערכי המשרעת תלויות בפרמטרי סריקה ונושאות מידע מוגבל. ניתוח של תמונות נעשה באמצעות שלוש תוכנת הערכה שונה של 77.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

טיפוח של מיקרואורגניזמים וSlp1 אפיון

הנתונים שנרשמו צמיחת חיידקים מציין את סוף שלב הצמיחה המעריכית בסביבות 5 שעות. חקירות קודמות הראו כי Slp1 יכול להיות מבודדת מנקודה זו של קציר (4.36 גר '/ ביומסה הרטובה L (≈ 1.45 L / g (BDW)) עם תשואה מרבי 19. אף על פי כן, אופטימיזציה של טיפוח באמצעות רכיבי תקשורת מוגדרים או סעד אסטרטגיות טיפוח אצווה תוביל לתשואות גבוהות יותר ביומסה. זה צאן ברזל לשימוש בכמות גבוהה של ביומסה עבור יישומים תעשייתיים. הערכים מהאינטרנט ופרמטרי טיפוח נרשמו מחובר מסוכמים באיור 3 א. שליטה מיקרוסקופית (איור 3) בזמן של תאים שאינם התנבג מופע קציר של ל 'sphaericus JG-B53.

לשמור-together.within עמודים = "1"> איור 3
פרמטרים טיפוח () נמדד מקוון ולא מקוון של ל ': איור 3 תמונה מיקרוסקופית sphaericus JG-B53 ו- (ב) של תאי חיידקים חיוניים של ל ' sphaericus JG-B53 בזמן הקציר בהגדלה של פי 400; נתון זה שונה מזור, מ 'ואח'. (2014) 19 באישור שפרינגר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כמו כן, פרופיל בנוסף עשה חלבון SDS-PAGE (איור 4 א) מציין את הסכום המקסימאלי של Slp1 בזמן של 5 שעות של טיפוח. להקת החלבון המתאימה לSlp1 (≈ 150 KDA) הוא עבה יותר, אבל מכאן והלאה הפסד בעוצמת נצפתה accompanמטען על ידי עלייה בחלבונים עם משקל מולקולרי נמוך הנגרם על ידי פיצול חלבון אפשרי או הפרדה של חלבונים אחרים. הלהקות של חלבונים מבודדים ומטוהרים שהושגו על ידי השיטה שהוזכר לעיל (איור 4) מתאימות למשקל מולקולרי של כ 150 kDa, שהוא כבד יותר מהמשקל מחושב על בסיס נתונים רצף של Slp1 (116 KDA) 30. זה כנראה בשל שינויי posttranslational. סיבות נוספות לחוסר ההתאמה בין מסה מולקולרית התיאורטית והמסה המולקולרית נצפתה בג'לי SDS הם אולי לחייב חפצים תלויים בג'ל SDS 30.

איור 4
4. פרופילי חלבון איור שנעשו על ידי SDS-PAGE של () התפרקו חיידקי תאים המתקבלים מדגימות טיפוח ו( ב) מטוהר Slp1 לאחר בידוד מוצלח; fi זהדמות שונה מזור, מ 'ואח'. (2014) 19 באישור שפרינגר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ניסויים אצווה-ספיחה וקביעת Au עם ICP-MS

היכולות המחייבות המרבית המתכת (מקסימום q) של Au (III) על ידי Slp1 המושעה מוצגות באיור 5. התוצאות מראות כי Au (III) היה קשורה ביציבות על ידי Slp1 במהלך הדגירה 24 שעות בטווח pH נחקר. תוצאות מצביעות על מקסימום q בטווח של כ 80 - 100 מ"ג Au (III) / g Slp1. הערכים סיכמו (טבלת 1) בהשוואה ליכולת הספיחה של כ 75 מ"ג Au (III) / g Slp1 שדווח בעבר על ידי זור, מ 'ואח'. (2014) המתקבלים מניסויים עם כוונון עצמיpH-ערכים על ידי תוספת של תמיסת מלח מתכת (4.3 pH ≈) 19. לסיכום, Slp1 הוכיח את היכולת לרתק כמויות גבוהות של Au (III) בתחילה הוסיף להוכיח היכולות גבוהות שלה מחייבות לרכיב זה.

איור 5
איור 5. תרשים מרבי מתכת כריכת נפחים (מקסימום q) של Au (III) לפולימרי Slp1 בתוך ניסויים מותאמים pH בהשוואה לתוצאות ספיחה באמצעות pH-ערכים מותאמים עצמיים (≈ 4.3) דווחו על ידי זור, מ 'ואח'. (2014) 19. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

יעילות הסרת מתכת מחושבת (RE) בטווח pH נחקר היו בין 50 - 60% ובכך אישרו מחדשיש תוצאות שנעשו על ידי זור, מ 'ואח'. (2014) שבו ערכים של כ -40% הושגו. בניסויים שנעשו בעבר, אינטראקציות חזקות של Au (III) עם הקבוצות הפונקציונליות למשל, וקבוצות carboxylic-, hydroxyl-, אמין, נצפתה לחלבונים S-שכבה כמו Slp1 ולחלבון ההשוואתי SlfB של ל ' sphaericus JG-A12 1,78. ינקובסקי, אל ע 'ואח. (2010) זוהה spectroscopically אינטראקציה חזקה של Au (III) בעיקר עם קבוצות קרבוקסיליות של SlfB שגם יכולים להיות מוסק לSlp1 של ל ' sphaericus JG-B53 20,79,80. כמו כן, תכונות חלבון פנימיות שיפחיתו Au (III) לAu (0) בהעדר סוכני הפחתה יכולות להיות סיבה לאינטראקציה החזקה 79. יתר על כן, תוצאות מחקר זה מראות הנטייה של מועדף מחייב של Slp1 בערכי pH נמוכים יותר. מצד השני, מחייב בערכי pH נמוכים גם יכול להוביל לdenaturation של Slp1. המחקרים הוכיחו Slp1 יציבות חלבון עד pH =3.0 (תוצאות לא פורסמו). מניסויי desorption בתנאים חומציים, באמצעות למשל, חומצה חנקתית או באמצעות סוכני complexing כמו EDTA או ציטרט (מידע לא מוצג), מוודא שזהב היה קשור ביציבות ולא יכל להשתחרר מפולימרי Slp1.

Au (III) על Slp1 של ל 'sphaericus JG-B53
ג ראשוני (מ"ג / ליטר) 196.97
pH 5 4.5 4.3 ≈ 23 4 3.5 3 2.5 2
עֵרֶך
מקסימום q 88.3 85.3 74.7 102.5 94.1 81 101.9 96.9
(מ"ג Au (III) / g Slp1)
מִחָדָשׁ 47.1 47.8 37.9 57.1 54.1 44.8 58.7 56.5
(%)

טבלה 1: מרבי מתכת כריכת נפחים (מקסימום q) ויעילות להסרת מתכת (RE) של ניסויים אצווה-ספיחה עם Au (III) ופולימרים Slp1 בפתרון נותח על ידי ICP-MS. נתוני השוואה לתוצאות שפורסמו בעבר מזור, מ 'ואח'. (2014) 19.

Slp1 חד שכבתי Recrystallization מעקב על ידי QCM-D

הירידה המיידית בתדירות (5 Δf, 7 Δf, 9 Δf, 11 Δf) מצביעה על ספיחה מהירה וזיקה גבוהה של החלבונים על פני השטח שונה PE (איור 6 א). שווה לשינוי המהיר בתדירות, הפיזור (ΔD 5, 7 ΔD, 9 ΔD, 11 ΔD) גם מגדיל באופן מיידי. עובדה זו מצביעה על ספיחה של מולקולות viscoelastic אל פני השטח בגלל דעיכת מהירה וכתוצאה מכך הגדלת ערכי פיזור. שינוי התדר המרבי מושגת לאחר 5 דקות עם ערך של 95 הרץ ו≈ ΔD של 4.2. בשלב מאוחר יותר רק ארגון מחדש של Slp1 recrystallized להתרחש. ספיחת Slp1 בוצעה thusly במשך 60 דקות כדי להבטיח tהוא היווצרות של פני השטח כמעט מכוסה במלוא וסריג חלבון הורה באופן קבוע. הניסוי מראה כי שכבת PE הטעונה חיובי היא צאן ברזל להשגת ציפוי יציב, שינוי סיום שלילי מוביל לספיחה חלשה וקינטיקה ציפוי ארוכה יותר (מידע לא מוצג) 38. חולשה מצורף חלבונים וagglomerates הוסר על ידי שטיפה עם חיץ recrystallization Slp1-חינם. השינויים הקטנים של Δf n לאשר את desorption החלבון הנמוך וספיחה יציבה של Slp1. למרות זאת הפיזור יורד למטה כדי ≈ 2.8 מצביע על כך שמולקולות גדולות יותר אלסטי יוסרו.

איור 6
איור 6. Recrystallization של Slp1 על SiO 2 חיישנים שונה נותחו על ידי QCM-D; (א) ב/ עלילה וΔD Profil עובי משטח (B) Δfדואר; נתון זה שונה מזור, מ 'ואח'. (2014) 19 באישור שפרינגר וזור, מ '(2015) 20. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

פרופיל המשטח מחושב על ידי שימוש במודלים שהוזכרו קודם להראות עובי monolayer Slp1 של ≈ 11.2 ננומטר (מודל קלווין-Voigt לסרטים אלסטיים) ושל 10.0 ננומטר (מודל Sauerbrey לשכבה נוקשה) (איור 6). ערכים אלה הם נמוכים יותר מאלה שדווח על ידי זור, מ 'ואח'. (2014). ניתן להסביר את ההבדלים בשווי שימוש שונה של צפיפות שכבת חלבון בתוך הדוגמנות. הערכים הנוכחיים צריכים להיות קרובים יותר למציאות של עובי שכבה של חלבוני S-שכבה על פני התא של תאי חיים של ל ' sphaericus JG-B53 31,42. דוגמנות זה מוכיחה כי ביחס Sauerbrey אניזה לא מתאים לשכבה דקה חלבוניים אקוסטי, בגלל התפשטות של גל אקוסטי גזירה בסרטי נוזל viscoelastic 81,82 כי תוצאות בהערכה נמוכה מדי של מסת Slp1 adsorbed והעובי. זה יכול להיות מוסבר על ידי תכונות אלסטיות של חלבוני S-שכבה והצימוד של מולקולות מים בתהליך הספיחה. האינטראקציה של מים עם חלבונים ניתן לתאר בקלות על ידי היווצרות של פגזי לחות, גרירה צמיגה או הילכדות בחללים בשכבת adsorbed 83. זה משפיע עובי שכבה גבוה שנמדד על ידי מודל קלווין-Voigt וגם יכול להבהיר את ההבדלים בעובי השכבה שהושג על ידי שני דגמים שונים. במחקרים קודמים AFM, עובי שכבה של סריגי Slp1 של כ 8-12 ננומטר נמדד. על ידי חישוב ספיחת המסה של Slp1, במקום עובי שכבה, Δm כולל של 1,506.6 ng ∙ סנטימטר -2 (מודל קלווין-Voigt) חושב. נתונים של ספיחת מסה על גלישה האסים מסוכמים בטבלה 2 ולהראות ספיחת מסה גבוהה על ידי שימוש בערכים של מודל קלווין-Voigt.

מקס מ ' Δm מקסימום עוֹבִי עוֹבִי
(Ng / 2 סנטימטר) (Ng / 2 סנטימטר) (ננומטר) (ננומטר)
(קלווין-Voigt) (Sauerbrey) (קלווין-Voigt) (Sauerbrey)
Slp1 לאחר ציפוי ושטיפה 1,505.6 1,351.6 11.2 10

FO: לשמור-together.within עמודים = "1"> טבלה 2: Mass adsorbed של Slp1 על polyelectrolyte SiO 2 קריסטלים שונה נותחו על ידי QCM-D לאחר שטיפה עם Recrystallization הצפת (pH = 8.0) ועובי שכבה מחושב.

QCM-D ככלי לאיתור של אינטראקציה המתכת ומתכת NP עם חלבוניים Slp1 חד שכבתי

האינטראקציה של monolayer Slp1 recrystallized עם 1 מ"מ ו -5 מ"מ Au (III) המומס נחקרה. התוצאות של מסת adsorbed הכוללת המתקבלת מחישובים ומודלים של נתונים שנרשמו על שינויים בתדירות ובפיזור מסוכמות בטבלה 3. מחקרי QCM-D של Au (III) אינטראקציה עם monolayers לספק הבנה עמוקה יותר של המתכת-biomolecule אינטראקציה. בפעם הראשונה, את היכולת מחייבת, קינטיקה וספיחה, ואיך metal משפיע על יציבות החלבון נחקרו בננו-טווח. לאחר התוספת של תמיסת מלח המתכת לmonolayer Slp1 התדירות ירדה בתוך 5 דקות הראשונות שמעידה על ספיחה המונית מהירה. עם זאת, הספיחה של Au לא הושלמה לאחר 60 דקות כפי שתואר למתכות אחרות כמו Pd (II) במחקרים קודמים 19. העלייה ההמונית מתרחשת עד 18 שעות. לאחר פרק זמן זה, צעדי שטיפה בוצעו עם חיץ חופשי מתכת מראה כי מתכת adsorbed כרוכה כמעט ביציבות לשכבת Slp1 recrystallized. לבסוף, קליטת מתכת כוללת של 955.0 ± 2.7 ng ∙ סנטימטר -2 (מודל קלווין-Voigt) הושגה במקרה של (III) פתרון 1 מ"מ Au ו4,534.4 ± 5.5 ng ∙ סנטימטר -2 (מודל קלווין-Voigt) ב מקרה של 5 מ"מ Au (III). הערכים גבוהים יותר מתקבלים על ידי 5 פתרונות מ"מ Au (III) יכולים להיות מוסברים על ידי מאפייני הפחתה מהותיים של Slp1 בי מתכתי הקטן ביותר Au (0) -NP נוצרו מהפתרון הזה. אלה הפחתה ראויהקשרים של Slp1 כבר דווחו במחקרים קודמים לPd (II) וAu (III) 32,33,79,84. הנתונים הראו גם כי האינטראקציה עם פתרון הזהב אינה מובילה לערעור יציבות בשכבות החלבון. זה מצביע ספציפי ויציב מחייב של Au (III) לSlp1, שאושר גם על ידי מדידות ICP-MS באמצעות פולימרים חלבון.

ההיווצרות של Au (0) -NP במהלך הסינתזה יכולה להיות דמיין ידי שינוי צבע מהפתרון הצהוב מתחיל אחד אדמדם. שינוי צבע זה נגרם על ידי העירור של תנודות plasmon פני השטח של חלקיקים מתכתיים ומוכיח ההיווצרות של Au (0) -NPs 1,78. יתר על כן צירופים וקטנים יותר יכולים להיות מסונתז על ידי הווריאציה של הריכוז של סוכן צמצום (ריכוז חומצה טאני גבוה יותר) 85 גלוי בצביעה של פתרון שונה ומאומת על ידי תוצאות של מדידות PCS (מידע לא מוצג). במצד שני, הגדלת ריכוז חומצה טאני מוביל לאובדן יציבות NP וצירופים ונוטים מצבר 20. כהוכחה לעיקרון, Au מסונתז מראש (0) (התפלגות גודל של 10-18 ננומטר נמדדה על ידי PCS ראה באיור 7 א) -NPs הודגרו עם Slp1 המושעה במשך 48 שעות ונותח על ידי SDS-עמוד. פרופיל החלבון שמוצג באיור 7 ב מאמת את המסקנה מנתוני QCM-D, שAu (0) -NPs לא להפריע מבנה Slp1. להקות החלבון נצפו 150 kDa להוכיח את הנוכחות של Slp1 שלם.

איור 7
איור 7. (א) התפלגות גודל מספר משוקללת של Au-מסונתז מראש (0) -NPs נמדדה על ידי PCS ופרופיל חלבון SDS-PAGE של Slp1 (ב); מסלול 1: 2 מיקרוגרם Slp1 לפני Au (0) -NPs אינטראקציה ומסלול 2: אינקובטורים 1 מיקרוגרם פולימרים Slp1 בהשעיה לאחר 48 שעות tion עם Au מסונתז מראש (0) -NPs. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לאחר NP-הסינתזה והאפיון, ניסויי QCM-D בוצעו. הספיחה של מתכת-מסונתז מראש Au (0) -NPs מוצג exemplarily לניסויי QCM-D בחלקות Δf / ΔD (איור 8) ועובי ומסת פרופילים (איור 8 ב).

איור 8
ספיחה איור 8. של Au מסונתז טרום (0) -NPs על recrystallized Slp1 סריג נותח על ידי QCM-D, () ב/ עלילה וΔD משטח Δf (ב) שכבה ופרופיל המוני.blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

זה יכול להיות אישר כי QCM-D יכול לשמש כדי לזהות הספיחה של 10 - Au הכדורי ננומטר 18 (0) -NPs. לאחר תוספת של פתרון Au-NP חי (520 ננומטר = 1) מתקבל על ידי הסינתזה תיארה, התדירות יורדת, שהוא מדד ישיר לספיחה המונית שתוארה על ידי החיזוי של משוואת Sauerbrey (משוואת 1). הספיחה של Au (0) -NPs כמעט הושלמה בתוך פחות מ -60 דקות. לאחר הפרק זמן זה לא יותר צירופים והופקדו על החלק העליון של סריג Slp1, כך ניתן להניח כי כל האתרים או נקבוביות התגובה נכבשו על ידי Au (0) -NPs. הירידה שמוצגת בפיזור יכולה להיות קשורה להתקשות של סיבת סריג Slp1 על ידי האינטראקציה NP. הערכים בסך הכל ספיחת מסה מסוכמים בטבלה 3. אפילו שטיפה אינטנסיבית עם חיץ ציטראט NP-חופשי מובילה נייTher לdesorption של צירופים ולא לניתוק של monolayer Slp1. לכן, אינטראקציה יציבה וחזקה ניתן לחזות ל( 0) האינטראקציה -NP Au באותו הכבוד כמו עם Au (III).

מַתֶכֶת ג מתכת Δm מקסימום Δm מקסימום עוֹבִי עוֹבִי
(Ng / 2 סנטימטר) (Ng / 2 סנטימטר) (ננומטר) (ננומטר)
(קלווין-Voigt) (Sauerbrey) (קלווין-Voigt) (Sauerbrey)
אונג> Au (III) 1 מ"מ 955 932.6 --- ---
5 מ"מ 4,534.4 4,687.9 --- ---
Au (0) - --- 1,382.9 1,382.7 10.2 10.2
צירופים ו

טבלה 3: Mass adsorbed על recrystallized Slp1 סריג לאחר Au (III) אינטראקציה (pH = 6.0) וAu-NP ספיחה (pH = 4.7) נותח על ידי QCM-D וחישוב של עובי שכבה לאחר Au (0) -NP ציפוי. נתוני השוואה לתוצאות שפורסמו בעבר מזור, מ 'ואח'. (2014) 19.

AFM להדמיה של מבני קומפוזיטס ננומטר

class = "jove_content" FO: לשמור-together.within עמודים = "1"> מחקרי AFM לאחר לאחר ניסויי QCM-D בוצעו כדי להשיג מידע מבני של מכלולים עצמיים Slp1 לפני ואחרי האינטראקציה שלהם עם מתכות וצירופים. זה הכרחי כדי לתאם את ספיחת המסה המזוהות במהלך ניסויי QCM-D עם השלמות של ציפוי חלבון ומבני סריג החלבון מאפשרים הצהרות על יציבות שכבת חלבון. באיור 9, סריג החלבון של Slp1 recrystallized על חיישני PE שונה מוצג עם הסריג שלה הטיפוסי המרובע (P4) כתמונות משרעת. קבוע הסריג יכול להיקבע כ13-14 ננומטר, אשר ניתן להשוות תוצאות של ניסויים קודמים 30. עובי השכבה של 10 ננומטר ± 2.0 ננומטר שנמדד על ידי AFM אימת את עובי השכבה החזויה של מדידות QCM-D של 11.2 ≈ ננומטר (דוגמנות קלווין-Voigt). ההבדל הקטן בגובה פני השטח יכול להיות מוסבר על ידי העובדה שcalcul כושר ated QCM-D רואה את כל שטח החיישן בזמן המחקר AFM ברזולוציה הגבוהה מראה אזור חלקי בלבד. לאור זאת, חלבון agglomerates שצורפו למשטח החיישן נכלל בחישוב מסת adsorbed בהתאמה לעובי השכבה והוביל לעובי שכבה גבוה יותר שנקבע על ידי AFM.

איור 9
איור 9. AFM תמונה משרעת של recrystallized Slp1 סריג של ל ' sphaericus JG-B53 בגבישי QCM-D מייד לאחר ציפוי ושטיפה עם הצפת וגדלה של אזור המסומן; נתון זה שונה מזור, מ 'ואח'. (2014) 19 באישור שפרינגר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לשמור-together.within עמודים = "1"> לאחר Au (III) וAu (0) -NP אינטראקציה עם Slp1 ומדידות שבוצעה עם QCM-D, משטחי החיישן נחקרו על ידי AFM. איור 10 מציג את Slp1 שלם סריג לאחר דגירה עם Au פתרון (III). זה יכול להיות הראה כי לאחר הדגירה סריג החלבון נשאר שלם לחלוטין. זה מאשר את התוצאות מהניסויים QCM-D שחזו את היציבות של הציפוי. באיור 11 א 'וב' adsorbed מראש מסונתז Au (0) -NPs (גודל משתנה 10-18 ננומטר נקבע על ידי PCS) על סריג Slp1 מוצג. בשל גודל החלקיקים, Au (0) -NPs הם נספחים בנקבוביות Slp1 ולא פעל -symmetry P4 של Slp1. Au (0) -NPs הם סטטיסטיים מופץ על סריג חלבון. על ידי מדידת גודל חלקיקים בתמונות גובה AFM (מידע לא מוצג) בגודל של הצירופים והוא בטווח של 16-23 ננומטר ואפילו קטן יותר, כלומר בטווח של כ -10 19,20 ננומטר. Ver זהifies הגודל נקבע NP נמדד בעבר על ידי PCS (ניתן לראות באיור 8).

איור 10
איור 10. AFM תמונה משרעת של recrystallized ושלם Slp1 סריג על גבישי QCM-D חיישן לאחר הדגירה של 5 מ"מ Au (III) פתרון וגדלה של אזור המסומן; נתון זה שונה מזור, מ 'ואח'. (2014) 19 באישור שפרינגר וזור, מ '(2015) 20. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 11
איור 11. (א) AFM משרעת תמונה של Au adsorbed (0) -NPs על סריג Slp1 recrystallized על גבישי חיישן QCM-D (משמאל) ו- (ב) 3D משוחזר פרופיל פני השטח (מימין); נתון זה שונה מזור, מ '(2015) 20 באישור שפרינגר והרף, ג' ואח '. (2016) רף, ג 'ואח'. S-שכבת nanocomposites מבוסס עבור יישומים תעשייתיים הבמבוסס על החלבון מהונדס ננו. (עורכים Tijana ז גרוב ואיית'יבר ל Cortajarena) (Springer, 2016 (שהוגש)). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעבודה זו בחנה את הכריכה של Au לחלבוני S-שכבה נחקרה באמצעות שילוב של שיטות אנליטיות שונות. בפרט, מחייב Au הוא אטרקטיבי מאוד לא רק להתאוששות של Au ממי כרייה או פתרונות תהליך, אלא גם לבנייה של חומרים, למשל, משטחים חושיים. ללימודים של האינטראקציה Au (Au (III) וAu (0) -NPs) עם מושעה וrecrystallized monolayer של Slp1, היה לי החלבון להיות מבודד. לכן, מחקר זה הראה גידול המוצלח של זן חיידקי גרם חיובי ל sphaericus JG-B53 והבידוד של חלבון שכבת פני השטח Slp1. עם זאת, הטיפוח ובידוד חלבון יישארו מאתגרים וצריכים להיות מותאם. ייצור בקנה מידה גדול של חלבונים ביומסה ו- S-שכבה הוא תנאי מוקדם ליישום תעשייתי של שניהם, למשל, לייצור חומרי מסנן סלקטיבית מתכת. פוטנציאל היישום שלהם הוא undoubtedly גבוה להסרת מתכות רעילות או ההתאוששות של מתכות יקרות מומסים במי תהליך, שפכים, ניקוז ומים. יתר על כן, פוטנציאל הבקשה לS-שכבות הוא גדול עוד יותר בהתחשב בפוטנציאל נוסף שלהם בחומרים בהשראת יו אחרים, כגון חיישנים וזרזים.

הניסויים אצווה-הספיחה של פולימרים Slp1 מושעים מצויינים גבוהה ויציב מחייבים של Au (III) בתוך ה- pH הטווח חקר 2.0-5.0. וכך, את יעילות הסרת מתכת של עד 60% ניתן הייתה להשיג. התנהגות מחייבת מדהימה זה יכול להיות מוסבר על ידי אינטראקציה חזקה של Au (III) עם Slp1 כנראה מושרה באמצעות אינטראקציה של קבוצות קרבוקסיליות וקבוצות חנקן נושא על פני השטח של החלבון. טיעונים זה יכול להיות חיזוק על ידי חקירת FTIR וEXAFS של הזן דומה ל sphaericus JG-A12 32,79. כמו כן, נכסי צמצום מהותיים של Slp1 יכולים להסביר הגבוה RE של Au (III) על ידי reducing זה לnanoparticular Au (0). ניתן להניח כי S-שכבה, כמו ממשק הראשון של חיידקים לסביבה, צריכה להיות מעורבת בעיקר במתכת מחייבת. בטווח pH נחקר, המתכת הגבוהה ביותר מחייבת קיבולת עם 102.5 מ"ג Au (III) / g Slp1 הושגה ב- pH 4.0. קיבולת מחייב זה גבוה מהדיווח ליו-רכיבים אחרים, למשל, לקיר מבודד תא של Bacillus subtilis (71.5 מ"ג Au (III) / g) 86 או לביומסה של vulgaris כלורלה (98.5 מ"ג Au (III) / g) 8 .

ICP-MS משמש לקביעת מתכת הכבול על ידי הפולימרים Slp1 הוא שיטה מאוד רגישה ומאפשר זיהוי של הכמויות הקטנות ביותר של זהב במחקר זה. ICP-MS מציע יתרונות רבים לביצוע קביעות עקבות מתכת, למשל, מערכת טיפול קלה ומגבלות זיהוי נמוכות; במקרה של זהב עד 0.1-1 ppt. זה עושה בשיטה זו כלי תכליתי לחקירת תהליכי biosorptive בטווח ריכוז נמוךים. עם זאת, התוצאות בחקירה זו היו צברה עם פולימרים S-שכבה מושעה ולא ניתן להעביר בקלות לרשתות S-שכבת recrystallized על משטחים, ולכן תציג את ההגבלה של ICP-MS. לדוגמא, אין קשר ישיר של פולימרים חלבון מבודדים יכול להתבצע למבני S-שכבה אלה בתאי חיידקים חיוניים. בנוסף, מדידות ICP-MS אינן מאפשרות הקביעה הקינטית של ספיחת מתכת. לכן, יש צורך למצוא שיטות מתאימות יותר לחקירה של מתכת כריכה בסרטי חלבון משותק דקים.

במחקר הנוכחי, ניתוחי QCM-D יושמו כדי לזהות את ההיווצרות באתרו של סריגי S-שכבה על משטחים כמו גם בתצהיר של Au על החלבונים. לכן, QCM-D הוא שיטה חזקה ושחזור להכרה בתהליכי ספיחה והאינטראקציה מולקולה. בנוסף QCM-D הוא פשוט יחסית, חסכוני, ושיטה לא מזיקה לפקח יםuch תהליכים מקוון. יש שיטת היתרון כדי לזהות שינוי המוני עם רגישות מסה מרבי בנוזלים של ≈ 0.5 ng ∙ סנטימטר -2. זה מאפשר את האפשרות לזהות אפילו אינטראקציה חלשה, למשל, של חלבון עם מתכות מומסים או למדוד adsorptions בטווחי ריכוז נמוכים. החסרון של QCM-D הוא שזה לא שיטת הדמיה מבנה המאפשרת ההדמיה של למשל, חסימה חלבון. לכן, טכניקות אחרות יש צורך.

QCM-D ניתוח במחקר זה היה במעקב על ידי ההדמיה AFM. השילוב של שיטות אלה אפשר למחקר של קינטיקה הספיחה והשלכות של ספיחת Au לציפוי, ובכך להוכיח שהם כלים רב-תכליתיים לחקירת אינטראקציה מתכת של סרטים חלבוניים דקים. יתר על כן, זה היה מראה כי recrystallization אמין של חלבוני S-שכבה על תמיכה טכנית חיוני למחקרי אינטראקציה חלבון שלאחר מכן. שםקדמי, שינויים של המשטחים באמצעות promotors הידבקות הם עניין. היישום המתואר של פוליאלקטרוליטים (כלה בPES הטעון חיובי) כשכבת ביניים בין SiO 2 משטחים ולהוביל שכבת חלבון לשיטה משופרת לציפוי חלבון מהיר. ההשפעה החיובית של שכבת polyelectrolyte חיובי לחייב תוארה בעבר לדוגמה, חוסר תנועה של תאי חיידקים חיוניים של ל ' sphaericus JG-B53 31. היישום של PE-השכבות הציגו הוא הצעד החשוב והקריטי ביותר לגיבוש מחדש מוצלח ושחזור מאוחר יותר של חלבוני S-שכבה.

זה יכול להיות הוכיח כי לחקירה של שכבות דקיקות של Slp1, QCM-D הוא שיטה טובה כדי להראות ספיחת המסה המתאימה לגיבוש מחדש החלבון כמו סרטי monolayer בזמן אמת. זה גם יכול להיות שנצפה בעבר ולהרכבה מחדש של חלבון S-שכבת SbpA של ל ' sphaericus </ Em> CCM2177 47. באמצעות AFM ברזולוציה גבוהה לאחר ניתוח שינויים במבנה הסריג של המכלולים עצמיים החלבון ניתן דמיינו. מדידות AFM חשפו את הסימטריה P4 של Slp1 ולאשר את עובי שכבה במתכונת של Slp1 של כ -10 ננומטר. כמו כן, האינטראקציה הישירה של יונים של מתכות מומסים עם שכבת החלבון יכולה להיות במעקב על ידי QCM-D מוכיחה מחייב טוב של Au (III) על ידי שכבת החלבון הבסיסית. ההיווצרות האפשרית של Au הקטן (0) -NPs מAu פתרון (III) בתוך נקבוביות חלבון הנגרם על ידי מאפייני צמצום מהותיים של סריג Slp1 בתוך מדידות QCM-D לא זוהתה על ידי מדידות AFM שלאחר מכן. זה יכול להיות קשור לגבול הרזולוציה של AFM והניסיוני שהוקם במחקר זה. זה מראה את ההגבלה של טכניקה זו ואת הצורך בהדמיה ברזולוציה גבוהה למולקולות ביולוגיות בקנה המידה ננומטרי המשנה. עם זאת, יציבות גבוהה של שכבת Slp1 recrystallized יכולה להיות מוסק מהדואר המתקבל QCM-תוצאות ואושר על ידי חקירת AFM.

לסיכום, זה יכול להיות הראה כי יש לי הפולימרים Slp1 יכולות מחייבות גבוהה מתכת לזהב בתוך pH הטווח נחקר. יתר על כן, החקירה מגלה כי סריג Slp1 הוא יון מתכת מטריצה ​​טובה מחייב ולחוסר התנועה של חלקיקים מתכתיים. זה יכול להיות הראה כי לכל שיטה יש בשימוש במאמר זה את האפשרות לזהות אפילו אינטראקציות קטנות מתכת, או במקרה של AFM יכול לדמיין מבנים בטווח ננומטריים. אמנם, זה רק על ידי השילוב של שיטות אלה מוצגים, שאיפשר לשפר את הידע והבנה של החלבונים נחקרים ברמה מולקולרית.

בעיקר, QCM-D וAFM הם השיטות המועדפות של בחירה לחקירה עתידית של ספיחת monolayer החלבון והאינטראקציה שלהם עם מתכות ומולקולות פונקציונליות. על ידי שילוב של שתי השיטות הללו, זיהוי של מודעת חלבון S-שכבהתהליכי וספיחת הדמיה המשטח מספקת תובנה תהליכים מולקולריים שיוכלו להיות מועבר על מנת לשפר את הידע של חיידקי חיים ואינטראקציה עם סביבתם. מחקר זה הראה קטע של שיטות אפשריות מועילות לחלבון הבנה ואינטראקציה מתכת. טכניקות שימושיות נוספות שיכול לשפר את הידע של תהליכים כאלה בפירוט החל שיטות spectrometric וchromatographic מגוונות לספקטרוסקופיות חקירה של מולקולות ביולוגיות וצריכה להיכלל במחקרים עתידיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

העבודה הנוכחית מומנה בחלקה על ידי IGF-הפרויקט "S-המסננת" (490 ZBG / 1) ממומן על ידי BMWi וBMBF-פרויקט "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A). תודה מיוחדת לטוביאס ג 'גינטר לעזרה הרבה ערכו במהלך לימודי AFM ואריק V. ג'ונסטון לקריאת כתב היד כדובר אנגלית כשפה אם. יתר על כן, מחברו של מאמר זה מבקש להודות לאלין ריטר וסברינה Gurlit (ממכון לאקולוגית משאבים לסיוע במדידות ICP-MS), מניה פוגל, ננסי אונגר, קארן E. Viacava וביוטכנולוגיה הקבוצה של הלמהולץ-המכון פרייברג למשאבים וטכנולוגיה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
equiment and software
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System Applikon Biotechnology, Netherlands Z6X Including dO2, pH sensors of Applikon Biotechnology and BioXpert software V2
Noninvasive Biomass Monitor BugEye 2100 BugLab, Concord (CA), USA Z9X ---
Spectrometer Ultrospec 1000 Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain 80-2109-10 Company now GE Healthcare Life Sciences
MiniStar micro centrifuge VWR, Germany 521-2844 For centrifugation of cultivation samples
Research system microscope BX-61 Olympus Germany LLC, Germany 037006 Microscope in combination with imaging software
Cell^P (version 3.1) Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Germany --- together with microscope
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S Carr Centritech, Florida, USA 9010PLT For biomasse harvesting
T18 basic Ultra Turrax IKA Labortechnik, Germany 431-2601 For flagella removal and sample homogenization
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA 728411 Used within protein isolation
Mobile high shear fluid processor, M-110EH-30 Pilot Microfluidics, Massachusetts, USA M110EH30K Used for cell rupture
Alpha 1-4 LSC Freeze dryer Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Germany 102041 ---
UV-VIS spectrophotometry (NanoDrop 2000c) Thermo Fisher Scientific, USA 91-ND-2000C-L For determination of protein concentration
Mini-PROTEAN vertical electrophoresis chamber Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 165-3322 For SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000 Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 1708030 Used for imaging of SDS-PAGE gels
ICP-MS Elan 9000 PerkinElmer, Waltham (MA), USA N8120536 For determination of metal concentration
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Worcestershire United Kingdom ZEN3600 For determination of nanoparticle size
Q-Sense E4 device  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-E4 ordered via LOT quantum design (software included with E4 platform)
Q-Soft 401 (data recording) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
Q-Tools 3 (data evaluation and modelling) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
QCM-D flow modules QFM 401  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QFM401 ordered via LOT quantum design
QSX 303 SiO2 piezoelectric AT-cut quartz sensors Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QSX303 ordered via LOT quantum design
Ozone cleaning chamber Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA QS-ESA006 ordered via LOT quantum design
Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFM Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA MFP-3DBio AFM measurements and imaging software
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223 Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 Software WaveMetrics, Inc., USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
BioHeater Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA Bioheater Sample heater for AFM measurements
Biolever mini cantilever,  BL-AC40TS-C2 Olympus Germany LLC, Germany  BL-AC40TS-C2 Prefered cantilever for AFM measurements
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013) Nanotec Electronica S.L. , Spain freeware Software for AFM analysis
Name Company Catalog Number Comments
Detergents and other equiment
acidic acid, 100 %, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3738.5 Danger, flammable and corrosive liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Antifoam 204 Sigma-Aldrich Co. LLC. A6426 For foam suppression
bromophenol blue, sodium salt Sigma-Aldrich Co. LLC. B5525 ---
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3862.1 ---
Deoxyribonuclease II from porcine spleen Sigma-Aldrich Co. LLC. D4138 Typ IV , 2,000 - 6,000 Kunitz units/mg protein
Ethanol, 95% VWR, Germany 20827.467 Danger, flammable
glycerine, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3783.1 ---
Guanidine hydrochloride (GuHCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 0037.1 ---
Hellmanex III Hellma GmbH & Co. KG 9-307-011-4-507 ---
Hydrochloric acid (HCl) (37%) CARL ROTH GmbH+CO.KG 4625.2 Danger; Corrosive, used for pH adjustment
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich Co. LLC. L6876  Lyophilized powder, protein = 90 %, = 40,000 units/mg protein (Sigma) 
Magnetic stirrer with heating,  MR 3000K Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany 504.10100.00 Standard stirrer within experiment
NB-Media DM180 Mast Diagnostica GmbH 121800 ---
Nitric acid (HNO3) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN50.1 Danger; Oxidizing, Corrosing
PageRuler Unstained Protein Ladder ThermoScientific-Pierce 26614 ---
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS) Sigma-Aldrich Co. LLC. 243051 Average Mw ~70,000
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich Co. LLC. 408727 Warning; Harmful, Irritant, Dangerous for the environment; average Mw ~25,000
Potassium carbonate anhydrous (K2CO3) Sigma-Aldrich Co. LLC. 60108 Warning; Harmful
Ribonuclease A from bovine pancreas  Sigma-Aldrich Co. LLC. R5503 Type I-AS, 50 - 100 Kunitz units/mg protein 
Sodium azide (NaN3) Merck KGaA 106688 Danger; very toxic and Dangerous for the environment
Sodium chloride (NaCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3957.2 ---
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich Co. LLC. L-5750 Danger; toxic
Sodium hydroxide (NaOH) CARL ROTH GmbH+CO.KG 6771.1 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation and pH adjustment
Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000  CARL ROTH GmbH+CO.KG 1893.1 ---
Sulfuric acid (H2SO4) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN52.2 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation
Tannic acid (C76H52O46) Sigma-Aldrich Co. LLC. 16201 ---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 9090.2 ---
Triton X-100 CARL ROTH GmbH+CO.KG 3051.3 Warning; Harmful, Dangerous for the environment
VIVASPIN 500, 50,000 MWCO Ultrafiltration tubes Sartorius AG VS0132 ---
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich Co. LLC. M6250 Danger, toxic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merroun, M. L., Rossberg, A., Hennig, C., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. Spectroscopic characterization of gold nanoparticles formed by cells and S-layer protein of Bacillus sphaericus JG-A12. Mater. Sci. Eng. C. 27 (1), 188-192 (2007).
  2. Raff, J., Soltmann, U., Matys, S., Selenska-Pobell, S., Bottcher, H., Pompe, W. Biosorption of uranium and copper by biocers. Chem. Mat. 15 (1), 240-244 (2003).
  3. Sleytr, U. B., Schuster, B., Egelseer, E. M., Pum, D. S-Layers: Principles and Applications. FEMS Microbiol. Rev. , (2014).
  4. Pollmann, K., Raff, J., Merroun, M., Fahmy, K., Selenska-Pobell, S. Metal binding by bacteria from uranium mining waste piles and its technological applications. Biotechnol. Adv. 24 (1), 58-68 (2006).
  5. Raff, J., Selenska-Pobell, S. Toxic avengers. Nucl. Eng. Int. 51, 34-36 (2006).
  6. Tsuruta, T. Biosorption and recycling of gold using various microorganisms. J. Gen. Appl. Microbiol. 50 (4), 221-228 (2004).
  7. Sathishkumar, M., Mahadevan, A., Vijayaraghavan, K., Pavagadhi, S., Balasubramanian, R. Green Recovery of Gold through Biosorption, Biocrystallization, and Crystallization. Ind. Eng. Chem. Res. 49 (16), 7129-7135 (2010).
  8. Das, N. Recovery of precious metals through biosorption - A review. Hydrometallurgy. 103 (1-4), 180-189 (2010).
  9. Volesky, B. Biosorption and me. Water Res. 41 (18), 4017-4029 (2007).
  10. Vilar, V. J. P., Botelho, C. M. S., Boaventura, R. A. R. Environmental Friendly Technologies for Wastewater Treatment: Biosorption of Heavy Metals Using Low Cost Materials and Solar Photocatalysis. Security of Industrial Water Supply and Management.NATO Science for Peace and Security Series C-Environmental Security. Atimtay, T. A., Sikdar, S. K. , Springer. 159-173 (2010).
  11. Lovley, D. R., Lloyd, J. R. Microbes with a mettle for bioremediation. Nat. Biotechnol. 18 (6), 600-601 (2000).
  12. Schiewer, S., Volesky, B. Environmental Microbe-Metal Interactions. Lovely, D. R. , ASM Press. Washington. 329-362 (2000).
  13. Raff, J., Berger, S., Selenska-Pobell, S. Uranium binding by S-layer carrying isolates of the genus Bacillus. Annual Report 2006 Institute of Radiochemistry. , Forschungszentrum Rossendorf. Dresden. (2006).
  14. Srinath, T., Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Chromium (VI) biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria. Chemosphere. 48 (4), 427-435 (2002).
  15. Godlewska-Zylkiewicz, B. Biosorption of platinum and palladium for their separation/preconcentration prior to graphite furnace atomic absorption spectrometric determination. Spectroc. Acta Pt. B-Atom. Spectr. 58 (8), 1531-1540 (2003).
  16. Hosea, M., et al. Accumulation of elemental gold on the alga Chlorella-vulgaris. Inorg. Chim. A-Bioinor. 123 (3), 161-165 (1986).
  17. Vogel, M., et al. Biosorption of U(VI) by the green algae Chlorella vulgaris. in dependence of pH value and cell activity. Sci. Total Environ. 409 (2), 384-395 (2010).
  18. Creamer, N., Baxter-Plant, V., Henderson, J., Potter, M., Macaskie, L. Palladium and gold removal and recovery from precious metal solutions and electronic scrap leachates by Desulfovibrio desulfuricans. Biotechnol Lett. 28 (18), 1475-1484 (2006).
  19. Suhr, M., et al. Investigation of metal sorption behavior of Slp1 from Lysinibacillus sphaericus. JG-B53 - A combined study using QCM-D, ICP-MS and AFM. Biometals. 27 (6), 1337-1349 (2014).
  20. Suhr, M. Isolierung und Charakterisierung von Zellwandkomponenten der gram-positiven Bakterienstämme Lysinibacillus sphaericus JG-A12 und JG-B53 und deren Wechselwirkungen mit ausgewählten relevanten Metallen und Metalloiden. , Technische Universität Dresden. (2015).
  21. Spain, A., Alm, E. Implications of Microbial Heavy Metal Tolerance in the Environment. Reviews in Undergraduate Research. 2, Rice University . Houston. 1-6 (2003).
  22. Ledin, M. Accumulation of metals by microorganisms - processes and importance for soil systems. Earth-Sci. Rev. 51 (1-4), 1-31 (2000).
  23. Maruyama, T., et al. Proteins and Protein-Rich Biomass as Environmentally Friendly Adsorbents Selective for Precious Metal Ions. Environ. Sci. Technol. 41 (4), 1359-1364 (2007).
  24. Sara, M., Sleytr, U. B. S-layer proteins. J. Bacteriol. 182 (4), 859-868 (2000).
  25. Baranova, E., et al. SbsB structure and lattice reconstruction unveil Ca2+ triggered S-layer assembly. Nature. 487 (7405), 119-122 (2012).
  26. Teixeira, L. M., et al. Entropically Driven Self-Assembly of Lysinibacillus sphaericus S-Layer Proteins Analyzed Under Various Environmental Conditions. Macromol. Biosci. 10 (2), 147-155 (2010).
  27. Ahmed, I., Yokota, A., Yamazoe, A., Fujiwara, T. Proposal of Lysinibacillus boronitolerans gen. nov. sp. nov., and transfer of Bacillus fusiformis to Lysinibacillus fusiformis comb. nov. and Bacillus sphaericus to Lysinibacillus sphaericus comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57 (5), 1117-1125 (2007).
  28. Panak, P., et al. Bacteria from uranium mining waste pile: interactions with U(VI). J. Alloy. Compd. 271, 262-266 (1998).
  29. Selenska-Pobell, S., Kampf, G., Flemming, K., Radeva, G., Satchanska, G. Bacterial diversity in soil samples from two uranium waste piles as determined by rep-APD, RISA and 16S rDNA retrieval. Antonie Van Leeuwenhoek. 79 (2), 149-161 (2001).
  30. Lederer, F. L., et al. Identification of multiple putative S-layer genes partly expressed by Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Microbiology. 159 ( Pt 6), 1097-1108 (2013).
  31. Günther, T. J., Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Immobilization of microorganisms for AFM studies in liquids. RSC Advances. 4, 51156-51164 (2014).
  32. Fahmy, K., et al. Secondary Structure and Pd(II) Coordination in S-Layer Proteins from Bacillus sphaericus. Studied by Infrared and X-Ray Absorption Spectroscopy. Biophys. J. 91 (3), 996-1007 (2006).
  33. Pollmann, K., Merroun, M., Raff, J., Hennig, C., Selenska-Pobell, S. Manufacturing and characterization of Pd nanoparticles formed on immobilized bacterial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (1), 39-45 (2006).
  34. Corti, C., Holliday, R. Gold : science and applications. , CRC Press - Taylor&Francis Group. (2010).
  35. Daniel, M. C., Astruc, D. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology. Chem. Rev. 104 (1), 293-346 (2004).
  36. Tang, J., et al. Fabrication of Highly Ordered Gold Nanoparticle Arrays Templated by Crystalline Lattices of Bacterial S-Layer Protein. Chem. Phys. Chem. 9 (16), 2317-2320 (2008).
  37. Haruta, M. Size- and support-dependency in the catalysis of gold. Catal. Today. 36 (1), 153-166 (1997).
  38. Habibi, N., et al. Nanoengineered polymeric S-layers based capsules with targeting activity. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 88 (1), 366-372 (2011).
  39. Toca-Herrera, J. L., et al. Recrystallization of Bacterial S-Layers on Flat Polyelectrolyte Surfaces and Hollow Polyelectrolyte Capsules. Small. 1 (3), 339-348 (2005).
  40. Decher, G., Lehr, B., Lowack, K., Lvov, Y., Schmitt, J. New nanocomposite films for biosensors - Layer-by-Layer adsorbed films of polyelectrolytes, proteins or DNA. Biosens. Bioelectron. 9 (9-10), 677-684 (1994).
  41. Decher, G., Schmitt, J. Fine-tuning of the film thickness of ultrathin multilayer films composed of consecutively alternating layers of anionic and cationic polyelectrolytes. Progress in Colloid & Polymer Science. 89 Trends in Colloid and Interface Science VI, Dr Dietrich Steinkopff Verlag. (1992).
  42. Günther, T. J. S-Layer als Technologieplattform - Selbstorganisierende Proteine zur Herstellung funktionaler Beschichtungen. , Technische Universität Dresden. (2015).
  43. Delcea, M., et al. Thermal stability, mechanical properties and water content of bacterial protein layers recrystallized on polyelectrolyte multilayers. Soft Matter. 4 (7), 1414-1421 (2008).
  44. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of Protein Adsorption: Surface-Induced Conformational Changes. J. Am. Chem. Soc. 127 (22), 8168-8173 (2005).
  45. Zeng, R., Zhang, Y., Tu, M., Zhou, C. R., et al. Protein Adsorption Behaviors on PLLA Surface Studied by Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring (QCM-D). Materials Science Forum. 610-613, 1219-1223 (2009).
  46. Bonroy, K., et al. Realization and Characterization of Porous Gold for Increased Protein Coverage on Acoustic Sensors. Anal. Chem. 76 (15), 4299-4306 (2004).
  47. Pum, D., Toca-Herrera, J. L., Sleytr, U. B. S-layer protein self-assembly. Int. J. Mol. Sci. 14 (2), 2484-2501 (2013).
  48. Weinert, U., et al. S-layer proteins as an immobilization matrix for aptamers on different sensor surfaces. Eng. Life Sci. , (2015).
  49. Umeda, H., et al. Recovery and Concentration of Precious Metals from Strong Acidic Wastewater. Mater. Trans. 52 (7), 1462-1470 (2011).
  50. Engelhardt, H., Saxton, W. O., Baumeister, W. 3-Dimensional structure of the tetragonal surface-layer of Sporosarcina-urea. J. Bacteriol. 168 (1), 309-317 (1986).
  51. Sprott, G. D., Koval, S. F., Schnaitman, C. A. Methods for general and molecular bacteriology. , American Society for Microbiology. 72-103 (1994).
  52. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during Assembly of Head Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  53. Stoscheck, C. [6] Quantitation of protein. Methods in Enzymology. Deutscher, M. P. 182, Academic Press. 50-68 (1990).
  54. Sleytr, U. B., Messner, P., Pum, D. Analysis of Crystalline Bacterial Surface-Layers by Freeze-Etching Metal Shadowing, Negative Staining and Ultra-Thin Sectioning. Method Microbiol. 20, 29-60 (1988).
  55. PerkinElmer. ICP Mass Spectrometry - The 30-Min to ICP-MS. , PerkinElmer. USA. (2001).
  56. Mühlpfordt, H. The preparation of colloidal Gold Nanoparticles using tannic-acid as an additional reducing agent. Experientia. 38 (9), 1127-1128 (1982).
  57. Hayat, M. A. Colloidal Gold - Principles, Methods and Applications. , Academic Press. (1989).
  58. Amendola, V., Meneghetti, M. Size Evaluation of Gold Nanoparticles by UV−vis Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry C. 113 (11), 4277-4285 (2009).
  59. Schurtenberger, P., Newman, M. E. Characterization of biological and environmental particles using static and dynamic light scattering in Environmental Particles. Buffle, J., van Leeuwen, H. P. 2, Lewis Publishers. 37-115 (1993).
  60. Jain, R., et al. Extracellular Polymeric Substances Govern the Surface Charge of Biogenic Elemental Selenium Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 49 (3), 1713-1720 (2015).
  61. Harewood, K., Wolff, J. S. Rapid electrophoretic procedure for detection of SDS-released oncorna-viral RNA using polyacrylamide-agarose gels. Anal. Biochem. 55 (2), 573-581 (1973).
  62. Penfold, J., Staples, E., Tucker, I., Thomas, R. K. Adsorption of mixed anionic and nonionic surfactants at the hydrophilic silicon surface. Langmuir. 18 (15), 5755-5760 (2002).
  63. Krozer, A., Rodahl, M. X-ray photoemission spectroscopy study of UV/ozone oxidation of Au under ultrahigh vacuum conditions. J. Vac. Sci. Technol. A-Vac. Surf. Films. 15 (3), 1704-1709 (1997).
  64. Vig, J. R. UV ozone cleaning of surfaces. J. Vac. Sci. Technol. 3 (3), 1027-1034 (1985).
  65. Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift Fur Physik. 155 (2), 206-222 (1959).
  66. Q-Sense - Biolin Scientific. Introduction and QCM-D Theory - Q-Sense Basic Training. , (2006).
  67. Edvardsson, M., Rodahl, M., Kasemo, B., Höök, F. A dual-frequency QCM-D setup operating at elevated oscillation amplitudes. Anal. Chem. 77 (15), 4918-4926 (2005).
  68. Hovgaard, M. B., Dong, M. D., Otzen, D. E., Besenbacher, F. Quartz crystal microbalance studies of multilayer glucagon fibrillation at the solid-liquid interface. Biophys. J. 93 (6), 2162-2169 (2007).
  69. Liu, S. X., Kim, J. T. Application of Kelvin-Voigt Model in Quantifying Whey Protein Adsorption on Polyethersulfone Using QCM-D. Jala. 14 (4), 213-220 (2009).
  70. Reviakine, I., Rossetti, F. F., Morozov, A. N., Textor, M. Investigating the properties of supported vesicular layers on titanium dioxide by quartz crystal microbalance with dissipation measurements. J. Chem. Phys. 122 (20), (2005).
  71. Voinova, M. V., Rodahl, M., Jonson, M., Kasemo, B. Viscoelastic acoustic response of layered polymer films at fluid-solid interfaces: Continuum mechanics approach. Phys. Scr. 59 (5), 391-396 (1999).
  72. Fischer, H., Polikarpov, I., Craievich, A. F. Average protein density is a molecular-weight-dependent function. Protein Sci. 13 (10), 2825-2828 (2004).
  73. Schuster, B., Pum, D., Sleytr, U. B. S-layer stabilized lipid membranes (Review). Biointerphases. 3 (2), FA3-FA11 (2008).
  74. Malmström, J., Agheli, H., Kingshott, P., Sutherland, D. S. Viscoelastic Modeling of Highly Hydrated Laminin Layers at Homogeneous and Nanostructured Surfaces: Quantification of Protein Layer Properties Using QCM-D and SPR. Langmuir. 23 (19), 9760-9768 (2007).
  75. Vörös, J. The Density and Refractive Index of Adsorbing Protein Layers. Biophys. J. 87 (1), 553-561 (2004).
  76. Hillier, A. C., Bard, A. J. ac-mode atomic force microscope imaging in air and solutions with a thermally driven bimetallic cantilever probe. Rev. Sci. Instrum. 68 (5), 2082-2090 (1997).
  77. Horcas, I., et al. WSXM: A software for scanning probe microscopy and a tool for nanotechnology. Rev. Sci. Instrum. 78 (1), 013705 (2007).
  78. Merroun, M. L., Rossberg, A., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. XAS characterization of gold nanoclusters formed by cells and S-layer sheets of B. sphaericus JG-A12. Annual Report Forschungszentrum Rossendorf - Institute for Radiochemistry. , (2005).
  79. Jankowski, U., Merroun, M. L., Selenska-Pobell, S., Fahmy, K. S-Layer protein from Lysinibacillus sphaericus. JG-A12 as matrix for Au III sorption and Au-nanoparticle formation. Spectroscopy. 24 (1), 177-181 (2010).
  80. Selenska-Pobell, S., et al. Magnetic Au nanoparticles on archaeal S-Layer ghosts as templates. Nanomater. nanotechnol. 1 (2), 8-16 (2011).
  81. Caruso, F., Furlong, D. N., Kingshott, P. Characterization of ferritin adsorption onto gold. J. Colloid Interface Sci. 186 (1), 129-140 (1997).
  82. Ward, M. D., Buttry, D. A. In situ interfacial mass detection with piezoelectric transducers. Science. 249 (4972), 1000-1007 (1990).
  83. Höök, F., et al. Variations in coupled water, viscoelastic properties, and film thickness of a Mefp-1 protein film during adsorption and cross-linking: A quartz crystal microbalance with dissipation monitoring, ellipsometry, and surface plasmon resonance study. Anal. Chem. 73 (24), 5796-5804 (2001).
  84. Wahl, R. Reguläre bakterielle Zellhüllenproteine als biomolekulares Templat. , Technische Universität Dresden. (2003).
  85. Jennings, T., Strouse, G. Past, present, and future of gold nanoparticles in Bio-Applications of Nanoparticles. , Springer. 34-47 (2007).
  86. Beveridge, T., Fyfe, W. Metal fixation by bacterial cell walls. Can. J. Earth Sci. 22 (12), 1893-1898 (1985).

Tags

כימיה גיליון 107 Biosorption מתכות S-שכבה חיידקים חלקיקים QCM-D AFM ICP-MS זהב
Au-אינטראקציה של הפולימרים Slp1 וחד שכבתי מ<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS וAFM ככלים לbiomolecule-מתכת לימודים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K.… More

Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies. J. Vis. Exp. (107), e53572, doi:10.3791/53572 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter